專利名稱：一對鵝源性成分pcr檢測用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物物種和動物源性成分鑒定技術領域，具體涉及一種用于檢測鵝源性成分的檢測方法，尤其涉及一對用于檢測鵝細胞線粒體核苷酸序列的引物。
背景技術：
鑒別檢測畜、禽源性成分技術是肉食品和飼料出入境海關、貿易、檢驗檢疫中關鍵定性技術，涉及到肉食品加工業、畜牧養殖業、飼料業、檢驗檢疫部門及其相關管理部門等領域。但是對于鵝的品種鑒定，以及產品中是否含有鵝源性成分還無快速、準確、可靠的檢測方法。利用本發明引物進行的PCR擴增目的片段是線粒體DNA序列。線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質，是一個比較理想的用于物種鑒別檢測的靶基因序列，其主要原因是(1)在所有組織細胞中均含有大量的線粒體，可以獲得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物種間具有高度的變異性；每個動物細胞中存在許多拷貝的線粒體基因組，在采取相同體積的DNA樣品進行PCR檢測時，線粒體基因組的模板數大大高于細胞核基因組的模板數，這就大大提高了 PCR檢測的靈敏度。0)mtDNA主要以編碼序列構成，種內的異質基因很少。不同種類的動物線粒體基因組序列雖然高度同源，存在高度保守區域，但也存在一定的變異區域。

發明內容
本發明的目的在于提供一對檢測鵝源性成分的引物。以解決準確、快速、可靠的用 PCR技術鑒定鵝源性成分。本發明的目的可以通過采用以下技術方案來實現1.設計引物用于檢測鵝源性成分的引物是根據線粒體DNA中高度保守的D-Loop 區序列進行設計，具體引物序列如下上游引物F 5，-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，；下游引物R 5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。2.提取樣品DNA 采用氯仿抽提法或商業DNA提取試劑盒提取樣品DNA。3.采用步驟1設計的引物進行PCR擴增PCR反應體系為25yL，包括2. 5μ L 10 X PCRBuffer (含 Mg2+20mmol/L)，3 μ L dNTPs (2. 5mmol/L)，1 μ LTaq 酶 QU/ μ L)，上下游引物F/R各3 μ L (終濃度為1. 2 μ Μ)，DNA模板2 μ L，超純水補至25 μ L。可采用商業化的 PCR 反應母液。PCR 反應程序為預變性 94°C 5min ；然后 94°C 50sec, 65°C 40sec, 72°C 40sec 循環35次；72°C :3min。反應完成后在4°C下保存。4.電泳檢測PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。若動物產品和飼料中含有鵝源性成分，則在電泳圖304bp位置處出現擴增目的條帶。本發明的有益效果是，對活動物、食用性動物產品、非食用性動物產品、動物源性飼料及飼料添加劑等進行品種鑒定。利用本發明的引物采用PCR方法可以有效檢出動物產品和飼料中的鵝源性成分，并進行鑒別檢測，其擴增目的條帶長度為304bp，檢測最低限為 0. 01%。


圖1鵝引物特異性PCR檢測電泳中M.Marker 2000 ； 1.鵝、2.火雞、3.鴨、4.鵪鶉、5.鴿、6.鴕鳥、7.雞、8.馬、 9.牛、10.羊、11.豬、12.狗、13.驢、14.貓、15.魚；16.空白對照圖2鵝引物靈敏度PCR檢測電泳中 M :marker DL2000 ;1 :100% (鵝 DNA) ;2 :50% ;3 ；4 5% ；5 1% ；6 0. 1% ；7 0. 01% ；8 空白
具體實施例方式以下據所示最佳實施例對本發明作進一步詳述。應理解，實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。1.引物的設計根據NCBI中已經發表的鵝線粒體基因組序列(登錄號為 EU571957)在D-Loop區設計一對引物，序列如下上游引物F 5，-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，；
下游引物 R 5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。2.樣品總DNA的提取采用氯仿抽提法或商業DNA提取試劑盒，提取鵝、火雞、鴨、鵪鶉、鴕鳥、鴿、雞、馬、 牛、羊、豬、驢、狗、貓、魚的基因組DNA，提取的基因組DNA均經紫外分光光度計測定其純度和濃度。測定OD26tZOD28tl值均為1. 8左右，說明DNA純度較高符合PCR擴增要求。3.鵝源性成分PCR擴增利用步驟1設計的特異性引物，以鵝DNA等為模板進行PCR擴增。3. IPCR 反應體系為 25 μ L,包括 2. 5 μ L IOXPCR Buffer (含 Mg2+20mmol/L)，3 μ L dNTPs (2. 5mmol/L)，1 μ LTaq 酶(2U/ μ L)，上下游引物 F/R 各 3 μ L (終濃度為 1. 2 μ Μ), DNA 模板2 μ L，超純水補至25 μ L。可采用商業化的PCR反應母液。3. 2PCR 反應程序為預變性 94°C 5min ；然后 94°C 50sec，65°C 40sec，72°C 40sec 循環35次；72°C :3min。反應完成后在4°C下保存。4.電泳檢測PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。5.引物的特異性驗證利用所設計鑒別檢測鵝源性成分的特異性引物，分別以鵝、火雞、鴨、鵪鶉、鴕鳥、 鴿、雞、馬、牛、羊、豬、驢、狗、貓、魚的總DNA為模板，按上述3進行PCR反應，驗證引物的特異性。經電泳檢測，結果如圖1所示，1號樣品在304bp位置處出現目的擴增條帶，其它樣品沒有鵝源性成分DNA，則無目的擴增條帶，顯示上述引物有良好的特異性。6. PCR的靈敏度驗證將研磨成粉末的鵝肉骨粉樣品用魚肉粉末稀釋(100g/100g)，至鵝成分樣品含量分別為 100. 00,50. 00、10. 00、1. 00,0. 10,0. 01g/100g，提取 DNA，按上述 3 進行 PCR 反應，經電泳檢測結果如圖2。可知其檢測低限至少可達0.01%純鵝肉樣DNA濃度，該引物的靈敏度可達0.01%純鵝肉樣品。
權利要求
1. 一對用于檢測鵝源性成分的引物，其特征在于所述的引物序列包括 上游引物 F :5’ -GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，； 下游引物 R :5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。
全文摘要
本發明涉及動物物種和動物源性成分鑒定技術領域，具體涉及一種用于檢測鵝源性成分的檢測方法，尤其涉及一對用于檢測鵝細胞線粒體核苷酸序列的引物。本發明旨在鑒定飼料、食品等產品中是否含有鵝源性成分。通過設計特異性擴增引物，利用PCR技術檢測遺傳上相對獨立，沒有重復序列，生物個體內無組織特異性的線粒體DNA，建立了鵝源性成分PCR檢測方法，以達到快速準確檢測鑒定鵝源性成分的目的。
文檔編號C12Q1/68GK102337337SQ201110290480
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者劉建利, 盧體康, 呂建強, 宗卉, 曹琛福, 汪燕玲, 秦智鋒, 花群義, 陶虹 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心