專利名稱：一種能用同源重組來克隆的枯草芽孢桿菌整合載體的構建及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體是一種能用同源重組來克隆的在枯草芽孢桿菌中 整合表達外源DNA片段的載體的構建及其應用。
背景技術：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是非致病的，不產毒素和致熱致敏蛋白質，是 一種食品安全的菌種，被歸為食品級微生物范疇。而且枯草芽孢桿菌作為表達系統，具有以 下優點1具有很強的蛋白質分泌功能，不需要破碎細胞來提取蛋白質，只需要較簡單地處 理發酵上清液即可得到較純的目標蛋白質，目前已有多種外源蛋白在枯草芽孢桿菌中實現 了分泌表達。2沒有明顯的密碼子偏愛性，同時表達產物也不容易形成包函體。3發酵條件 簡單。因此，開發利用枯草芽孢桿菌作為表達系統具有深遠的意義。根據所采用載體的類 型不同，枯草芽孢桿菌表達模式可分為染色體整合表達和可復制載體表達兩種。在染色體 整合表達中外源基因在宿主中可保持較好的穩定性，而復制載體通常不穩定，一般需加抗 生素來維持。但是抗生素在食品及食品添加劑生產中是不能添加的。因此，枯草芽孢桿菌 染色體基因組整合型表達是食品藥品生產發展的一個趨勢。PMLK83是一個常用的整合載 體。它通過雙交換把外源基因置換枯草芽孢桿菌中的a -淀粉酶基因，利于整合的篩選。所 整合的基因能穩定的存在于枯草芽孢桿菌的基因組中。然而，PMLK83的多克隆位點只有5 個單一的，能用于克隆的限制性內切酶位點(Sal I,HindiII,BamH I，Spel和SacII)，而且 PMLK83是比較大的載體，長度達8. 8kb，這些給將外源基因克隆到pMLK83帶來一定的不便。重組克隆方法雖然簡單高效，卻一直未能廣泛使用。此技術是利用大腸桿菌自身 的同源重組機制，讓兩段DNA在菌體內發生重組。這兩段DNA —般一段是線性化的載體，另 一段是含有與線性化載體同源序列的DNA片斷。發生重組后，線性化的載體將形成一個閉 環的載體，從而能夠在大腸桿菌中復制。

發明內容
本發明的目的是提供一種能用同源重組來克隆外源基因或啟動子，從而在枯草芽 孢桿菌中整合表達的載體的構建及其應用。構建一個從PMLK83改造而來的新的整合載體， 利于將克隆在常用載體pucl8、pUcl9或puc57中的外源基因或啟動子通過同源重組的方法 克隆到這個整合載體，最終實現外源基因或啟動子在枯草芽孢桿菌中的整合表達。本發明解決上述技術問題的技術方案如下一種能用同源重組來克隆外源DNA的枯草芽孢桿菌整合載體PMLK83-BN，其序列 如下1 GTCGACGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACGGAT51 CCTTTTCTCC TTACGCATCT GTGCGGTATT TCACACCGCA TAGCGGTGGC101 GGCCGCTCTA GTTAAGGAGG TGATCTAGAA TTCATGGTCC GTCCTGTAGA
151AACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTC
201TGGATCGCGAAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTA
251CAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC
301CGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAG
351TCTTTATACCGAAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGAT
401GCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTGATGGA
451GCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTA
501TTGCCGGGAAAAGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAACTGAAC
551TGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGAC AAAACGGCAAGAA
601AAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCA
651GCGTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTG
701GTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACTGGCAGGT
751GGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGG
801TGGTTGCAACTGGACAAGGCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCG
851CACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGTCACAGC
901CAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGT
951CAGTGGCAGTGAAGGGCGAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTAC1001TTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCAAAGGATT
1051CGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGG
1101CCAACTCCTACCGTACCTCGCATTACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGAC
1151TGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCGG
1201CTTTAACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAG
1251AACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTA
1301CAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTGGT
1351GATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGG
1401AATATTTCGCGCCACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGT
1451CCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCAT
1501CAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATG
1551TCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTT
1601CTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGG
1651CGTGTATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTG
1701AAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTTGATCGC
1751GTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGAC
1801CTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTC
1851GCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACT
1901GGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGAATCAA
1951CAACTCTCCTGGCGCACCATCGTCGGCTACAGCCTCGGGAATTCGATGGT
2001CGAGATCAGGGAATGAGTTTATAAAATAAAAAAAGCACCTGAAAAGGTGT
2051CTTTTTTTGATGGTTTTGAACTTGTTCTTTCTTATCTTGATACATATAGA
40510089]41010090]41510091]42010092]42510093]43010094]43510095]44010096]44510097]45010098]45510099]46010100]46510101]47010102]47510103]48010104]48510105]49010106]49510107]50010108]50510109]51010110]51510111]52010112]52510113]53010114]53510115]54010116]54510117]55010118]55510119]56010120]56510121]57010122]57510123]58010124]58510125]59010126]5951
CTTCCTCCTT AAGACGAAAG TAATAATGGT GGAACCCCTA CATGAGACAA GTATGAGTAT TTTTGCCTTC TGCTGAAGAT ACAGCGGTAA ATGAGCACTT CGCCGGGCAA TGGTTGAGTA GTAAGAGAAT CAACTTACTT TGCACAACAT CTGAATGAAG AATGGCAACA CTTCCCGGCA CCACTTCTGC TGGAGCCGGT ATGGTAAGCC ACTATGGATG TAAGCATTGG ATTTAAAACT GATAATCTCA GTCAGACCCC TGCGCGTAAT GTTTGTTTGC CTTCAGCAGA TAGGCCACCA CTAATCCTGT CGGGTTGGAC GAACGGGGGG GAACTGAGAT AGGGAGAAAG AGCGCACGAG GTCGGGTTTC AGGGGGGCGG TCCTGGCCTT
TCAAACCGAT GGCCTCGTGA TTCTTAGACG TTTGTTTATT TAACCCTGAT TCAACATTTC CTGTTTTTGC CAGTTGGGTG GATCCTTGAG TTAAAGTTCT GAGCAACTCG CTCACCAGTC TATGCAGTGC CTGACAACGA GGGGGATCAT CCATACCAAA ACGTTGCGCA ACAATTAATA GCTCGGCCCT GAGCGTGGGT CTCCCGTATC AACGAAATAG TAACTGTCAG TCATTTTTAA TGACCAAAAT GTAGAAAAGA CTGCTGCTTG CGGATCAAGA GCGCAGATAC CTTCAAGAAC TACCAGTGGC TCAAGACGAT TTCGTGCACA ACCTACAGCG GCGGACAGGT GGAGCTTCCA GCCACCTCTG AGCCTATGGA TTGCTGGCCT
GTGAAGACTG TACGCCTATT TCAGGTGGCA TTTCTAAATA AAATGCTTCA CGTGTCGCCC TCACCCAGAA CACGAGTGGG AGTTTTCGCC GCTATGTGGC GTCGCCGCAT ACAGAAAAGC TGCCATAACC TCGGAGGACC GTAACTCGCC CGACGAGCGT AACTATTAAC GACTGGATGG TCCGGCTGGC CTCGCGGTAT GTAGTTATCT ACAGATCGCT ACCAAGTTTA TTTAAAAGGA CCCTTAACGT TCAAAGGATC CAAACAAAAA GCTACCAACT CAAATACTGT TCTGTAGCAC TGCTGCCAGT AGTTACCGGA CAGCCCAGCT TGAGCTATGA ATCCGGTAAG GGGGGAAACG ACTTGAGCGT AAAACGCCAG TTTGCTCACA
GAGAATTTTG TTTATAGGTT CTTTTCGGGG CATTCAAATA ATAATATTGA TTATTCCCTT ACGCTGGTGA TTACATCGAA CCGAAGAACG GCGGTATTAT ACACTATTCT ATCTTACGGA ATGAGTGATA GAAGGAGCTA TTGATCGTTG GACACCACGA TGGCGAACTA AGGCGGATAA TGGTTTATTG CATTGCAGCA ACACGACGGG GAGATAGGTG CTCATATATA TCTAGGTGAA GAGTTTTCGT TTCTTGAGAT AACCACCGCT CTTTTTCCGA CCTTCTAGTG CGCCTACATA GGCGATAAGT TAAGGCGCAG TGGAGCGAAC GAAAGCGCCA CGGCAGGGTC CCTGGTATCT CGATTTTTGT CAACGCGGCC TGTTCTTTCC
TTAATTCTTG AATGTCATGA AAATGTGCGC TGTATCCGCT AAAAGGAAGA TTTTGCGGCA AAGTAAAAGA CTGGATCTCA TTTTCCAATG CCCGTATTGA CAGAATGACT TGGCATGACA ACACTGCGGC ACCGCTTTTT GGAACCGGAG TGCCTGCAGC CTTACTCTAG AGTTGCAGGA CTGATAAATC CTGGGGCCAG GAGTCAGGCA CCTCACTGAT CTTTAGATTG GATCCTTTTT TCCACTGAGC CCTTTTTTTC ACCAGCGGTG AGGTAACTGG TAGCCGTAGT CCTCGCTCTG CGTGTCTTAC CGGTCGGGCT GACCTACACC CGCTTCCCGA GGAACAGGAG TTATAGTCCT GATGCTCGTC TTTTTACGGT TGCGTTATCC0127]60010128]60510129]61010130]61510131]62010132]62510133]63010134]63510135]64010136]64510137]65010138]65510139]66010140]66510141]67010142]67510143]68010144]68510145]69010146]69510147]70010148]70510149]71010150]71510151]72010152]72510153]73010154]73510155]74010156]74510157]75010158]75510159]76010160]76510161]77010162]77510163]78010164]78510165]7901
CCTGATTCTG TCGCCGCAGC AAGAGCGCCT CACCGCATAT AAGCCAGTAT CCGACACCCG CGGCATCCGC CAGAGGTTTT CTCATCAGCG CGTCCAGCTC AAGCGGGCCA CGTGTAAGGG AGAGGATGCT GAACGTTGTG AAAAATCACT TTCCACAGGG GTGCAGGGCG GAAGACCATT CGCTTCACGT CAACCCCGCC CACCCGTGGC TGGAGATGGC TTCACAGTTC TCCGTTAGCG CCATGCACCG CTACAATCCA GCCGTGACGA GAGCGATCCT GCATGGCCTG ATAATGGGGA AAATCCGCTC TCTTTTCTAC GCGCAAATGC TGTCTTTTTG AAACTTTTGC CATCATTGAT GGGAAGAGAA AATCAAAGCC AAAATCACTT
TGGATAACCG CGAACGACCG GATGCGGTAT GGTGCACTCT ACACTCCGCT CCAACACCCG TTACAGACAA CACCGTCATC TGGTCGTGAA GTTGAGTTTC TGTTAAGGGC GGATTTCTGT CACGATACGG AGGGTAAACA CAGGGTCAAT TAGCCAGCAG CTGACTTCCG CATGTTGTTG TCGCTCGCGT AGCCTAGCCG CAGGACCCAA GGACGCGATG TCCGCAAGAA AGGTGCCGCC CGACGCAACG TGCCAACCCG TCAGCGGTCC TGAAGCTGTC CAACGCGGGC AGGCCATCCA GCCATGACTT TAATTCAAGG AGACAATATC TTTGTGAAGT AAGAGAAAAG GGTTTCTTTC CCGCTTAAGC AGGCTGATTC TTGCGTTGGT
TATTACCGCC AGCGCAGCGA TTTCTCCTTA CAGTACAATC ATCGCTACGT CTGACGCGCC GCTGTGACCG ACCGAAACGC GCGATTCACA TCCAGAAGCG GGTTTTTTCC TCATGGGGGT GTTACTGATG ACTGGCGGTA GCCAGCGCTT CATCCTGCGA CGTTTCCAGA CTCAGGTCGC ATCGGTGATT GGTCCTCAAC CGCTGCCCGA GATATGTTCT TTGATTGGCT GGCTTCCATT CGGGGAGGCA TTCCATGTGC AATGATCGAA CCTGATGGTC ATCCCGATGC GCCTCGCGTC CACTAACGAT CGTGTCTCAC AGCATCCTTG ATTTCACATT TTTTGTCTGA GGTAAGTCCC CCGAGTCATT TGACCGGGCA TGTATCCGTG
TTTGAGTGAG GTCAGTGAGC CGCATCTGTG TGCTCTGATG GACTGGGTCA CTGACGGGCT TCTCCGGGAG GCGAGGCAGC GATGTCTGCC TTAATGTCTG TGTTTGGTCA AATGATACCG ATGAACATGC TGGATGCGGC CGTTAATACA TGCAGATCCG CTTTACGAAA AGACGTTTTG CATTCTGCTA GACAGGAGCA GATGCGCCGC GCCAAGGGTT CCAATTCTTG CAGGTCGAGG GACAAGGTAT TCGCCGAGGC GTTAGGCTGG GTCATCTACC CGCCGGAAGC GCGACTAAGA GCCTTTGAAA CAGGTTTTTG CAGGGTATGT TATATTGTGC TTTATGAACA GTCTAGCCTT ATATAAACCA CTTGGGCGCT TCCGCAGGCA
CTGATACCGC GAGGAAGCGG CGGTATTTCA CCGCATAGTT TGGCTGCGCC TGTCTGCTCC CTGCATGTGT TGCGGTAAAG TGTTCATCCG GCTTCTGATA CTGATGCCTC ATGAAACGAG CCGGTTACTG GGGACCAGAG GATGTAGGTG GAACATAATG CACGGAAACC CAGCAGCAGT ACCAGTAAGG CGATCATGCG GTGCGGCTGC GGTTTGCGCA GAGTGGTGAA TGGCCCGGCT AGGGCGGCGC GGCATAAATC TAAGAGCCGC TGCCTGGACA GAGAAGAATC AAATGCCGTC ATCTTCAAGT GTTTGCTCCG TTCTCTTTGA AACACTTCAC AAAAAGAAAC GCCCTCAATG TTTAGCACGT GCCATTATTA GCGTCAGCGT0166]7951GTAAATTCCGTCTGCATTTTTAGTCATTGGTTTTCCAGGCCAAGATCCGG0167]8001TCAATTCAATTACTCGGCTCCCATCATGTTTATAGATATAAGCATTTACC0168]8051TGGCTCCAATGATTCGGATTTTGATAGCCGATGGTTTTGGCCGACGCTGG0169]8101ATCTCTTTTAACAAAACTGTATTTCTCGGTCCTCGTTACACCATCACTGT0170]8151TCGTTCCTTTTAACATGATGGTGTATGTTTTGCCAAATTGGATCTCCTTT0171]8201TCCGATTGTGAATTGATCTCCATCCTTAAACGCCTGTCGTCTGGTCCATT0172]8251ATTGATTTGATAAACGGCTTTTGTTGTATTCGCATCTGCACGCAAGGTAA0173]8301TCGTCAGTTGATCATTGAAAGAATGTGTTACACCTGTTTTGTAATTCTCA0174]8351AGGAAAACATGAGGCGCTTTTGCAATATCATCAGGATAAAGCACAGCTAC0175]8401AGACCTGGCATTGATCGTGCCTGTCAGTTTACCATCGTTCACTTGAAATG0176]8451AACCCGCTCCAGCTTTATTGTCATACCTGCCATCAGGCAATTTTGTTGCC0177]8501GTATTGATAGAGACAGAGGATGAACCTGCATTTGCCAGCACAACGCCATG0178]8551TGAGCCGCGCTGATTCATAAATATCTGGTTGTTTCCATTCGGGTTCGAGA0179]8601GTTCCTCAGGCTGTCCAGCCATCACATTGTGAAATCTATTGACCGCAGTG0180]8651ATAGCCTGATCTTCAAATAAAGCACTCCCGCGATCGCCTATTTGGCTTTT0181]8701CCCCGGGAACCTCACACCATTTCCGCCTCCCTCAGGTCTGGAAAAGAAAA0182]8751GAGGCGTACTGCCTGAACGAGAAGCTATCACCGCCCAGCCTAAACGGATA0183]8801TCATCATCGCTCATCCAT上述的整合載體pMLK83-BN，是在枯草芽孢整合載體pMLK83中加入一個用于同源 重組的序列bn ；上述的序列bn 的序列如下TCGACGCCGATTC ATTAATGCAG CTGGCACGACAGGTTTCCCG ACGGATCC TTTTCTCCTT ACGCATCTGT GCGGTATTTC ACACCGCATA GC.此序列中間有一個 PMLK83-BN中單一的限制性內切酶BamH I酶切位點，酶切位點兩端分別與常用克隆載體 pucl8、pucl9或puc57上的一段序列同源。pMLK83-BN 的構建方法，1.人工合成兩段引物 Puc-Bm-L :TCGACGCCGATTC ATTAATGCAG CTGGCACGACAGGTTTCCCG ACGGATCC TTTTCTCCTT ACGCATCTGT GCGGTATTTC ACACCGCATA GC 和 Puc-BNl-R :TATGCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA GGATCCGTCGGGAAACCT GTCGTGCCAG CTGCATTAAT GAATCGGCG ；2.將上述兩段引物Puc-Bm-L和Puc-Bm-R退火形成雙鏈DNA，然后連接到用Sal I和SacII雙酶切后的pMLK83載體上，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞；pMLK83載體從 Bacillus Genetic Stock Center 獲得；3.篩選正確轉化子，得到pMLK83_BN。載體PMLK83-BN的在枯草芽孢桿菌中表達外源蛋白基因或測試啟動子的應用，其 特征在于，應用步驟如下1.將可表達的外源蛋白基因或啟動子克隆到原始或改造后的pucl8，pucl9, puc57等常用載體的多克隆位點；2.用Ndel和BsaXI酶切上述克隆好的載體(對于改造后pucl8，pucl9，puc57等 常用載體，則用其他相應的限制性內切酶)，膠提純含外源蛋白基因或啟動子的DNA片斷；
3.用BamH I酶切pMLK83_BN，然后與上述含外源蛋白基因或啟動子的DNA片斷混 合，直接轉化化學法制備的大腸桿菌感受態細胞；上述的大腸桿菌感受態細胞，最優為大腸桿菌KC8感受態細胞，其次依次為 BUN10，V324，MG1655U 以及 DH5a ；4.篩選陽性克隆，提取載體轉化枯草芽孢桿菌，篩選淀粉酶缺失菌株進行整合表 達。為配合pMLK83-BN載體的使用，可能需要對pucl8，pucl9, puc57等常用載體進行 改造。改造方式是在pucl8，pucl9，puc57的Nde I位點和/或BsaXI位點加入其他限制性 內切酶位點，如需表達的外源蛋白基因或啟動子中有Ndel和BsaXI位點，則將可表達的外 源蛋白基因或啟動子克隆到改造后pucl8，pucl9, puc57等常用載體上。本發明的優點是提供了一個將克隆在常用克隆載體pucl8，pucl9, puc57的DNA 片段轉移到一種枯草芽孢桿菌整合載體的方法。這種轉移方法避免了一般轉移方式所需的 連接克隆，方法簡單有效。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的描述。實施例1整合載體pMLK83-BN的構建1.合成兩段引物Puc-BN1-L :TCGACGCCGATTC ATTAATGCAG CTGGCACGACAGGTTTCCCG ACGGATCC TTTTCTCCTT ACGCATCTGT GCGGTATTTC ACACCGCATA GC和 Puc-BNl-R :TATGCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA GGATCCGTCGGGAAACCT GTCGTGCCAG CTGCATTAAT GAATCGGCG ；2.述兩段引物？11(-8附-1^和？11(3-8附-1 退火形成雙鏈0嫩，然后連接到用5311和 SacII雙酶切后的pMLK83載體上。轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞；3.篩選正確轉化子，得到pMLK83-BN。實施例2pucl9Not 的構建此實例改造pucl9載體構建pucl9Not，在pucl9載體的Ndel限制性內切酶位點加 入一個NotI限制性內切酶位點。此載體可用于克隆序列中包含Ndel限制性內切酶位點的 基因或啟動子。此載體的構建如下1.合成一個引物P1:GGAATTCCATATGGCGGCCGCCACCGCTATGCGGTGTGAAATACC ；2.通過引物 P1 和常用測序引物 M13R (-48) (AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)以 pucl9為模版，擴增得到大約330bp的DNA片斷。PCR的擴增條件是94°C 2min ；94°C 2min, 60°C 30s，72°C 25s, 20個循環；72°C 5min.然后將擴增得到的片斷用Ndel和Kpnl酶切，膠 回收大約270bp的DNA片斷，連接到Ndel和Kpnl雙酶切的pucl9載體上。轉化大腸桿菌 DH5 a感受態細胞；3.篩選正確轉化子，測序驗證得到pucl9Not。實施例3
應用pMLK83-BN載體測試P43啟動子在枯草芽孢桿菌中的基因啟動效果pMLK83-BN有一個0 -葡萄糖苷酸酶報告基因。當pMLK83_BN本身整合到枯草芽 孢桿菌中時，因為葡萄糖苷酸酶報告基因前面沒有啟動子，這個基因不，或者極少量的 表達。而當有啟動子置于這個葡萄糖苷酸酶報告基因之前時，可啟動葡萄糖苷酸 酶報告基因的表達。此方法可用于監測不同啟動子的啟動效果。下例用P43啟動子說明應 用pMLK83-BN載體測試啟動子在枯草芽孢桿菌中的基因啟動效果。1.將P43啟動子克隆到載體pucl9Not的多克隆位點設計上游弓丨物5，ATTGCTGGACGCTTATGGAC 3， 和下游引物 5‘CGGGATCCATTCCTCTCTTACCTATAAT 3，，在下述 lOOul PCR 反應體系中擴增得到大約 480bp DNA 片斷DNA 模板(枯草芽孢桿菌 1A751 總 DNA) lul (約 20ng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各為 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚 合酶 lul，添加 ddH20 至 100ul。PCR 反應程序94°C 5min ；94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s, 30 個循環；72°C lOmin ；4°C保存。PCR片段用限制性內切酶BamHl、HindHI進行雙酶切后膠 回收大約440bp DNA片斷，然后用T4連接酶連接到BamHl、HindHI雙酶切后的pucl9Not 載體上。轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞。經篩選鑒定獲得載體pucl9N-p43。2.用Not I, BsaX I雙酶切pucl9N_p43，分別膠回收大約900bp片斷。3.用 BamH I 酶切 pMLK83_BN 后，取 50ngDNA 片斷與 50ng 上述回收的 NotI，BsaX I雙酶切的pucl9N-p43片斷混勻，轉化用化學法制備的大腸桿菌KC8感受態細胞。為保證 PMLK83-BN被BamH I酶切徹底，50ng BamH I酶切pMLK83_BN后的DNA片斷直接轉化用化 學法制備的大腸桿菌KC8作為對照。篩選得到pMLK83-BN-p43.在pMLK83_BN被BamH I酶 切徹底的情況下，一般超過80%轉化出來的菌落為正確的轉化子。4.用pMLK83-BN-p43和pMLK83_BN分別轉化枯草芽孢桿菌，涂布到含20ng/ul新 霉素的LB平板中。從生長的菌落中挑一部分轉接到含可溶性淀粉的LB平板上，第二 天用碘液染色檢測透明圈法篩選a -淀粉酶缺失菌株，即為pMLK83-BN-p43或pMLK83_BN 通過雙交換整合到枯草芽孢桿菌中的菌株。分別從整合菌株中挑選單菌落，過夜LB液體培 養后測定葡萄糖苷酸酶酶活。經測定，過夜LB液體培養后pMLK83-BN-p43轉化菌株的 3 -葡萄糖苷酸酶酶活為120U，而pMLK83-BN轉化菌株的0 -葡萄糖苷酸酶酶活為0。(酶 活力測定按如下方式進行在0D595讀取過夜培養菌液的吸光度；取lml菌液離心收集菌體； 用0. 5ml冰冷的25mM Tris_Cl，pH7. 4溶液清洗菌體后，用0. 64ml Z緩沖液(60mM Na2HP04 ； 40mM NaH2P04 ； 10mM KCL ；ImM MgS04 ；50mM ^ -巰基乙醇。3 -巰基乙醇使用當天加入)溶 解菌體；加入0. 16ml 2. 5mg/ml在Z緩沖液中當天新鮮配置的溶菌酶溶液，激烈震蕩后，在 37°C中溫浴5min ；加入8ull0% Triton X100，短暫震蕩后，冰浴20min ；在30°C水浴中預熱 2-5min后，加入0. 2ml 4mg/ml p_硝基苯_D_葡萄糖苷酸，在37°C中溫浴，當反應液明顯 變黃后，加入0.4ml 1M Na2C03終止反應，記錄反應液變黃需要的時間；反應液離心5min后， 用由0.8ml Z緩沖液，0. 2ml4mg/ml p_硝基苯-0 _D_葡萄糖苷酸和0. 4ml妝20)3組成的溶 液為空白，在0D■讀取吸光度。酶活力定義為(1000X 0D42Q)/(反應時間(min)X 0D595))。實施例4應用pMLK83-BN載體在枯草芽孢桿菌中的整合表達a -乙酰乳酸脫羧酶1.將a-乙酰乳酸脫羧酶基因克隆到載體pucl9N-p43的多克隆位點根據Genbank中注釋的來源于Bacillus brevis的a -乙酰乳酸脫羧酶基因序列，設計上游引 物 5，CGGGATCCATGAAAAAAAATATCATCAC 3，和下游引物 5，GGAATTCAGCACCAATTACCAGGCAGA 3，。PCR反應體系 lOOul :DNA模板(Bacillus brevis 總 DNA) lul (約 lOOng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul, lOpmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各為 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HSDNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 lOOul。PCR 反應程序94°C 5min ；94°C 30s，55°C 30s, 72°C 2min，30個循環；72°C lOmin ；4°C保存。PCR片段和載體pucl9N_p43用限制性內切酶 BamHI和EcoRI進行雙酶切后用T4連接酶進行連接，轉化到大腸桿菌DH5 a中，經篩選鑒定 獲得重組載體pucl9N-p43-aldb.2.用 Not I，BsaXI 雙酶切 pucl9N-p43_aldb，分別膠回收大約 1. 8Kb 片斷。3.用 BamHI 酶切 pMLK83_BN 后，取 50ngDNA 片斷與 50ng 上述回收的 NotI，BsaXI 雙酶切的pucl9N-p43-aldb片斷混勻，轉化用化學法制備的大腸桿菌KC8感受態細胞。篩 選得到 pMLK83-BN-p43-aldb。4.用pMLK83-BN-p43-aldb轉化枯草芽孢桿菌，涂布到含20ng/ul新霉素的LB平 板中。從生長的菌落中挑一部分轉接到含可溶性淀粉的LB平板上，第二天用碘液染色 檢測透明圈法篩選a “淀粉酶缺失菌株，即為pMLK83-BN-p43-aldb通過雙交換整合到枯草 芽孢桿菌中的菌株。從整合菌株中挑選單菌落，過夜LB液體培養后測定測定a-乙酰乳酸 脫羧酶酶活。乙酰乳酸脫羧酶酶活的測定按國家標準GB 20713-2006進行。經測定，表 達的a “乙酰乳酸脫羧酶酶活為20u/ml左右。
權利要求
一種能用同源重組來克隆外源DNA的枯草芽孢桿菌整合載體pMLK83 BN，其序列如下1GTCGACGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACGGAT51 CCTTTTCTCC TTACGCATCT GTGCGGTATT TCACACCGCA TAGCGGTGGC101 GGCCGCTCTA GTTAAGGAGG TGATCTAGAA TTCATGGTCC GTCCTGTAGA151 AACCCCAACC CGTGAAATCA AAAAACTCGA CGGCCTGTGG GCATTCAGTC201 TGGATCGCGA AAACTGTGGA ATTGATCAGC GTTGGTGGGA AAGCGCGTTA251 CAAGAAAGCC GGGCAATTGC TGTGCCAGGC AGTTTTAACG ATCAGTTCGC301 CGATGCAGAT ATTCGTAATT ATGCGGGCAA CGTCTGGTAT CAGCGCGAAG351 TCTTTATACC GAAAGGTTGG GCAGGCCAGC GTATCGTGCT GCGTTTCGAT401 GCGGTCACTC ATTACGGCAA AGTGTGGGTC AATAATCAGG AAGTGATGGA451 GCATCAGGGC GGCTATACGC CATTTGAAGC CGATGTCACG CCGTATGTTA501 TTGCCGGGAA AAGTGTACGT ATCACCGTTT GTGTGAACAA CGAACTGAAC551 TGGCAGACTA TCCCGCCGGG AATGGTGATT ACCGACGAAA ACGGCAAGAA601 AAAGCAGTCT TACTTCCATG ATTTCTTTAA CTATGCCGGA ATCCATCGCA651 GCGTAATGCT CTACACCACG CCGAACACCT GGGTGGACGA TATCACCGTG701 GTGACGCATG TCGCGCAAGA CTGTAACCAC GCGTCTGTTG ACTGGCAGGT751 GGTGGCCAAT GGTGATGTCA GCGTTGAACT GCGTGATGCG GATCAACAGG801 TGGTTGCAAC TGGACAAGGC ACTAGCGGGA CTTTGCAAGT GGTGAATCCG851 CACCTCTGGC AACCGGGTGA AGGTTATCTC TATGAACTGT GCGTCACAGC901 CAAAAGCCAG ACAGAGTGTG ATATCTACCC GCTTCGCGTC GGCATCCGGT951 CAGTGGCAGT GAAGGGCGAA CAGTTCCTGA TTAACCACAA ACCGTTCTAC1001 TTTACTGGCT TTGGTCGTCA TGAAGATGCG GACTTGCGTG GCAAAGGATT1051 CGATAACGTG CTGATGGTGC ACGACCACGC ATTAATGGAC TGGATTGGGG1101 CCAACTCCTA CCGTACCTCG CATTACCCTT ACGCTGAAGA GATGCTCGAC1151 TGGGCAGATG AACATGGCAT CGTGGTGATT GATGAAACTG CTGCTGTCGG1201 CTTTAACCTC TCTTTAGGCA TTGGTTTCGA AGCGGGCAAC AAGCCGAAAG1251 AACTGTACAG CGAAGAGGCA GTCAACGGGG AAACTCAGCA AGCGCACTTA1301 CAGGCGATTA AAGAGCTGAT AGCGCGTGAC AAAAACCACC CAAGCGTGGT1351 GATGTGGAGT ATTGCCAACG AACCGGATAC CCGTCCGCAA GGTGCACGGG1401 AATATTTCGC GCCACTGGCG GAAGCAACGC GTAAACTCGA CCCGACGCGT1451 CCGATCACCT GCGTCAATGT AATGTTCTGC GACGCTCACA CCGATACCAT1501 CAGCGATCTC TTTGATGTGC TGTGCCTGAA CCGTTATTAC GGATGGTATG1551 TCCAAAGCGG CGATTTGGAA ACGGCAGAGA AGGTACTGGA AAAAGAACTT1601 CTGGCCTGGC AGGAGAAACT GCATCAGCCG ATTATCATCA CCGAATACGG1651 CGTGTATACG TTAGCCGGGC TGCACTCAAT GTACACCGAC ATGTGGAGTG1701 AAGAGTATCA GTGTGCATGG CTGGATATGT ATCACCGCGT CTTTGATCGC1751 GTCAGCGCCG TCGTCGGTGA ACAGGTATGG AATTTCGCCG ATTTTGCGAC1801 CTCGCAAGGC ATATTGCGCG TTGGCGGTAA CAAGAAAGGG ATCTTCACTC1851 GCGACCGCAA ACCGAAGTCG GCGGCTTTTC TGCTGCAAAA ACGCTGGACT1901 GGCATGAACT TCGGTGAAAA ACCGCAGCAG GGAGGCAAAC AATGAATCAA1951 CAACTCTCCT GGCGCACCAT CGTCGGCTAC AGCCTCGGGA ATTCGATGGT2001 CGAGATCAGG GAATGAGTTT ATAAAATAAA AAAAGCACCT GAAAAGGTGT2051 CTTTTTTTGA TGGTTTTGAA CTTGTTCTTT CTTATCTTGA TACATATAGA2101 AATAACGTCA TTTTTATTTT AGTTGCTGAA AGGTGCGTTG AAGTGTTGGT2151 ATGTATGTGT TTTAAAGTAT TGAAAACCCT TAAAATTGGT TGCACAGAAA2201 AACCCCATCT GTTAAAGTTA TAAGTGACTA AACAAATAAC TAAATAGATG2251 GGGGTTTCTT TTAATATTAT GTGTCCTAAT AGTAGCATTT ATTCAGATGA2301 AAAATCAAGG GTTTTAGTGG ACAAGACAAA AAGTGGAAAA GTGAGACCAT2351 GAGCTTATGC TTAGGAAGAC GAGTTATTAA TAGCTGAATA AGAACGGTGC2401 TCTCCAAATA TTCTTATTTA GAAAAGCAAA TCTAAAATTA TCTGAAAAGG2451 GAATGAGAAT AGTGAATGGA CCAATAATAA TGACTAGAGA AGAAAGAATG2501 AAGATTGTTC ATGAAATTAA GGAACGAATA TTGGATAAAT ATGGGGATGA2551 TGTTAAGGCT ATTGGTGTTT ATGGCTCTCT TGGTCGTCAG ACTGATGGGC2601 CCTATTCGGA TATTGAGATG ATGTGTGTCA TGTCAACAGA GGAAGCAGAG2651 TTCAGCCATG AATGGACAAC CGGTGAGTGG AAGGTGGAAG TGAATTTTGA2701 TAGCGAAGAG ATTCTACTAG ATTATGCATC TCAGGTGGAA TCAGATTGGC2751 CGCTTACACA TGGTCAATTT TTCTCTATTT TGCCGATTTA TGATTCAGGT2801 GGATACTTAG AGAAAGTGTA TCAAACTGCT AAATCGGTAG AAGCCCAAAC2851 GTTCCACGAT GCGATTTGTG CCCTTATCGT AGAAGAGCTG TTTGAATATG2901 CAGGCAAATG GCGTAATATT CGTGTGCAAG GACCGACAAC ATTTCTACCA2951 TCCTTGACTG TACAGGTAGC AATGGCAGGT GCCATGTTGA TTGGTCTGCA3001 TCATCGCATC TGTTATACGA CGAGCGCTTC GGTCTTAACT GAAGCAGTTA3051 AGCAATCAGA TCTTCCTTCA GGTTATGACC ATCTGTGCCA GTTCGTAATG3101 TCTGGTCAAC TTTCCGACTC TGAGAAACTT CTGGAATCGC TAGAGAATTT3151 CTGGAATGGG ATTCAGGAGT GGACAGAACG ACACGGATAT ATAGTGGATG3201 TGTCAAAACG CATACCATTT TGAACGATGA CCTCTAATAA TTGTTAATCA3251 TGTTGGTTAC GTATTTATTA ACTTCTCCTA GTATTAGTAA TTATCAGAAT3301 TGATCTGCGG CCGCGAATTA TCAAGCTCTG AGCGCCGGTC GCTACCATTA3351 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CATTGCAGCA CTGGGGCCAG5051 ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA5101 ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT GAGATAGGTG CCTCACTGAT5151 TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA CTTTAGATTG5201 ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT5251 GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC5301 GTCAGACCCC GTAGAAAAGA TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC5351 TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAAACAAAAA AACCACCGCT ACCAGCGGTG5401 GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT CTTTTTCCGA AGGTAACTGG5451 CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT CCTTCTAGTG TAGCCGTAGT5501 TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG5551 CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC5601 CGGGTTGGAC TCAAGACGAT AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT5651 GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC GACCTACACC5701 GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCTATGA GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA5751 AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC GGAACAGGAG5801 AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT5851 GTCGGGTTTC GCCACCTCTG 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CAGGGTCAAT GCCAGCGCTT CGTTAATACA GATGTAGGTG6751 TTCCACAGGG TAGCCAGCAG CATCCTGCGA TGCAGATCCG GAACATAATG6801 GTGCAGGGCG CTGACTTCCG CGTTTCCAGA CTTTACGAAA CACGGAAACC6851 GAAGACCATT CATGTTGTTG CTCAGGTCGC AGACGTTTTG CAGCAGCAGT6901 CGCTTCACGT TCGCTCGCGT ATCGGTGATT CATTCTGCTA ACCAGTAAGG6951 CAACCCCGCC AGCCTAGCCG GGTCCTCAAC GACAGGAGCA CGATCATGCG7001 CACCCGTGGC CAGGACCCAA CGCTGCCCGA GATGCGCCGC GTGCGGCTGC7051 TGGAGATGGC GGACGCGATG GATATGTTCT GCCAAGGGTT GGTTTGCGCA7101 TTCACAGTTC TCCGCAAGAA TTGATTGGCT CCAATTCTTG GAGTGGTGAA7151 TCCGTTAGCG AGGTGCCGCC GGCTTCCATT CAGGTCGAGG TGGCCCGGCT7201 CCATGCACCG CGACGCAACG CGGGGAGGCA GACAAGGTAT AGGGCGGCGC7251 CTACAATCCA TGCCAACCCG TTCCATGTGC TCGCCGAGGC GGCATAAATC7301 GCCGTGACGA TCAGCGGTCC AATGATCGAA GTTAGGCTGG TAAGAGCCGC7351 GAGCGATCCT TGAAGCTGTC CCTGATGGTC GTCATCTACC TGCCTGGACA7401 GCATGGCCTG CAACGCGGGC ATCCCGATGC CGCCGGAAGC GAGAAGAATC7451 ATAATGGGGA AGGCCATCCA GCCTCGCGTC GCGACTAAGA AAATGCCGTC7501 AAATCCGCTC GCCATGACTT CACTAACGAT GCCTTTGAAA ATCTTCAAGT7551 TCTTTTCTAC TAATTCAAGG CGTGTCTCAC CAGGTTTTTG GTTTGCTCCG7601 GCGCAAATGC AGACAATATC AGCATCCTTG CAGGGTATGT TTCTCTTTGA7651 TGTCTTTTTG TTTGTGAAGT ATTTCACATT TATATTGTGC AACACTTCAC7701 AAACTTTTGC AAGAGAAAAG TTTTGTCTGA TTTATGAACA AAAAAGAAAC7751 CATCATTGAT GGTTTCTTTC GGTAAGTCCC GTCTAGCCTT GCCCTCAATG7801 GGGAAGAGAA CCGCTTAAGC CCGAGTCATT ATATAAACCA TTTAGCACGT7851 AATCAAAGCC AGGCTGATTC TGACCGGGCA CTTGGGCGCT GCCATTATTA7901 AAAATCACTT TTGCGTTGGT TGTATCCGTG TCCGCAGGCA GCGTCAGCGT7951 GTAAATTCCG TCTGCATTTT TAGTCATTGG TTTTCCAGGC CAAGATCCGG8001 TCAATTCAAT TACTCGGCTC CCATCATGTT TATAGATATA AGCATTTACC8051 TGGCTCCAAT GATTCGGATT TTGATAGCCG ATGGTTTTGG CCGACGCTGG8101 ATCTCTTTTA ACAAAACTGT ATTTCTCGGT CCTCGTTACA CCATCACTGT8151 TCGTTCCTTT TAACATGATG GTGTATGTTT TGCCAAATTG GATCTCCTTT8201 TCCGATTGTG AATTGATCTC CATCCTTAAA CGCCTGTCGT CTGGTCCATT8251 ATTGATTTGA TAAACGGCTT TTGTTGTATT CGCATCTGCA CGCAAGGTAA8301 TCGTCAGTTG ATCATTGAAA GAATGTGTTA CACCTGTTTT GTAATTCTCA8351 AGGAAAACAT GAGGCGCTTT TGCAATATCA TCAGGATAAA GCACAGCTAC8401 AGACCTGGCA TTGATCGTGC CTGTCAGTTT ACCATCGTTC ACTTGAAATG8451 AACCCGCTCC AGCTTTATTG TCATACCTGC CATCAGGCAA TTTTGTTGCC8501 GTATTGATAG AGACAGAGGA TGAACCTGCA TTTGCCAGCA CAACGCCATG8551 TGAGCCGCGC TGATTCATAA ATATCTGGTT GTTTCCATTC GGGTTCGAGA8601 GTTCCTCAGG CTGTCCAGCC ATCACATTGT GAAATCTATT GACCGCAGTG8651 ATAGCCTGAT CTTCAAATAA AGCACTCCCG CGATCGCCTA TTTGGCTTTT8701 CCCCGGGAAC CTCACACCAT TTCCGCCTCC CTCAGGTCTG GAAAAGAAAA8751 GAGGCGTACT GCCTGAACGA GAAGCTATCA CCGCCCAGCC TAAACGGATA8801 TCATCATCGC TCATCCAT
2.根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌整合載體PMLK83-BN，其特征在于，在枯草芽孢 桿菌整合載體PMLK83中加入一個用于同源重組的序列bn ；上述的序列 bn 的序列如下TCGACGCCGATTC ATTAATGCAG CTGGCACGACAGGTTTCCCG ACGGATCC TTTTCTCCTT ACGCATCTGT GCGGTATTTC ACACCGCATA GC.此序列中間有一個單一的 限制性內切酶BamH I酶切位點，酶切位點兩端分別與常用克隆載體puc18、pucl9或puc57 上多克隆位點兩端的一段序列同源。
3.權利要求1或2所述的載體pMLK83-BN的構建方法，其特征步驟是1)人工合成兩段引物Puc-Bm-L:TCGACGCCGATTC ATTAATGCAG CTGGCACGACAGGTTTCCCG ACGGATCC TTTTCTCCTT ACGCATCTGT GCGGTATTTC ACACCGCATA GC和Puc-BNl-R :TATGCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA GGATCCGTCGGGAAACCT GTCGTGCCAG CTGCATTAAT GAATCGGCG ；2)將上述兩段引物Puc-Bm-L和Puc-Bm-R退火形成雙鏈DNA，然后連接到用Sail 和SacII雙酶切后的pMLK83載體上，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞；pMLK83載體從 Bacillus Genetic Stock Center 獲得；3)篩選正確轉化子，得到pMLK83-BN。
4.權利要求1或2所述的載體pMLK83-BN的在枯草芽孢桿菌中表達外源蛋白基因或測試啟動子的應用，其特征在于，應用步驟如下1)將可表達的外源蛋白基因或啟動子克隆到原始或改造后的pucl8，pucl9,puc57等 常用載體的多克隆位點；2)如果可表達的外源蛋白基因或啟動子克隆到原始puC18，pUC19，pUC57等常用載體， 用Ndel和BsaXI酶切上述克隆好的載體，膠提純含外源蛋白基因或啟動子的DNA片斷；如 果外源蛋白基因或啟動子克隆到改造后的pucl8，pucl9, puc57等常用載體，則用其他相應 的限制性內切酶酶切后，膠純化DNA片斷；3)用BamHI酶切pMLK83_BN，然后與上述含外源蛋白基因或啟動子的DNA片斷混合，直 接轉化化學法制備的大腸桿菌感受態細胞；上述的大腸桿菌感受態細胞，最優為大腸桿菌KC8感受態細胞，其次依次為BUN10， V324, MG1655U 以及 DH5 a ；4)篩選陽性克隆，提取載體轉化枯草芽孢桿菌，篩選淀粉酶缺失菌株進行整合表達。
5.權利要求4所述的改造后的pucl8，pucl9, puc57等常用載體，其特征是在pucl8，pucl9, puc57的Nde I位點和/或BsaXI位點加入其他限制性內切酶位點，如果可表達的 外源蛋白基因或啟動子中含有Nde I和/或BsaX I位點，則將可表達的外源蛋白基因或啟 動子克隆到改造后pucl8，pucl9, puc57等常用載體上。
全文摘要
本發明公開了一種能用同源重組來克隆的枯草芽孢桿菌整合載體的構建及其應用。一種能用同源重組來克隆外源DNA片斷的枯草芽孢桿菌整合載體的構建及其應用，屬于生物技術領域。這種載體pMLK-BN能夠將克隆在常用克隆載體puc18、puc19或puc57上的外源基因或啟動子通過同源重組的方法轉移到自身，從而能夠在枯草芽孢桿菌中整合表達外源蛋白，或者測試啟動子的啟動效果。同源重組的克隆方法與常用的連接克隆方法比較簡單高效，pMLK-BN能夠有效地作為克隆外源基因或啟動子到枯草芽孢桿菌中進行整合表達的一種載體的選擇。
文檔編號C12N15/75GK101948866SQ201010271750
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月3日 優先權日2010年9月3日
發明者廖東慶, 張云光, 李叢, 李曉明, 林珊宇, 梁蓮華, 蒙健宗, 陳發忠, 韋航 申請人:南寧邦爾克生物技術有限責任公司