專利名稱：一種特異性識別鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子的篩選及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用SELEX技術(指數富集的配體系統進化技木)篩選獲得一種與鼠傷寒沙門氏菌高親和力、高特異性識別的寡核苷酸適配子，以及該寡核苷酸適配子在鑒別沙門氏菌中的應用，屬生物技術領域。
背景技術：
鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium),屬腸桿菌科,革蘭氏陰性腸道桿菌。沙門氏菌病是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病之一。在我國內陸地區，由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位。據資料統計，在我國細菌性食物中毒中，70%-80%是由沙門氏菌引起，世界各地的食物中毒中，英國、中國沙門氏菌食物中毒居首位。目前，在全球范圍內，特別是發展中國家感染沙門氏菌的人數逐年增多，食源性致病菌的耐藥性對食品安全及人類健康的影響已經引起很多國家的 警惕。因此建立準確、靈敏、快速的沙門氏菌檢測技術對于食品安全具有重要意義。傳統的微生物檢驗，往往既耗時又不靈敏；新發展起來的PCR技木，雖然能縮短檢驗時間，但靈敏度仍然不高；免疫學方法具有特異性強、靈敏度高、易于觀察等優點，但制備抗體的時間比較長，成本高，且不穩定。近些年來，由于寡核苷酸適配子(aptamer)較之抗體有諸多優點成本低，穩定性好，易于修飾等等，因此被作為抗體分子的前景性替代分子，受到很多領域的關注。SELEX是ー種隨機生物文庫技術，它利用大容量的隨機寡核苷酸庫(由兩端的固定序列和中間20 40個堿基的隨機序列組成)與靶分子相互作用，從中篩選出與靶分子特異結合的寡核苷酸，并結合PCR體外擴增技木，使其得到指數級富集，如此循環數輪，最終進化成為高親和力、高特異性的寡核苷酸配體。適配子與靶物質結合的特異性和親和カ可與抗體媲美，甚至優于抗體，加上其技術上和穩定性方面的優勢，近10多年來，采用SELEX技術篩選核酸適配子不斷被應用于生命科學各個領域的研究工作中，包括對疾病的診斷與治療。本發明以常見的鼠傷寒沙門氏菌為目的靶細菌，利用SELEX技術獲得了一條能與鼠傷寒沙門氏菌高親和力，高特異性結合的寡核苷酸適配子，能夠快速、靈敏、特異的檢測到鼠傷寒沙門氏菌。

發明內容
本發明目的在于提出特異識別鼠傷寒沙門氏菌的一條寡核苷酸適配子的序列以及應用。本發明優點I)與蛋白類抗體相比，aptamer合成周期短,成本低；aptamer更穩定；aptamer可直接體外合成、易于標記，使得操作更為簡單迅速。2)該序列是從9條均能識別鼠傷寒沙門氏菌的aptamer中，選出的親和カ最強,特異性最好的一條aptamer,能高親和カ高特異性識別鼠傷寒沙門氏菌。


圖1S1-S9 ニ級結構圖2S1-S9解離常數圖3S2的特異性分析圖
具體實施例方式下面是通過SELEX技術篩選特異性結合鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子的方法以及快速檢出鼠傷寒沙門氏菌的應用。1、合成隨機單鏈DNA文庫和引物(IDT公司合成)隨機ssDNA文庫5，-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3，構建了長度為87nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40個堿基的隨機序列，庫容量在IO14以上；引物1:5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’ ；引物I1:5’ -ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，將隨機ssDNA文庫和引物用TE緩沖液配制成100 u mo I/L貯存液_20°C保存備用。2、BBL液體培養基培養鼠傷寒沙門氏菌，37 °C搖床培養至對數生長期(0D_=0. 3)，收集菌液1800g 4 °C離心5min，棄上清，用I X結合緩沖液(I XBB) (50mMTris-HCKpH 7. 4), 5mM KCl, IOOmM NaCl, ImM MgCl2)清洗，去除多余的培養基成分。

3、SELEX篩選獲得鼠傷寒沙門氏菌特異的寡核苷酸適配子I)將ssDNA文庫進行PCR擴增，擴增體系為St印I ssDNA 5^1し引物1、11各 5 ii L，含 Mg2+的 dNTP 5iiL，Taq 酶 0.5 iiL，10XPCR buffer 5yL，用無菌超純水補足 50 ii し① 94 0C 5min,② 94 °C 45s,③ 50 °C 45s,④ 72 °C Imin,⑤ go to ②，2times,⑥72 °C 5min⑦end。所得PCR產物作為st印2模板，st印2 :模板I y L，引物1、II各 I U L，含 Mg2+ 的 dNTPl u L, Taq 酶 0. 5 ii L，10XPCR buffer 5 ii L，用無菌超純水補足 50iiL。① 94°C 5min，② 94°C 45s，③ 50°C 45s，④ 72°C lmin，⑤ go to ②，30times，⑥72°C 5min⑦end。所得產物即作為第一輪篩選的文庫。在與菌種孵育之前，需將文庫于94°C熱變性8min，立即冰浴lOmin。第一輪篩選的投入量為2nM，第二輪至最后為lOOpmol。2)將 ssDNA 文庫，I X IO8 細菌，tRNA 和 BSA，共 600 y L 室溫孵育 45min，使 ssDNA文庫與細菌充分結合。3)5000g 4°C離心5min棄上清，用IXBB清洗3次，分離并去除未與細菌結合的ssDNAo4)將沉淀(即結合了 ssDNA的細菌)溶于100 y L I XPCR緩沖液中，94°C熱變性8min,立即冰浴IOmin,將結合上的ssDNA從細菌上解離下來。5)5000g 4°C離心5min取上清，此為第一輪與細菌結合的ssDNA，將其作為模板進行PCR擴增，擴增產物用作第二輪的篩選。擴增體系為st印 I ssDNA2 U L,引物 115 ii L，含 Mg2+ 的 dNTP I U L, Taq 酶
0.5u L, 10XPCR buffer 5 y L，用無菌超純水補足 50 y し① 94 °C 5min，② 94 °C 45s，③ 55で 45s，④ 72で 45s，⑤ go to ②，2times，⑥ 72で Imin ⑦ 12で 2min ⑧ end。所得 PCR產物作為 Round2 模板，step 2 :模板 I U L，引物1、II 各 I ii L，含 Mg2+ 的 dNTP I U L，Taq
酶 0.L，IOXPCR buffer 5 y L，用無菌超純水補足 50 y し① 94°C 5min，② 94°C 45s，③ 55°C 45s，④ 72°C 45s，⑤ go to ②，30times，⑥ 72°C lmin ⑦ 12°C 2min ⑧ end。6)重復篩選重復上述篩選過程，共進行9輪篩選。7)富集寡核苷酸適配子文庫的測序結果與分析a.將最后的富集文庫擴增為雙鏈，連接pUC19-T載體，轉化E. coli DH5 a，從90個克隆中隨機挑取30個陽性克隆進行DNA序列測定(分別命名為ST1-ST30)。b.采用DNAMAN軟件對30條序列進行同源性分析，RNAstructure軟件對30條序列進行高級結構分析。c.結合軟件分析結果，平均在每個家族選出1-2條結構穩定，能級較低的序列為代表，共9條序列，進行親和力和特異性鑒定。4、利用流式細胞儀對11條序列進行親和カ鑒定I)將上述9條序列及原庫對照送至上海生物工程有限公司合成并在5’標記FAM。FAM-STl 5， -ataggagtcacgacgaccagaa TAGAGATATGACAGCGGGGAAGGTTAAGAGGCGCTAGGAG tatgtgcgt ctacctcttgactaat-3’FAM-ST2 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3JFAM-ST3 5， -ataggagtcacgacgaccagaa TTTCGGCTAAGGACGGGTGAAATACATTTAATAGGGTGGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST4 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa GAAGCTTAAGGGGAGGCAACGATGGACATGCGAGGCTGAA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST5 5， -ataggagtcacgacgaccagaa AAAGCCTGCTGGCGTGGGACAGAAAAGGTGCCGCGGCATT tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST6 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa TCTAAATGATGGCAAAGGATTAGTTGAGATCACTGGCCCT tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST7 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa TAAGTACAGGACTGGAGTATTAGCGGGGTCCATGCAAGGC tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST8 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa AAGTCACCGCGCATACTTGCAGCATGACTCTTCTAGTGGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3，FAM-ST9
5’ -ataggagtcacgacgaccagaa AATCAATAGAAGACAAAGTCCGAAACAGGTGTGACGGTAA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’2)利用流式細胞儀進ー步篩選出鼠傷寒沙門氏菌高親和カ的aptamer。a.上述9條FAM標記的aptamer及文庫分別與I X IO8細菌室溫孵育45min,離心棄上清后，將細胞重溶于300 ii L 1XBB，上機檢測；b.用GraphPad Prism 5繪制非線性曲線,得出Kd,見圖2。5、利用流式細胞儀進行特異性鑒定a.根據Kd值的結果，得出與鼠傷寒沙門氏菌親和カ最強的為S2 (Kd =6. 33 + 0. 58)，S9 (Kd = 11. 14 + 0. 12)。下面分別對這兩條序列做特異性分析。b. S2、S9 (50nM)分別與鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、阪崎桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌室、副溶血性弧菌和化膿鏈球菌溫孵育45min，離心棄上清后，將細胞重懸于300 u L I XBB，上機檢測；由圖2可以得出結論S2，S9的解離常數相對其他7條較小，說明它們與目標菌種的親和カ強于其他7條序列。由圖3可得出結論S2與4種菌種結合，流式細胞儀檢測的熒光強度曲線可以明顯將鼠傷寒沙門氏菌與大腸桿菌、阪崎桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和化膿鏈球菌分開，且鼠傷寒沙門氏菌的熒光強度峰值右移更加明顯，表明S2可特異性識別鼠傷寒沙門氏菌。
權利要求
1.一種特異性識別鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子及其篩選方法與應用，其特征在于所述寡核苷酸適配子的序列如序列表中所示。
2.根據權利要求1所述的特異識別鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子的篩選方法，按照下列步驟進行1)隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫的構建和引物隨機 ssDNA 文庫5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’引物1:5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’ ；引物 I1:5，-ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3，，2)PCR擴增隨機ssDNA文庫；3)SELEX篩選鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子；4)DNA克隆和測序；5)適配子序列同源性和高級結構分析；6)適配子親和力和特異性鑒定。
3.根據權利要求1所述的特異識別鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子在檢測鼠傷寒沙門氏菌方面的應用，其特征在于所述寡核苷酸適配子是體外化學合成的，或是通過PCR或其他分子生物學方法制備的。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及特異性識別鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子是篩選和應用。通過SELEX技術獲得了能夠特異性識別鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子，接著利用流式細胞儀對適配子的親和力和特異性做了分析，得出親和力最強，特異性最好的識別鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子。該適配子在準確、快速、靈敏檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌方面具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12Q1/04GK103031305SQ20111029136
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者王周平, 段諾, 吳世嘉 申請人:江南大學