專利名稱：分離純化胚胎腦神經干細胞的快捷方法
分離純化胚胎腦神經干細胞的快捷方法技術領域
本發明所涉及的是一種生物材料的提純方法，具體說是一種胚胎腦神經干細胞的快速純化方法。
背景技術：
胚胎腦神經干細胞的研究首先需要進行腦神經干細胞的分離，目前有兩種分離胚胎腦神經干細胞的方法(I)懸浮培養法將分散后的腦神經細胞在培養皿中懸浮培養，形成神經球后傳代培養若干次分離得到腦神經干細胞。這種方法得到的腦神經干細胞純度不高，并且周期較長(參考文獻Piper, D. R. et al. !Experimental Neurology 156,71-83,1999)。(2)FACS法先對神經干細胞的特異性抗原進行熒光標記，用精密儀器來篩選干細胞。這種方法雖然可以得到較高純度的干細胞，但對干細胞有一定損傷，并且需要價格昂貴的精密儀器(參考文獻Muotri，R. A. et al Proc Natl Acad Sci USA 97,14720-14725,2000)。發明內容
本發明的目的在于提供一種不需要昂貴的精密儀器設備，但可保證純化后的胚胎腦神經干細胞產品具有高純度的快捷方法。此方法是利用熱轉換聚合物對混合細胞進行培養，從而達到分離純化神經干細胞的目的。用熱轉換聚合物對混合細胞進行三維立體培養也普遍適用于分離純化其他種類干細胞，如肺干細胞、上皮干細胞等。
本發明的目的通過以下步驟得以實現
I)將熱轉換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇用培養基溶解，之后置于0°C， 使之呈液態。
2)在PBS緩沖液(4°C )中反復吹打腦組織，令分散后的細胞通過尼龍篩，單細胞懸浮液離心，棄除上清，用培養基(4°C )使細胞重新懸浮。
3)取O. 7ml熱轉換聚合物與O. 3ml細胞懸浮液混勻。
4)將上述混合物滴入孔狀培養皿中，每孔O. 3ml，置37 °C培養箱中孵育5分鐘。
5)在培養皿中加入培養基，使熱轉換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇完全沒入培養基中。
6)將細胞放入37°C二氧化碳(5% )培養箱中培養，每2天更新培養基一次，培養時間為8到14天。
7)使熱轉換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇在低溫溶解，用4°C培養基離心洗滌回收形成的神經球。
本發明使用的培養基為含15ng/ml bFGF (堿性成纖維生長因子)，30ng/ml EGF(上皮生長因子)，補充4% B27的DMEM/F12培養基。
采用本發明的方法提取的神經球經檢測為Nestin陽性，可懸浮傳代培養，也可在熱轉換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇中繼續傳代培養 。經此法分離提純的胚胎神經干細胞可以在體外分化成神經元(Neuron)，神經膠質細胞(Glia)和少突膠質細胞 (Oligodendrocyte)。
本發明是利用熱轉換聚合物(N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇)對胚胎腦神經細胞進行三維立體培養，利用神經干細胞可在無接點環境中增殖并形成神經球的特征從而達到對神經干細胞分離、擴增和純化的目的。形成的神經球經免疫熒光標記，93%的細胞為Nestin陽性，說明此方法分離、富集、純化神經干細胞快速有效。經此法分離提純的神經干細胞可以在體外分化成神經元(Neuron)，神經膠質細胞(Glia)和少突膠質細胞 (Oligodendrocyte)。


圖1為神經球免疫突光標記(Nestin標記)具體實施方式
下面舉例對本發明做更詳細的描述
1.熱轉換聚合物(N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇)的準備這種聚合物是一種高溫呈凝膠狀態而低溫呈液態狀態的人工膠，它從液態到膠狀的轉換溫度是25°C，可用培養基溶解，冰浴使之呈液狀。
2.胚胎腦組織在低溫PBS緩沖液中反復吹打，使細胞分散后通過尼龍篩，使其成單細胞懸浮液。單細胞懸浮液離心除去上清液，細胞用低溫液體培養基再懸浮。
3.取0. 7ml熱轉換聚合物與0. 3ml細胞懸浮液混勻，細胞密度可根據腦組織的來源進行調節。
4.取細胞混合物一熱轉換聚合物混合物滴入孔狀培養皿中，每孔0. 3ml，置37°C 培養箱中孵育5分鐘，使混合物凝固。
5.在培養皿中加入預熱的培養液，使混合物完全沒入培養基中。
6.細胞放入37°C 5%二氧化碳培養箱中培養，每3天交換一次新培養液。培養一周后，可以在熱轉換聚合物中看到形成的神經球。
7.低溫使熱轉換聚合物溶解，通過低溫培養液離心清洗回收神經球。
8.回收的神經球經檢測為Nestin陽性(圖1)，可懸浮傳代培養，也可在熱轉換聚合物中繼續傳代培養。經此法分離提純的神 經干細胞可以在體外分化成神經元(Neuixm)， 神經膠質細胞(Glia)和少突膠質細胞(Oligodendrocyte)。
本研究使用的培養基為含15ng/ml bFGF (堿性成纖維生長因子)，30ng/ml EGF(上皮生長因子)，補充4% B27的DMEM/F12。
權利要求
1.一種簡單分離純化胚胎腦神經干細胞的獨特方法，使用熱轉換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇對混合細胞進行三維立體培養，形成神經球，從而達到干細胞的分離純化。
2.根據權利要求1所描述的分離純化胚胎腦神經干細胞的快捷方法，其特征是利用熱轉換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇對混合細胞進行三維立體培養的方法還普遍適用于分離純化其他種類的干細胞(如肺干細胞、上皮干細胞等)。
3.這種純化方法使用的培養基特征是含15ng/mlbFGF(堿性成纖維生長因子)， 30ng/ml EGF(上皮生長因子)，補充4% B27的DMEM/F12培養基。
全文摘要
本發明提供的方法可快速簡捷分離、擴增和提純胚胎腦神經干細胞。本發明使用熱轉換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇對神經細胞進行三維立體培養，利用神經干細胞可在凝膠環境中增殖并形成神經球的特性達到對神經干細胞的分離純化之目的。形成的神經球經免疫熒光標記測定，表明約93％的細胞為Nestin陽性，說明此方法分離純化神經干細胞簡單有效。經此方法分離純化的胚胎神經干細胞可以在體外分化形成神經元、少突膠質細胞和神經膠質細胞。
文檔編號C12N5/0735GK103031271SQ201110291150
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者田杰 申請人:北京清美聯創干細胞科技有限公司