專利名稱：Ing4與osm雙基因共表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于腺病毒載體領域，具體涉及一種將ING4和OSM基因插入載體中形成重組載體并以此制備得到的腺病毒載體以及所得腺病毒載體的應用。
背景技術：
現有技術中，從基因方面著手探討喉癌發生、發展機制以及治療方法成為了近年來癌癥研究的重點方向之一。腫瘤基因治療就是將目的基因用基因轉移技術導入靶細胞， 使其發揮特定的功能，繼而執行對腫瘤的殺傷和抑制作用，或保護正常細胞免受化學治療和放射治療的損傷。自1990年Rosenberg等首次利用逆轉錄病毒載體基因轉移技術治療晚期癌癥以來，腫瘤基因治療有了突飛猛進的發展，越來越多的腫瘤基因治療藥物被批準進入臨床試驗，基因治療有望在不久的將來成為腫瘤治療的又一常規手段。為使眾多目的基因具有更高的靶向性，殺傷性與穩定性，在載體選擇方面，要從對基因表達的時間長短， 靶細胞轉導效率，可能產生的毒副作用等方面綜合權衡。雖然腺病毒載體在體內應用時仍存在作用時間短等問題，但因其可以感染分裂和非分裂細胞、病毒滴度高、不整合到宿主染色體中、能夠同時表達多種基因等優點而被廣泛用于腫瘤的基因治療中。由于腫瘤的發生和發展是一個多階段、多因素的復雜過程，涉及多種基因的異常，因而多基因聯合治療、從多個環節控制腫瘤的發生和發展往往顯得更為合理。ING4基因是近年來發現的ING (inhibitor of growth family，腫瘤生長抑制因子)家族成員之一，它由Siiseki等在2003年首次發現得到，后來被確定為一種重要的腫瘤生長抑制因子。ING4基因定位于人染色體12pl3. 3，大小約131Λ，有8個外顯子和7個內含子組成，cDNA全長1380bp，編碼248個氨基酸，其編碼蛋白位于細胞核內，在人類正常組織中均有表達。ING4廣泛參與基因轉錄的調控、細胞的增殖、凋亡和衰老、細胞接觸抑制、血管生成抑制、DNA的損傷修復以及腫瘤轉移侵襲的抑制。研究表明，ING4基因在多種腫瘤中易發生缺失突變或表達下調，并與腫瘤發生和腫瘤惡性程度密切相關。近年來，不少研究將 ING4基因包裝進腺病毒，通過腺病毒載體將ING4基因導入人類多種腫瘤細胞中，包括人肺腺癌細胞系A549、前列腺癌細胞、惡性黑色素瘤細胞系M14，結果顯示，Ad-ING4感染的腫瘤細胞生長受到抑制，凋亡率明顯高于感染空腺病毒載體的細胞組，可見ING4基因表達對腫瘤細胞有抑制生長、誘導凋亡的作用。Gimduz等研究發現ING4基因在頭頸部鱗癌中表達有所下降，推斷其在頭頸部腫瘤中具有重要作用，但其功能與機制尚有待進一步研究。0SM(oncostatin Μ)最初是由Zarling 等從U937組織型淋巴瘤細胞( histiocytic Iymp homacells)培養上清液中分離的一種對A375黑色素瘤細胞有生長抑制作用的細胞因子，隸屬于IL-6超家族，該家族成員包括IL-6，IL-11，LIF, ciliary neurotro-phic factor (CNTF), cardiotropin-l (CT-I), novel neutrophin-l/B cell -stimulating factor-3 (NNT-l/BSF-3 )等，他們由于受體結構類似(均含有gpl30等基本亞單位)而具有相似的功能。由于OSM在結構、功能以及遺傳性能上類似于leukemia inhibitory factor (LIF)，因此曾一度被認為是另一種LIF，但OSM亦具有很多獨特的性能，包括抑制腫瘤細胞生長，刺激造血，炎癥反應、促進巨噬細胞分化，對神經營養肽的誘導作用，調節膽固醇代謝以及對骨細胞的作用。人類抑瘤素M (hOSM)是一種耐熱、耐酸的單鏈糖蛋白，其分子量為觀000，基因定位于22號染色體ql2上，cDNA編碼252個氨基酸，它是一種能抑制腫瘤細胞增殖和促進正常成纖維細胞生長的多肽，已報道OSM對黑色素瘤、 肺癌、乳腺癌、肝癌等多種實體瘤具有抑制作用，其作用機制可能與下述因素有關與其受體結合后，通過JAK/STAT信號傳導途徑，作用于靶基因，如CDKIS的P21WAF1/CIPI，P27KLPI 等，使細胞生長阻滯；通過下調癌基因如抑制如c-myc的表達而抑制細胞增殖；或通過免疫效應抑制細胞增殖。目前已經有不少研究利用腺病毒介導OSM基因來進行腫瘤基因治療， 如胰腺癌、肝癌、黑色素瘤。如上所述，ING4是一種新型的腫瘤生長抑制因子，它主要在細胞內發揮抑瘤作用； OSM具有廣譜的抑癌效應，主要在細胞外發揮作用；二者一旦發生基因缺失或突變常會導致多種腫瘤的發生。放射治療是腫瘤治療的重要方法之一，但即使是治療劑量的放射線也對人體有不同程度的損傷，這在很大程度上限制了放療的應用與發展。腫瘤的基因-放射治療(gene-radiotherapy)是近年提出的腫瘤治療新思路，其原理是將輻射誘導基因 (radiation-inducible gene)的調控序列與腫瘤殺傷基因相偶聯轉染進腫瘤細胞，在對腫瘤實施局部照射時誘導基因表達，通過射線與基因的雙重作用殺傷腫瘤。腫瘤的基因-放射治療不但可以進一步提高療效，還能在保證療效的前提下降低放射劑量，減少對人體的損傷。研究表明，ING4基因可以提高胰腺癌細胞對放療的敏感性，OSM基因在黑色素瘤中可以被射線誘導增強表達，從而達到基因與射線的雙重抑瘤效果，但ING4以及OSM在喉癌中是否具有放療增敏效應尚未見報道。綜上所述，現有技術中并未見到有關ING4和OSM雙基因共表達質粒載體和腺病毒載體的構建和共表達的報道，對ING4和OSM基因共表達的兩種蛋白產物，在腫瘤治療中能否發揮抑制腫瘤細胞及其移植瘤的生長和誘導腫瘤細胞凋亡等的協同或疊加抑癌效應。特別是二者的聯合對腫瘤放射治療能否發揮放療增敏效應、增強放療效果，至今國內外均未見報道，為此現已成為當今腫瘤治療中的研究熱點，也是腫瘤治療中為提高腫瘤治療的療效急切需要解決的難題。
發明內容
本發明的發明目的是提供一種含有ING4和OSM基因的重組轉移質粒、含有ING4 和OSM基因的重組腺病毒載體，使得腺病毒介導的ING4和OSM雙基因可以在腫瘤細胞中穩定轉錄及表達，并呈現明顯的抑瘤增效協同作用。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是一種含有ING4和OSM基因的重組轉移質粒，所述含有ING4和OSM基因的重組轉移質粒為pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-pr omoter—OSM。上述技術方案中，所述重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM 以轉移質粒 pAdTrack-CMV-polyA-promoter 為基礎，并且在 pAdTrack-CMV-polyA-promoter的多克隆位點的Bgl II, Sal I之間插有酶切擴增出的 ING4片段，在Not I、Hind III酶切位點之間插有酶切擴增出的OSM片段。
上述技術方案中，所述重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM 的制備方法為在已有的pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造轉移質?；A上，在多克隆位點的 Bgl II,Sal I 之間插入酶切的 ING4 片段，構建pA(Trrack-CMV-ING4-poly-A-promo ter單基因重組轉移質粒，然后在pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter重組轉移質粒的 Not I、Hind III酶切位點之間插入酶切擴增出的OSM片段構建得到pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM 重組轉移質粒。上述技術方案中，pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造轉移質粒的制備方法可參考文獻.盛偉華，謝宇鋒，楊吉成.Ad-ING4-P0lyA-Pr0m0ter-IL-M雙基因共表達載體構建及表達.中華微生物學和免疫學雜志，2010，30 (8) =695-703 (通迅作者楊吉成)。進一步的技術方案中，將重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter -OSM與pAdEasy-1腺病毒骨架質粒采用氯化鈣法共轉化BJ5183感受態細菌，篩選后經 PacI酶切后再用脂質體轉染QBH93A細胞，經多輪感染和擴增后獲得重組腺病毒載體 Ad-ING4-0SM。本發明同時要求保護上述重組腺病毒載體Ad-ING4_0SM。上述重組腺病毒載體Ad-ING4_0SM能抑制腫瘤細胞生長并誘導其凋亡，這種作用顯著優于Ad-ING4、Ad-OSM單基因組，而且還呈現明顯的抑瘤增效協同作用；因此，本發明要求保護上述重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM、重組腺病毒載體 Ad-ING4-0SM在制備治療癌癥藥物中的應用；優選地，所述癌癥包括喉癌、肺癌。上述重組腺病毒載體Ad-ING4_0SM在治療喉癌時具有放療增敏作用，因此，本發明同時要求保護上述重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM、重組腺病毒載體Ad-ING4-0SM在制備放療增敏藥物中的應用；優選地，所述放療增敏藥物為治療喉癌的放療增敏藥物。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點 1、本發明成功構建了 ING4和OSM雙基因共表達腺病毒載體。2、本發明所述Ad-ING4_0SM雙基因共表達在體內外均能抑制人喉癌Hep_2細胞及其裸鼠移植瘤的生長并誘導其凋亡，這種作用顯著優于Ad-ING4、Ad-OSM單基因組 (/X0. 05)，而且還呈現明顯的抑瘤增效協同作用1. 18，Q#rt=1.38)；在體外能抑制 SPC-Al肺腺癌細胞的生長并誘導其凋亡，這種作用顯著優于Ad-ING4、Ad-0SM單基因組，而且還呈現明顯的抑瘤增效協同作用。3、本發明所述Ad-ING4_0SM雙基因共表達更具顯著上調P21、P27、Bax、Caspase_3 和下調Survivin、Cox-2、Bcl-2等細胞周期和凋亡相關蛋白的表達；Ad-ING4_0SM雙基因共表達更具顯著下調腫瘤血管形成因子CD34表達的效應。
附圖1.實施例一中ING4和OSM雙基因共表達模式示意圖； 附圖2.實施例一中pAdTrack-CMV轉移質粒圖譜；
附圖3A.實施例一中pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter重組轉移載體構建和鑒定；A pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter 重組轉移載體質粒 PCR 鑒定M: DL2000Marker ； 1: ING4 目的條帶；附圖3B.實施例一中pAdTrack-CMV-OSM-polyA-promoter重組轉移載體質粒Bgl II、 Sal I雙酶切鑒定M: DL2000Marker; 1:載體質粒條帶和ING4目的條帶；
附圖4A.實施例一中pAdTrack-CMV-ING4-polyA+promoter-0SM重組轉移載體質粒 PCR 鑒定M: DL2000Marker ； 1: OSM 目的條帶；
附圖4B.實施例一中pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter -OSM重組轉移載體質粒 Not I, Hind III雙酶切鑒定Μ: DL2000Marker ； 1:載體質粒條帶和OSM目的條帶；
附圖5.實施例一中同源重組克隆質粒(BJ5183)瓊脂糖電泳分子量大小鑒定，其中，1、2 為 pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter-OSM 同源重組陽性克??；3 pAdEasy-1 -pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter-OSM 同源重組陰性克隆；4 為 pA(Trrack-CMV-ING4-poly-A-CMV-0SM轉移質粒；5普通的同源重組質粒； 附圖6.實施例一中各組基因重組腺病毒感染QBH93A細胞照片； 附圖 .實施例一中RT-PCR鑒定ING4和/或OSM基因在QBH93A細胞中的轉錄，其中，1.PBS ； 2. Ad-GFP ；3. Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ； 5. AD-ING4-0SM ；6. 2kb DNA Marker ； 附圖8.實施例二中喉癌Hep-2細胞感染病毒后白光與熒光照片； 附圖9.實施例二中腺病毒介導的ING4和/或OSM基因在喉癌Hep-2細胞中的轉錄鑒定，其中，l.PBS ;2. Ad-GFP ;3. Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ；5. AD-ING4-0SM ；6. 2kb DNA Marker ； 附圖10.實施例二中OSM和ING4蛋白表達的Wfestern blot鑒定，其中，1. PBS ； 2.Ad-GFP ；3. Ad-ING4 ；4. Ad- OSM ；5.Ad_ING4- OSM ；
附圖11.實施例二中不同劑量重組腺病毒對喉癌Hep-2細胞的作用； 附圖12.實施例二中重組腺病毒對喉癌H印-2細胞的生長抑制曲線，注ING4、OSM單基因重組腺病毒組分別與PBS，Ad-GFP組比較，P < 0. 05 ；Ad-ING4-0SM雙基因組分別與 Ad-ING4、Ad-OSM 單基因重組比較，P < 0. 05 ；
附圖13.實施例二中Hochest33258染色檢測喉癌ifep-2細胞凋亡的核形態學變化 (X100)；
附圖14.實施例二中FCM檢測各組腺病毒對喉癌Hep-2細胞細胞周期的影響；注 Ad-ING4、Ad-OSM以及AD-ING4-0SM分別與細胞對照組(PBS組)和Ad-GFP陰性對照組相比，ρ<0· 05 ；
附圖15.實施例二中流式細胞儀對喉癌Hep-2細胞凋亡率測定的結果； 附圖16.實施例二中RT-PCR分析H印-2細胞P21、P27、P53和Survivin的mRNA轉錄水平，其中，1. PBS ;2. Ad-GFP ;3. Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ；5. AD-ING4-0SM ；
附圖17.實施例二中喉癌!fep-2細胞凋亡相關基因的半定量分析結果；注ING4、OSM 單基因重組腺病毒組分別與PBS,Ad-GFP組比較，P < 0. 05 ；Ad-ING4-0SM雙基因組分別與 Ad-ING4、Ad-OSM 單基因組比較，ΔΡ < 0. 05 ；
附圖18A.實施例三中五組人喉癌!fep-2細胞裸鼠移植瘤的瘤體照片，其中，1. Ad-ING4-0SM ；2. Ad-OSM ；3.Ad_ING4 ；4. Ad-GFP ；5. PBS ；
附圖18B.實施例三中Ad-0SM、Ad-ING4、Ad-ING4-0SM對人喉癌移植瘤移植瘤治療后體積變化曲線；
附圖18C.實施例三中各組腺病毒作用后喉癌裸鼠移植瘤平均重量變化；注ING4、0SM 單雙基因腺病毒組分別與PBS，Ad-GFP組比較，P < 0. 05 ；Ad-ING4_0SM組分別與Ad_ING4、Ad-OSM單基因重組腺病毒組比較，P < 0. 05 ；
附圖18D.實施例三中各組腺病毒對喉癌裸鼠移植瘤的抑制率；注Ad-ING4-0SM組分別與Ad-ING4、Ad-OSM單基因重組腺病毒組比較，P < 0. 05，Q=L 38 ；
附圖19.實施例四中各組腺病毒對喉癌Hep-2細胞的抑制作用；單純放療組、 Ad-ING4-0SM雙基因重組腺病毒組分別與細胞對照組，Ad-GFP空載體腺病毒組比較，P
<0. 05 ；基因聯合放療組分別與單純放療組、Ad-ING4-0SM雙基因重組腺病毒組比較，P
<0. 05，Q=L 21 ；
附圖20A.實施例四中各組腺病毒對喉癌Hep-2細胞相關基因表達變化的影響；其中， 1.細胞對照組；2. Ad-GFP ;3. AD-ING4-0SM ；4. 8Gy ；5. AD-ING4-0SM +8Gy ；
附圖20B.實施例四中細胞凋亡相關基因的半定量分析結果；單純放療組、 Ad-ING4-0SM雙基因重組腺病毒組分別與細胞對照組，Ad-GFP空載體腺病毒組比較，P
<0. 05 ；基因聯合放療組分別與單純放療組、Ad-ING4-0SM雙基因重組腺病毒組比較，P
<0. 05 ；
附圖21.實施例四中檢測各組喉癌細胞細胞周期變化結果；放療組、Ad-ING4-0SM組以及AD-ING4-0SM+放療組分別與細胞對照組(PBS組)和Ad-GFP陰性對照組相比，p<0. 05 ； 附圖22.實施例四中流式細胞儀對喉癌Hep-2細胞凋亡率測定的結果；放療組、 Ad-ING4-0SM 組、Ad-ING4_0SM 聯合放療組分別與 PBS，Ad-GFP 組比較，P < 0. 05 ； Ad-ING4-0SM聯合放療組分別與放療組、Ad-ING4-0SM組比較，P < 0. 05 ； 附圖23A.實施例四中喉癌裸鼠移植瘤實物附圖23B.實施例四中喉癌裸鼠移植瘤體積-時間變化曲線；放療組、Ad-ING4-0SM組、 Ad-ING4-0SM聯合放療組分別與PBS，Ad-GFP組比較，P < 0. 05 ；Ad-ING4-0SM聯合放療組分別與放療組、Ad-ING4-0SM組比較，P < 0. 05 ；
附圖23C.實施例四中喉癌裸鼠移植瘤平均重量變化；放療組、Ad-ING4-0SM組、 Ad-ING4-0SM聯合放療組分別與PBS，Ad-GFP組比較，P < 0. 05 ；Ad-ING4-0SM聯合放療組分別與放療組、Ad-ING4-0SM組比較，P < 0. 05 ；
附圖23D.實施例四中不同因素對喉癌裸鼠移植瘤的抑制率；Ad-ING4-0SM聯合放療組分別與放療組、Ad-ING4-0SM組比較，P < 0. 05，Q=L 17 ；
附圖24A.實施例四中各組瘤組織中ING4/0SM表達的檢測；
附圖MB.實施例五中重組腺病毒對凋亡、細胞周期、血管生成相關因子表達的影響； 附圖25.實施例五中腺病毒介導的ING4和/或OSM基因在SPC-Al肺腺癌細胞中的轉錄鑒定(RT-PCR)，其中，1. PBS ；2. AdV ；3. Ad_ING4 ；4. Ad-OSM ；5. Ad-ING4_0SM ；
附圖26.實施例五在SPC-Al肺腺癌細胞中ING4和OSM蛋白表達的Wfestern blotting 鑒定，其中，1. Ad-ING4 ；2Ad-ING4-0SM ；3. Ad-OSM ；4. Adv ；5. PBS ；
附圖27.實施例五中Ad-ING4-0SM等對SPC-Al肺腺癌細胞生長的影響； 附圖28A.實施例五中PI染色法檢測Ad-ING4-0SM對SPC-Al肺腺癌細胞周期的流式測定結果；
附圖^B.實施例五中PI染色法檢測Ad-OSM對SPC-Al肺腺癌細胞周期的流式測定結
果；
附圖^C.實施例五中PI染色法檢測Ad-ING4對SPC-Al肺腺癌細胞周期的流式測定結果；
附圖29.實施例五中流式細胞儀檢測Ad-ING4-0SM等對SPC-Al肺腺癌細胞凋亡率測定的結果比較；
附圖30.實施例五中RT-PCR檢測SPC-Al細胞中凋亡相關基因，其中，l.PBS ;2. Ad; 3. Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ；5.Ad-ING4_0SM ；
附圖31.實施例五中Wfestern blotting檢測SPC-A1細胞中Caspase-3的表達，其中， PBS；2. Ad ；3.Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ；5. Ad-ING4_0SM。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述 實施例一基因重組腺病毒載體的構建及其檢測
材料Bgl II, Sal I、Not I、Hind III 限制性內切酶、T4DNA 連接酶、Taq DNA 聚 ^ Sl> dNTPmix Oligo d(T)18> DL2000marker> Ribonuclease Inhibitor 自 TaKaRa 公司；逆轉錄酶 MMLV、Lambda DNA/HindIII marker 購自 MBI 公司；PmeI、PacI 購自 New EnglandBiolads公司；日常型小量質粒抽提試劑盒、PCR產物清潔試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自杭州維特潔生化技術有限公司；pAcWrack-CMV-ING4-IRES-hOSM質粒、pAdTrack-CMV-poly-A-promoter 質粒、QBI-293A 包裝細胞、pAdTrack-CMV-polyA +promoter-OSM質粒、pAdEasy-1骨架質粒、大腸桿菌DH5 α、BJ5183細菌、空載體腺病毒Ad-GFP等均為本實驗室保存；引物i3-actin、ING4、OSM基因引物(如表1)均由上海 Sangon合成；RPMI-1640購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州賽樂生物有限公司；6 孔細胞培養板購自CORNING公司；UNIQ-IO柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、酵母提取物、 胰蛋白胨、瓊脂粉等生化試劑購自上海生工生物技術有限公司。表1 PCR擴增所用引物及其序列
引物編號ft名稱ι 引_序
權利要求
1.一種含有ING4和OSM基因的重組轉移質粒，所述含有ING4和OSM基因的基因重組轉移質粒為 pAdTrack-CMV-ING4-po 1 y-A-promoter-OSM。
2.根據權利要求1所述含有ING4和OSM基因的基因重組轉移質粒，其特征在于，所述基因重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM以轉移質粒 pAdTrack-CMV-polyA-promoter 為基石出，并且在 pAdTrack-CMV-polyA-promoter 的多克隆位點的Bgl Il.Sal I之間插有ING4片段，在Not I、Hind III酶切位點之間OSM片段。
3.根據權利要求1所述含有ING4和OSM基因的基因重組轉移質粒，其特征在于， 所述基因重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM的制備方法為在 pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造轉移質粒基礎上，在多克隆位點的Bgl Il.Sal I之間插入酶切擴增出的ING4片段，構建pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter單基因重組轉移質粒，然后在 pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter 重組轉移質粒的 Not I、Hind III 酶切位點之間插入酶切擴增出的OSM片段構建得到pA(Trrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0 SM重組轉移質粒。
4.一種含有ING4和OSM基因的重組腺病毒載體，所述重組腺病毒載體為 Ad-ING4-0SM。
5.根據權利要求4所述含有ING4和OSM基因的重組腺病毒載體，其特征在于，所述重組腺病毒載體的制備方法為將權利要求1所述重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A -promoter-OSM與pAdEasy-1腺病毒骨架質粒采用氯化鈣法共轉化BJ5183感受態細菌，篩選后經I^cI酶切后再用脂質體轉染QBH93A細胞，經多輪感染和擴增后獲得重組腺病毒載體 Ad-ING4-0SM。
6.權利要求1所述重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM或權利要求4所述重組腺病毒載體Ad-ING4-0SM在制備治療癌癥藥物中的應用。
7.權利要求1所述重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM或權利要求4所述重組腺病毒載體Ad-ING4-0SM在制備放療增敏藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于腺病毒載體領域，具體公開了一種重組腺病毒載體Ad-ING4-OSM及其制備方法以轉移質粒pAdTrack-CMV-polyA-promoter為基礎，并且在其多克隆位點的BglII、SalI之間插有ING4片段，在NotI、HindIII酶切位點之間OSM片段，制得重組轉移質粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM；將所述重組轉移質粒與pAdEasy-1腺病毒骨架質粒采用氯化鈣法共轉化BJ5183感受態細菌，篩選后經PacI酶切后再用脂質體轉染QBI-293A細胞，經多輪感染和擴增后獲得重組腺病毒載體Ad-ING4-OSM；該Ad-ING4-OSM組重組腺病毒與Ad-ING4、Ad-OSM單基因組相比對人喉癌Hep-2細胞及其裸鼠移植瘤呈現明顯的抑瘤增效協同作用和放療增敏協同效應；而且對抑制SPC-A1肺腺癌細胞的生長和誘導細胞凋亡呈現疊加的抑癌增效作用。
文檔編號C12N15/861GK102352368SQ20111029371
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者楊吉成, 馬士崟 申請人:蘇州大學