本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種短鏈脫氫酶的分子改造，同時(shí)涉及相應(yīng)突變酶基因的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及上述突變體酶或含有突變體酶的重組細(xì)胞在不對(duì)稱還原一系列潛手性酮制備光學(xué)純手性醇中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

手性醇是一類在手性碳上連有羥基的旋光性化合物。羥基能夠輕易被轉(zhuǎn)換為多種其他功能基團(tuán)的性質(zhì)使手性醇成為最重要的手性砌塊之一。具有光學(xué)活性的手性醇被廣泛用于合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品和農(nóng)用化學(xué)品等。潛手性酮的不對(duì)稱還原是制備光學(xué)活性手性醇的重要方法，理論上能將底物酮100％轉(zhuǎn)化為單一對(duì)映體的手性醇，具有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。其中，生物催化潛手性酮不對(duì)稱還原合成手性醇因具有理論產(chǎn)率高、選擇性好、副產(chǎn)物少和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)而成為手性醇綠色合成的優(yōu)選途徑。

在具有催化不對(duì)稱還原潛手性酮活性的酶中，短鏈脫氫酶由于其催化底物譜廣、熱穩(wěn)定性好以及有機(jī)溶劑耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)而倍受關(guān)注。短鏈脫氫酶催化潛手性酮還原制備高光學(xué)純度手性醇已有諸多報(bào)道。然而，大多數(shù)生物催化劑催化潛手性酮不對(duì)稱還原過程遵循Prelog規(guī)則，遵循anti-Prelog規(guī)則催化潛手性酮還原的生物催化劑相對(duì)較少。這將限制作為手性藥物合成重要中間體anti-Prelog手性醇的制備及生物催化綠色合成技術(shù)的推廣。本課題組前期篩選得到一株能夠以anti-Prelog立體選擇性催化潛手性酮還原的菌株短穩(wěn)桿菌ZJUY-1401(Empedobacter brevis ZJUY-1401)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:M 2014520(專利公開號(hào)CN 105316250 A)；并從其基因組中挖掘并克隆表達(dá)了遵循anti-Prelog規(guī)則高立體選擇性還原潛手性酮的短鏈脫氫酶EbSDR8(專利公開號(hào)CN 105238768 A)。但是，該短鏈脫氫酶的催化活性遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求，因此，有必要通過相關(guān)技術(shù)提高該酶的催化效率以充分挖掘其應(yīng)用價(jià)值。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供酶活提高的短鏈脫氫酶EbSDR8的突變體及其重組工程菌等，為手性醇的合成提供強(qiáng)有力的生物催化劑。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面提供催化活性顯著提高的短鏈脫氫酶EbSDR8的突變體，這些突變體是在SEQ ID No.2所示短鏈脫氫酶EbSDR8氨基酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)建，該短鏈脫氫酶核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示(專利公開號(hào)CN 105238768A)。所述突變體為在SEQ ID No.2所示短鏈脫氫酶EbSDR8氨基酸序列基礎(chǔ)上含有如下幾個(gè)位點(diǎn)的單點(diǎn)突變或多點(diǎn)組合突變：94位甘氨酸(Gly94)、145位組氨酸(His145)、153位絲氨酸(Ser153)、188位酪氨酸(Tyr188)和193位亮氨酸(Leu193)。

優(yōu)選地，所述突變體是分別在短鏈脫氫酶EbSDR8的Gly94和Ser153兩個(gè)位點(diǎn)上進(jìn)行取代，且更優(yōu)選的，上述兩個(gè)優(yōu)選位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行取代時(shí)具有更優(yōu)的催化活性。

優(yōu)選地，所述短鏈脫氫酶EbSDR8的突變體分別為：將94位甘氨酸突變?yōu)楸彼?Gly94Ala，即G94A)，其是由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列組成；將153位絲氨酸突變?yōu)榱涟彼?Ser153Leu，即S153L)，其是由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列組成；且上述兩個(gè)優(yōu)選單點(diǎn)突變體的組合突變(Gly94Ala/Ser153Leu，即G94A/S153L)具有更優(yōu)的催化活性，其是由SEQ ID No.8所示的氨基酸序列組成。

任何對(duì)上述突變體氨基酸序列中氨基酸經(jīng)過缺失、插入或替換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有短鏈脫氫酶活性的，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的第二方面提供上述短鏈脫氫酶突變體的核苷酸序列。其中突變體G94A核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，其編碼氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；突變體S153L核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，其編碼氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示；突變體G94A/S153L核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示，其編碼氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，本發(fā)明的短鏈脫氫酶突變體的核苷酸序列也可以是編碼序列表中所示氨基酸組成的蛋白質(zhì)的其它任何核苷酸序列。

任何對(duì)所示突變體核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入處理獲得的核苷酸序列，只要其與核苷酸具有90％以上的同源性，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的第三方面提供一種包含本發(fā)明的短鏈脫氫酶突變體基因的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。這些重組載體可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的短鏈脫氫酶突變體核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。所述載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如各種質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選pET-30a。

本發(fā)明的第四方面提供一種表達(dá)重組短鏈脫氫酶突變體的基因工程菌，可通過將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中獲得。所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要滿足重組表達(dá)載體可以穩(wěn)定自我復(fù)制且所攜帶的本發(fā)明的短鏈脫氫酶突變體基因可以有效表達(dá)。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。

本發(fā)明的第五方面提供一種重組短鏈脫氫酶突變體的制備方法，包括如下步驟：培養(yǎng)本發(fā)明的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)獲得重組短鏈脫氫酶突變體蛋白。其中，所述的培養(yǎng)重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體所用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域可使轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明的短鏈脫氫酶突變體蛋白的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L，pH 7.2。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊限制，只要使轉(zhuǎn)化體能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生短鏈脫氫酶突變體蛋白即可。優(yōu)選下述方法：將本發(fā)明涉及的重組大腸桿菌接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度OD600達(dá)到0.5～0.7時(shí)，在終濃度為0.1～1.0mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下，即可高效表達(dá)本發(fā)明的重組短鏈脫氫酶突變體蛋白。

本發(fā)明的第六方面提供所述短鏈脫氫酶突變體或其基因工程菌在不對(duì)稱催化潛手性酮制備光學(xué)活性手性醇中的應(yīng)用。

具體的，所述的應(yīng)用為：以潛手性酮(I)為底物，所述短鏈脫氫酶突變體或其重組細(xì)胞，以NADH或NADPH為輔酶，20～50℃下，于pH 5.5～10.5的緩沖液構(gòu)成的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系a中反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化得到相應(yīng)產(chǎn)物。

其中，R₁和R₂為氫、烷基、鹵代烷基、鹵素、烷氧基和硝基。

具體的R₁和R₂可以為-H，-CH₃，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₃，-CH₂X，-CX₃，-X，-OCH₃，-OCH₂CH₃；X代表F，Cl，Br，OH，NO₂。

所述的反應(yīng)條件可按本領(lǐng)域所用的常規(guī)條件進(jìn)行選擇。

進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化體系a中底物初始濃度為5～1000mmol/L。

進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化體系a中重組短鏈脫氫酶突變體純酶在反應(yīng)液中較佳的濃度為0.1～2.0mg/mL。所述轉(zhuǎn)化體系a中菌體的質(zhì)量用量以菌體濕重計(jì)為1～400g/L。

進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化體系a還包括有機(jī)溶劑，由底物、催化劑、有機(jī)溶劑與pH 5.5～10.5的緩沖液構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系b，有機(jī)溶劑占轉(zhuǎn)化體系b總體積1～20％，轉(zhuǎn)化體系b中底物初始濃度為5～1000mmol/L，菌體的質(zhì)量用量以菌體濕重計(jì)為10～400g/L。

進(jìn)一步，所述反應(yīng)在pH 6.5～10.5的緩沖液中進(jìn)行。

進(jìn)一步，反應(yīng)體系還可添加1～15％醇或糖作為輔底物，可以顯著提高反應(yīng)的活力和立體選擇性。所述輔底物包括但不限于下列之一：①乙醇、②異丙醇、③葡萄糖、④蔗糖等。

進(jìn)一步，反應(yīng)體系中的輔底物為異丙醇。

進(jìn)一步，反應(yīng)體系中異丙醇的濃度為10％。

進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液分離純化方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液離心，取上清液用等體積的乙酸乙酯萃取，有機(jī)層即為含相應(yīng)手性醇的粗品，將粗品提純即獲得相應(yīng)手性醇。所述粗品提純的方法為本領(lǐng)域公知技術(shù)，通常為有機(jī)溶劑萃取、色譜分離和吸附分離等。

本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體系a和轉(zhuǎn)化體系b均為轉(zhuǎn)化體系，為便于區(qū)分不同步驟轉(zhuǎn)化體系的組成不同而命名，字母本身沒有含義。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了催化活性顯著提高的短鏈脫氫酶突變體及其核苷酸序列，以及含有相應(yīng)突變體基因的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，通過這些短鏈脫氫酶突變體或含有相應(yīng)突變體蛋白的重組細(xì)胞不對(duì)稱還原可制備高光學(xué)純度的手性醇；本發(fā)明中所述短鏈脫氫酶突變體或含有突變體蛋白的重組細(xì)胞不對(duì)稱還原制備手性醇具有高催化活性，能夠合成高光學(xué)純度手性醇(ee>99％)。催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和、底物適應(yīng)性廣、環(huán)境友好，且其重組細(xì)胞能夠在不外加任何輔酶的含異丙醇反應(yīng)體系中高效催化潛手性酮的不對(duì)稱還原，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用開發(fā)前景。

(四)附圖說明

圖1為短鏈脫氫酶EbSDR8及其突變體分離純化后SDS-PAGE圖。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：突變體的構(gòu)建

以含有突變點(diǎn)的寡核苷酸片段為引物(表1)，采用QuickChangeTM方法(Stratagene,La Jolla,CA)擴(kuò)增含有短鏈脫氫酶EbSDR8基因的pET-30a重組質(zhì)粒。

表1突變體構(gòu)建引物

^a下劃線標(biāo)示為突變位點(diǎn)

PCR反應(yīng)體系：5×PrimerSTAR buffer(Mg2+plus)，5μL；dNTPs(各2.5mM)，2.0μL；上游引物(10μM)，1.0μL；下游引物(10μM)，1.0μL；重組質(zhì)粒模板，15ng；PrimerSTAR polymeraseTM HS(2.5U/μL)，0.5μL；加ddH2O至總體積為25μL。

PCR程序：(1)98℃，1min；(2)98℃，10s；(3)55℃，10s；(4)72℃，7min。步驟(2)-(4)循環(huán)20次后冷卻至4℃。

PCR產(chǎn)物經(jīng)清洗后，利用特異性識(shí)別甲基化位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶DpnI進(jìn)行消化以降解模板質(zhì)粒。酶切反應(yīng)體系及條件：17μL經(jīng)清洗處理的PCR產(chǎn)物，2.0μL 10×緩沖液，1.0μL限制性內(nèi)切酶DpnI，37℃保溫1h。

將上述經(jīng)酶切處理的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，得到相應(yīng)的重組大腸桿菌，涂布于含卡那霉素的平板，37℃下培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明含有短鏈脫氫酶突變體基因的重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)中。最終獲得突變體G94A、S153L和G94A/S153L核苷酸序列測(cè)序結(jié)果分別如序列表中SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8所示。

實(shí)施例2：短鏈脫氫酶突變體的誘導(dǎo)表達(dá)

實(shí)施例1構(gòu)建的工程菌接種至含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，再以1％接種量(v/v)接種到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至菌體濃度OD600至0.6左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG，26℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后，4℃、8000rpm離心10min收集菌體，于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3：短鏈脫氫酶突變體的分離純化

實(shí)施例2收集的菌體細(xì)胞懸浮于10mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液(100mM，pH 8.0)中，振蕩搖勻后置超聲波下破碎(有效時(shí)間8min)。破碎液于12,000rpm離心10min去除細(xì)胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于酶的后續(xù)的分離純化。純化柱為Ni-NTA，裝柱體積為5mL，先用上樣平衡緩沖液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，以5mL/min的速率上樣粗酶液，用上樣平衡緩沖液洗脫以除去未吸附的蛋白，最后用洗脫緩沖液(20mM T磷酸鈉，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)洗脫收集目標(biāo)蛋白。酶液用HiTrap脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，脫鹽緩沖液為Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(100mM,pH 7.5)緩沖液，所得純酶液于4℃貯存?zhèn)溆谩＜兓蟮拿敢河肧DS-PAGE進(jìn)行分析，SDS-PAGE電泳見圖1，通道1為蛋白Maker；通道2為EbSDR8純酶；通道3為突變體G94A純酶；通道4為突變體S153L純酶；通道5為突變體G94A/S153L純酶。結(jié)果表明經(jīng)Ni-NTA親和層析，得到電泳純的重組短鏈脫氫酶EbSDR8及其突變體。

實(shí)施例4：短鏈脫氫酶EbSDR8及其突變體的比活

通過分光光度計(jì)在340nm處檢測(cè)NADH吸光值變化以計(jì)算羰基還原酶活力。酶活單位(U)的定義為：30℃下，每分鐘催化1μmol NADH氧化所需的酶量；比活為每毫克蛋白所具有的酶活(U/mg)。反應(yīng)體系為(1.0mL)：0.3mM NADH，100μL異丙醇，Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液(100mM,pH 7.5)和適量的純酶。底物分別為苯乙酮1a，4’-氟苯乙酮1b，4’-氯苯乙酮1c，4’-溴苯乙酮1d，4’-甲基苯乙酮1e，4’-甲氧基苯乙酮1f，4’-乙氧基苯乙酮1g，2,2,2-三氟苯乙酮1h，2-氯-4’-氟苯乙酮1i，3’-氯-4’-氟苯乙酮1j，2,3’,4’-三氯苯乙酮1k，2,2’,4’-三氯苯乙酮1l。野生型EbSDR8及其突變體催化相應(yīng)底物比活和立體選擇性如表2所示。

表2 EbSDR8及其突變體催化活性

實(shí)施例5：短鏈脫氫酶突變體EbSDR8及其突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在標(biāo)準(zhǔn)條件下，通過改變反應(yīng)體系中底物的濃度進(jìn)行酶活力測(cè)定，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法計(jì)算相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。動(dòng)力學(xué)常數(shù)計(jì)算中所用底物及其濃度如下：苯乙酮1a(0～10mM)，4’-氟苯乙酮1b(0～10mM)，4’-氯苯乙酮1c(0～1.0mM)，4’-溴苯乙酮1d(0～0.5mM)，4’-甲基苯乙酮1e(0～0.5mM)，4’-甲氧基苯乙酮1f(0～0.2mM)，4’-乙氧基苯乙酮1g(0～0.2mM)，2,2,2-三氟苯乙酮1h(0～0.3mM)，2-氯-4’-氟苯乙酮1i(0～0.5mM)，3’-氯-4’-氟苯乙酮1j(0～1.5mM)，2,3’,4’-三氯苯乙酮1k(0～1.0mM)，2,2’,4’-三氯苯乙酮1l(0～1.0mM)。野生型EbSDR8及其突變體催化相應(yīng)底物的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表3所示。

表3 EbSDR8及其突變體不對(duì)稱還原潛手性酮表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)

實(shí)施例5：短鏈脫氫酶突變體EbSDR8及其突變體G94A/S153L轉(zhuǎn)化高濃度2,2,2-三氟苯乙酮

反應(yīng)體系(10.0mL)：0.4g濕菌體細(xì)胞，不同濃度2,2,2-三氟苯乙酮，1.0mL異丙醇，9.0mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液(100mM,pH 7.5)和適量的純酶。于35℃，200rpm條件下反應(yīng)。野生型EbSDR8重組大腸桿菌全細(xì)胞催化活性明顯低于突變體G94A/S153L，反應(yīng)1h后，突變體G94A/S153L全細(xì)胞催化反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到95.2％，而野生型EbSDR8反應(yīng)組產(chǎn)率僅為69.9％；同樣條件下，野生型EbSDR8和突變體G94A/S153L全細(xì)胞催化該反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到99％所需時(shí)間分別為5.5和1.5h。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到800mM時(shí)，該突變體全細(xì)胞仍能有效催化反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)9h，產(chǎn)率達(dá)到95.1％，產(chǎn)物的濃度達(dá)760.7mM，該突變體催化高濃度底物轉(zhuǎn)化時(shí)仍然展現(xiàn)出良好的立體選擇性，產(chǎn)物ee值保持99％以上。突變體G94A/S153L全細(xì)胞能夠在無外源輔酶添加的情況下，以異丙醇作為輔底物實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)，有效催化高濃度2,2,2-三氟苯乙酮不對(duì)稱還原，表明該全細(xì)胞生物催化劑具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。