本發明屬于基因工程技術領域，具體而言，涉及一種可在哺乳動物細胞中穩定表達Cas9基因的DNA載體。

背景技術：

CRISPR-Cas9系統，被稱為第三代基因編輯技術。相比于它的兩位前輩ZFN系統和TALEN系統，它有著一些無可比擬的優點。首先，CRISPR-Cas9系統的可用位置更多。理論上基因組中每8個堿基就能找到一個可以用CRISPR-Cas9進行編輯的位置，可以說這一技術能對任一基因進行操作，而TALEN和ZFN系統則在數百甚至上千個堿基中才能找到一個可用位點，這大大限制了使用范圍。此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，來在特定DNA序列上研究這些蛋白對細胞的影響。第三，更為重要的是，CRISPR-Cas9系統的使用極為方便，只需要簡單的幾步就能完成，幾乎任何實驗室都可以開展工作，而不需要向ZFN和TALEN那樣借助商業公司的協助完成。由于以上特點，CRISPR-Cas9被評為2013年生物學10大突破之一。

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是細菌和古細菌一種不斷進化適應的免疫防御機制。目前較為常用的是CRISPR/Cas9系統,該系統由向導RNA和Cas9切割酶組成。CRISPR/Cas9利用一段小RNA來識別并剪切DNA以降解外來核酸分子。Cong等(Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013)證明CRISPR/Cas9系統能在293T、K562、iPS等多種細胞中，進行有效的靶向酶切，非同源重組(NHEJ)、同源重組(HR)效率在3-25％之間，與TALENs酶切效果相當。他們還證明，多個靶點可以同時進行靶向酶切。但是CRISPR/Cas9的瞬時轉染存在效率不穩定的問題，而且在功能基因組高通量篩選過程中此問題尤其嚴重，因而迫切需要開發出一種Cas9的穩定表達載體，實現Cas9的穩定持續表達。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種可在哺乳動物細胞中穩定表達Cas9基因的質粒DNA載體。本發明使用內切酶AgeⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ三酶切pX330載體得Cas9編碼區，在兩側添加合適的酶切位點后，將編碼Cas9的CDS序列構建到pUC-EIN載體中，得載體pUC-CIN。使用pUC-CIN載體穩定轉染豬細胞系，經單克隆篩選可以獲得穩定表達Cas9基因的細胞株，從而達到在哺乳動物細胞中穩定表達Cas9基因的目的。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種Cas9表達載體pUC-CIN,其序列如SEQ ID NO.11所示，由4.3kb的Cas9片段與5.1kb的pUC-EIN載體骨架連接得到，所述pUC-EIN載體的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；

所述5.1kb的pUC-EIN載體骨架由BspTⅠ、BamHⅠ雙酶切pUC-EIN載體得到；

所述4.3kb的Cas9片段由BspTⅠ、BamHⅠ雙酶切pUC-Cas9載體得到；

所述pUC-Cas9載體是由AgeⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ三酶切pX330載體得4.3kb、2.2kb及2.0kb片段，將4.3kb Cas9片段插入到pUC-GZ載體中得到；

所述pUC-GZ載體由pUC-mIKB載體經EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切得2.6kb的載體骨架和1.4kb片段，將2.6kb的載體骨架與47bp的GZ短片段連接所得；

所述pUC-mIKB載體的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

所述GZ短片段的制作過程如下：

a)從上海生工生物工程有限公司訂購2條DNA寡核苷酸GZF、GZR，(其序列如SEQ ID NO.3-4所示)如下：

GZF：5'AATTACTTAAGACCGGTGGTACCACTCGTCTCGAGGAATTCGGATCC 3'

GZR：5'AGCTGGATCCGAATTCCTCGAGACGAGTGGTACCACCGGTCTTAAGT 3'

b)將GZF、GZR分別按照10微摩爾/升的濃度稀釋，二者等量混合，取50微升置于薄壁PCR管中，按照下述程序孵育：

95℃5分鐘，72℃10分鐘，置冰上,GZ短片段制作完成。

pUC-CIN載體經酶切及測序驗證無誤(AflⅡ、EcoRⅠ雙酶切，獲得4.3kb、3.3kb及1.8kb條帶)。

本發明提供的一種Cas9表達載體，穩定轉染哺乳動物細胞系，經單克隆篩選可以獲得穩定表達Cas9基因的細胞株，可在哺乳動物中穩定表達Cas9基因。

附圖說明

圖1是Cas9表達載體pUC-CIN構建過程示意圖；

圖2是pUC-CIN載體酶切鑒定示意圖；

圖3是Cas9基因表達檢測引物設計示意圖；

圖4是3D4/21單克隆細胞Cas9基因mRNA水平表達檢測示意圖；

圖5是PIEC單克隆細胞Cas9基因mRNA水平表達檢測示意圖。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中，如無特殊說明，均采用低糖DMEM培養基培養細胞。

pX330載體購自Addgene公司，貨號42230。內切酶均購自NEB公司。DNA寡核苷酸均由上海生工生物工程有限公司合成。

實施例1 Cas9穩定表達載體的構建及鑒定

1.pUC-CIN載體構建

(1)pUC-mIKB載體序列如SEQ ID NO.1所示,EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切得2.6kb的載體骨架和1.4kb片段，將2.6kb的載體骨架與47bp的GZ短片段連接，得pUC-GZ。

GZ短片段的制作過程如下：

從上海生工生物工程有限公司訂購2條DNA寡核苷酸GZF、GZR(其序列如SEQ ID NO.3-4所示)，序列如下：

GZF：5'AATTACTTAAGACCGGTGGTACCACTCGTCTCGAGGAATTCGGATCC 3'

GZR：5'AGCTGGATCCGAATTCCTCGAGACGAGTGGTACCACCGGTCTTAAGT 3'

將GZF、GZR分別按照10微摩爾/升的濃度稀釋，二者等量混合，取50微升置于薄壁PCR管中，按照下述程序孵育：

95℃5分鐘，72℃10分鐘，置冰上。

GZ短片段制作完成。

(2)AgeⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ三酶切pX330載體得4.3kb、2.2kb及2.0kb片段，將4.3kb的Cas9片段插入到pUC-GZ載體(AgeⅠ、EcoRⅠ雙酶切)中，得pUC-Cas9載體；

(3)BspTⅠ、BamHⅠ雙酶切pUC-Cas9載體得4.3kb的Cas9片段，BspTⅠ、BamHⅠ雙酶切pUC-EIN載體(DNA序列如SEQ ID NO.2所示)得5.1kb的載體骨架，將4.3kb的Cas9片段與5.1kb的pUC-EIN載體骨架連接,得pUC-CIN載體，其序列如SEQ ID NO.11所示。pUC-CIN載體經酶切及測序驗證無誤(AflⅡ、EcoRⅠ雙酶切，獲得4.3kb、3.3kb及1.8kb條帶)。pUC-CIN載體構建示意圖如圖1所示，酶切鑒定結果如圖2所示。

2、Cas9基因表達檢測引物的設計與合成

由于Cas9基因編碼區較大，PCR法檢測其全長cDNA的表達存在一定困難。為了較為準確的檢測Cas9在mRNA水平的表達，在Cas9編碼區上、中、下游分別設計一對引物，Cas9-F1、Cas9-R1；Cas9-F2、Cas9-R2；Cas9-F3、Cas9-R3(其序列如SEQ ID NO.5-10所示)名稱及序列如下：Cas9-F1：5'GCAGCCGACAAGAAGTACAG 3'；Cas9-R1：5'TTGGCCATCTCGTTGCTGAA 3'；Cas9-F2：5'CTGGACTCCCGGATGAACAC 3'；Cas9-R2：5'TTCGCCGTTTGTCTCGATCA 3'；Cas9-F3：5'GCAGATTCGCCTGGATGA 3'；Cas9-R3：5'GCAGCACCTTCTCGTTGG 3'。其中Cas9-F1與Cas9-R1組成一對引物，檢測上游序列，Cas9-F3與Cas9-R3檢測中游序列，Cas9-F2與Cas9-R2檢測下游序列(如圖3所示)。引物送上海生工生物工程有限公司合成。

實施例2 Cas9穩定表達的豬肺泡巨噬細胞單克隆篩選

將Cas9穩定表達載體pUC-CIN經MluⅠ單酶切線性化，轉染所得豬肺泡巨噬細胞系3D4/21，轉染48小時后，鋪96孔板5個及10cm培養皿10個，添加900微克/毫升G418進行單克隆篩選，獲得13個狀態較好的單克隆。提取這些單克隆細胞的總RNA，反轉錄為cDNA，使用前文所設計合成的三對引物(Cas9-F1、Cas9-R1、Cas9-F2、Cas9-R2、Cas9-F3、Cas9-R3)進行PCR檢測，將三對引物都呈陽性的單克隆(5、17、27、42號)判定為穩定表達Cas9基因的單克隆細胞株，具體結果如圖4所示。

實施例3 Cas9穩定表達的豬血管內皮細胞單克隆篩選

豬血管內皮細胞PIEC復蘇后，傳代兩次，鋪24孔板，在其中6孔中使用脂質體(lipo2000)轉染pUC-CIN載體(已MluⅠ單酶切線性化)；轉染48小時后，鋪96孔板4個及10cm培養皿8個，添加800μg/ml G418進行單克隆篩選，獲得7個狀態較好的單克隆，分別命名為1、2、3、4、5、6、8號。提取這些單克隆細胞的總RNA，反轉錄為cDNA，使用前文所設計合成的三對引物(Cas9-F1、Cas9-R1、Cas9-F2、Cas9-R2、Cas9-F3、Cas9-R3)進行PCR檢測，將三對引物都呈陽性的單克隆(1、2、3、5、6號)判定為穩定表達Cas9基因的單克隆細胞株，具體結果如圖5所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島市畜牧獸醫研究所

<120> 一種Cas9表達載體

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4034

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt catcgattcc gcctcagaag 420

ccatagagcc caccgcatcc ccagcatgcc tgctattgtc ttcccaatcc tcccccttgc 480

tgtcctgccc caccccaccc cccagaatag aatgacacct actcagacaa tgcgatgcaa 540

tttcctcatt ttattaggaa aggacagtgg gagtggcacc ttccagggtc aaggaaggca 600

cgggggaggg gcaaacaaca gatggctggc aactagaagg cacagtcgag gctgatcagc 660

gggtttaaac tcttttagac actttccaaa gctcataacg tcaggcgctg gcctccaagc 720

acgcagtcgt catagggcag ctcatcctct gtgaactctg actccgtgtc atagctctcc 780

tcatcctcgc tctctggaag catctggagg ttttctaggg tcagctggcc cagctgctgc 840

tgtatccgag tgcttgggcg gccccaggtg agctggtacg gggagtagcc ctggtaggtg 900

actctgttga catcagcccc acacttcaac aagagcgaca ccaggtcggg attctgcagg 960

tccaccgcaa gatgcagggc ggttcggcca ttgcagggct cctgagcgtt gacatcagca 1020

cccaaagaca ccaacagctc cacaatgccc aggtagccat ggatcgaggc taagtgcaga 1080

catgtgtggc cattgtagtt ggtggcctgc agaatggagt ggaggtgctg ggtcccgcgg 1140

ggctgagtca ggactcccac actggccagg cagccctgct cacaggcaag gtgtagaggg 1200

gtatttcctc gaaagtctcg gagctcagga tcacagccag cttccagaag tgcctcagcg 1260

atttctggct ggttggtgat caccgccaag tggagtggag tctgctgcag gttgttctgg 1320

aagttaagaa aagccagatc tcccttcact tggcggacca cttccatggt cagtgccttc 1380

tcttcatgga tgatggccaa gtgcaggaac gagtctccgt cctcggtgag ctgctgcttc 1440

cagggctcgg cgccgcgggg cgcctcctgc ggctcgaggc ggatctcgcg cagctccttc 1500

accatctgct cgtactcctc gtccttcatg gcgtccaggc cggcgtcgtg gcggtcatcc 1560

agtagccgct ccttcttgag cgcgtcccgg ggcccctcca tggcccactc ctggccgggc 1620

tctgcgggct ggaacatggc gcgatgaggg cttgggcgct gctccctagg tgcgcgggcc 1680

acaggctgcg cggcgcgctg gctgctcgcg gtggctcggg cgggcgggac gatggcctcg 1740

gactgttgga tccgataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatgc tagcaagctt 1800

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 1860

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 1920

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 1980

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 2040

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2100

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2160

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2220

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2280

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2340

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2400

gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2460

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2520

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2580

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2640

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2700

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 2760

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2820

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 2880

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 2940

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 3000

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 3060

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 3120

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3180

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 3240

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 3300

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3360

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3420

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3480

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3540

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 3600

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 3660

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 3720

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 3780

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 3840

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 3900

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 3960

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 4020

gaggcccttt cgtc 4034

<210> 2

<211> 5867

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gcggccgcat taccctgtta 420

tccctagaat tcgatgctga agttcctata gtttctagag tataggaact tcggtcataa 480

cttcgtatag catacattat acgaagttat tccggataag atacattgat gagtttggac 540

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 600

ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttgg ggtgggcgaa gaactccagc 660

atgagatccc cgcgctggag gatcatccag ccggcgtccc ggaaaacgat tccgaagccc 720

aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt gggcgtcgct 780

tggtcggtca tttcgaaccc cagagtcccg ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga 840

aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc 900

attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt 960

ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga 1020

tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg 1080

ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 1140

cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 1200

ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 1260

tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 1320

cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 1380

gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 1440

caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca 1500

cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca 1560

cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc 1620

atgctagctt atcatcgtgt ttttcaaagg aaaaccacgt ccccgtggtt cggggggcct 1680

agacgttttt ttaacctcga ctaaacacat gtaaagcatg tgcaccgagg ccccagatca 1740

gatcccatac aatggggtac cttctgggca tccttcagcc ccttgttgaa tacgcttgag 1800

gagagccatt tgactctttc cacaactatc caactcacaa cgtggcactg gggttgtgcc 1860

gcctttgcag gtgtatctta tacacgtggc ttttggccgc agaggcacct gtcgccaggt 1920

ggggggttcc gctgcctgca aagggtcgct acagacgttg tttgtcttca agaagcttcc 1980

agaggaactg cttccttcac gacattcaac agaccttgca ttcctttggc gagaggggaa 2040

agacccctag gaatgctcgt caagaagaca gggccaggtt tccgggccct cacattgcca 2100

aaagacggca atatggtgga aaataacata tagacaaacg cacaccggcc ttattccaag 2160

cggcttcggc cagtaacgtt aggggggggg ggggagaggg gcggaattgg atccgatatc 2220

ttacttgtac agctcgtcca tgccgagagt gatcccggcg gcggtcacga actccagcag 2280

gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta 2340

gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc 2400

ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 2460

gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 2520

gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 2580

cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 2640

gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 2700

cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca ctgcacgccg taggtcaggg tggtcacgag 2760

ggtgggccag ggcacgggca gcttgccggt ggtgcagatg aacttcaggg tcagcttgcc 2820

gtaggtggca tcgccctcgc cctcgccgga cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcgcc 2880

gtccagctcg accaggatgg gcaccacccc ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat 2940

cttaaggatc tgacggttca ctaaaccagc tctgcttata tagacctccc accgtacacg 3000

cctaccgccc atttgcgtca atggggcgga gttgttacga cattttggaa agtcccgttg 3060

attttggtgc caaaacaaac tcccattgac gtcaatgggg tggagacttg gaaatccccg 3120

tgagtcaaac cgctatccac gcccattgat gtactgccaa aaccgcatca ccatggtaat 3180

agcgatgact aatacgtaga tgtactgcca agtaggaaag tcccataagg tcatgtactg 3240

ggcataatgc caggcgggcc atttaccgtc attgacgtca atagggggcg tacttggcat 3300

atgatacact tgatgtactg ccaagtgggc agtttaccgt aaatactcca cccattgacg 3360

tcaatggaaa gtccctattg gcgttactat gggaacatac gtcattattg acgtcaatgg 3420

gcgggggtcg ttgggcggtc agccaggcgg gccatttacc gtaagttatg taacgcggaa 3480

ctccatatat gggctatgaa ctaatgaccc cgtaattgag atctgaagtt cctatagttt 3540

ctagagtata ggaacttcgg tcataacttc gtatagcata cattatacga agttatacgc 3600

gttttaaacg gccgggccgg ccatgcatag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 3660

tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 3720

taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 3780

cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 3840

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 3900

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 3960

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 4020

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 4080

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 4140

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 4200

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 4260

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 4320

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 4380

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 4440

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 4500

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 4560

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 4620

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 4680

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 4740

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 4800

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttgg ggtgggcgaa gaactccagc 660

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gccctttcgt c 9431