專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用巢式PCR技術(shù)針對轉(zhuǎn)基因作物中花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子的檢測方法。
背景技術(shù)：
目前，全球轉(zhuǎn)基因作物商品化生產(chǎn)迅猛發(fā)展。自1996年首次商業(yè)性種植以來，轉(zhuǎn)基因作物以其大大減少田間勞作、降低生產(chǎn)成本、緩解環(huán)境惡化等優(yōu)越性，迅速被廣大農(nóng)民接受，種植面積不斷擴(kuò)大。轉(zhuǎn)基因作物給人們帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時，其潛在的生態(tài)安全和食品安全問題，也日益受到人們的關(guān)注。現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍處于發(fā)展過程中，國際上生物安全方面的評估體系尚不成熟，現(xiàn)有的知識不足以評估轉(zhuǎn)基因作物的利益與風(fēng)險。鑒于此， 國際上大多數(shù)國家制定了相應(yīng)的法律法規(guī)，對轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管，如歐盟各國、日本、韓國等均制定了強(qiáng)制性標(biāo)識制度；我國于2001年、2002年先后頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》，啟動了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)管機(jī)制。我國政府規(guī)定了凡是列入標(biāo)識管理目錄并用于銷售的農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因作物，應(yīng)當(dāng)加以標(biāo)識。因此，必須對轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品進(jìn)行有效的檢測。
轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品檢測主要采用蛋白檢測方法和DNA檢測方法。DNA檢測方法中，主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，該技術(shù)又分為定性PCR檢測和定量PCR檢測。而巢式PCR檢測屬于定性PCR檢測，是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，其原理是設(shè)計兩對引物， 其中一對引物在另一對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上，通過二次PCR反應(yīng)對某個基因進(jìn)行檢測。 巢氏PCR以其特異性和靈敏性已廣泛應(yīng)用于許多檢測領(lǐng)域，一般來說，巢式PCR具有高度的特異性，其結(jié)果一般不需再用其他方法來驗證。在利用基因工程技術(shù)將一個外源基因整合進(jìn)入植物基因組中時，外源基因必須配備一個啟動子。花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子是轉(zhuǎn)基因作物中一種廣譜性的外源啟動子，如玉米、棉花、大豆、番茄等大約有85-90%的轉(zhuǎn)基因作物使用了該啟動子。CaMV35S啟動子其保守序列相當(dāng)穩(wěn)定，是轉(zhuǎn)基因檢測的最佳靶點。通過巢式PCR檢測CaMV35S啟動子可高效、靈敏、準(zhǔn)確地檢測農(nóng)作物及產(chǎn)品中是否具有轉(zhuǎn)基因成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，用以檢測轉(zhuǎn)基因作物中花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，本檢測方法具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點，可避免出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果，能切實解決轉(zhuǎn)基因作物的檢測技術(shù)難題。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，該方法包括利用ft~imer Premier V5. 0軟件進(jìn)行巢式PCR的引物設(shè)計，用Oligo V6. 22軟件篩選出相互干擾最小的引物；
擴(kuò)增所用的引物及擴(kuò)增片段大小為第一輪PCR所用引物
引物名稱:35S EF 序列(5’ — 3，) ATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA
35S ER 序列(5’ — 3，) TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA 擴(kuò)增片段大小4Mbp 第二輪PCR所用引物
引物名稱35S IF 序列(5’ 一 3，)GCTCCTACAAATGCCATCATTGC
35S IR 序列(5’ — 3，)GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC 擴(kuò)增片段大小195bp ；
第一輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序為在PCR反應(yīng)體系中，加DNA模板2μ L (50ng)；反應(yīng)程序為94 V預(yù)變性IOmin、94 V變性40s、58 °C退火40s、72 °C延伸45s，35個循環(huán)；72 °C延伸5 min，4°C保存；
第二輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序為在第二輪PCR反應(yīng)體系中，加第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 2uL ；反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性10min、94°C變性40s、56°C退火40s、72°C延伸45s，35個循環(huán)； 72°C延伸5 min，4°C保存待測；
兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并樣品分析，即可。所述的一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，所述的瓊脂糖凝膠濃度為2%，膠中溴化乙錠濃度為0. 5μ g/mL，電泳條件以lOV/cm電壓，電泳時間lh。所述的一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，樣品分析為第二輪PCR擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明樣品中檢測出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，即呈陽性；反之，則未檢出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，即呈陰性。所述的一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，第一輪PCR產(chǎn)物是否能觀察到與預(yù)期片段大小一致的DNA片段，均不作為判斷結(jié)果；而僅以第二輪PCR產(chǎn)物的觀察結(jié)果作為最后判斷結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點與效果是
1.本發(fā)明的檢測方法具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點，可避免出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果，能切實解決轉(zhuǎn)基因作物的檢測技術(shù)難題。2.本發(fā)明根據(jù)花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子的保守序列，設(shè)計兩個特異性外引物，和引用農(nóng)業(yè)部953號公告-6-2007公布的CaMV35S啟動子檢測引物作為內(nèi)引物，該組引物可檢測出不同轉(zhuǎn)基因作物中的花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，具有廣譜性。3.本發(fā)明與農(nóng)業(yè)部953號公告-6-2007公布的CaMV35S啟動子檢測引物相結(jié)合， 使該發(fā)明更具有規(guī)范性和權(quán)威性。4.本發(fā)明可直接為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持，可以在農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究、生產(chǎn)應(yīng)用和監(jiān)測中得到廣泛應(yīng)用。該發(fā)明可對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)、 銷售進(jìn)行有效監(jiān)管，對保障人民健康、環(huán)境安全和生物多樣性具有重要意義。


圖1為本發(fā)明的第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果圖； 圖2為本發(fā)明的第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明的檢測方法為
(1) DNA提取稱取0. 1 g樣品，采用CTAB法進(jìn)行DNA提取。(2)PCR 擴(kuò)增第一輪 PCR 擴(kuò)增，20μ1 反應(yīng)體系包括10mmol/L iTris-HCl, 50mmol/L KCl, 1. 5mmol/L MgC12，0· 15 μ mol/L dNTP, 0. 5 μ mol/L35S EF 和!35S ER 引物，1 單位Taq DNA聚合酶，50ng DNA模板；反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性lOmin，94°C變性40s，58°C 退火40s，72°C延伸45s，;35個循環(huán)；72°C延伸5 min，4°C保存。在第二輪PCR反應(yīng)體系中，加入第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ L為模板，反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 10min，94°C變性 40s，56°C退火 40s，72°C延伸 45s，;35 個循環(huán)；72°C延伸 5 min， 4°C保存待測。(3)電泳檢測兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠濃度為m, 溴化乙錠濃度為0. 5 μ g/mL,電泳條件以lOV/cm電壓，電泳時間lh。(4)結(jié)果分析第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果見附圖1，在454 bp附近觀察不到有DNA條帶，不能進(jìn)行判斷；第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果見附圖2，在195 bp附近觀察到有DNA條帶，與預(yù)期片段大小一致，表明樣品中檢測出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，呈陽性。實施例1
本實施例中用巢式PCR檢測方法檢測大豆樣品A是否含有轉(zhuǎn)基因成分花椰菜花斑病毒 CaMV35S啟動子。操作流程如下
(I)DNA提取將大豆樣品A稱取0. Ig,采用CTAB法進(jìn)行DNA提取。(2)PCR 擴(kuò)增第一輪 PCR 擴(kuò)增，20μ1 反應(yīng)體系包括10mmol/L iTris-HCl, 50mmol/L KCl, 1. 5mmol/L MgC12，0· 15 μ mol/L dNTP, 0. 5 μ mol/L35S EF 和!35S ER 引物，1 單位Taq DNA聚合酶，50ng DNA模板；反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性lOmin，94°C變性40s，58°C 退火40s，72°C延伸45s，;35個循環(huán)；72°C延伸5 min，4°C保存。在第二輪PCR反應(yīng)體系中，加入第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ L為模板，反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 10min，94°C變性 40s，56°C退火 40s，72°C延伸 45s，;35 個循環(huán)；72°C延伸 5 min, 4°C保存待測。(3)電泳檢測兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠濃度為I 溴化乙錠濃度為0. 5 μ g/mL,電泳條件以lOV/cm電壓，電泳時間lh。(4)結(jié)果分析第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果在454 bp附近未觀察到有DNA條帶，不能進(jìn)行判斷；第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果在195 bp附近也未觀察到DNA條帶，表明大豆樣品A中未檢測出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，呈陰性。實施例2
本實施例中用巢式PCR檢測方法檢測玉米樣品B是否含有轉(zhuǎn)基因成分花椰菜花斑病毒 CaMV35S啟動子。操作流程如下
(I)DNA提取將玉米樣品B稱取0. Ig,采用CTAB法進(jìn)行DNA提取。(2)PCR 擴(kuò)增第一輪 PCR 擴(kuò)增，20μ1 反應(yīng)體系包括10mmol/L iTris-HCl, 50mmol/L KCl, 1. 5mmol/L MgC12，0· 15 μ mol/L dNTP, 0. 5 μ mol/L35S EF 和!35S ER 引物，1 單位Taq DNA聚合酶，50ng DNA模板；反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性lOmin，94°C變性40s，58°C退火40s，72°C延伸45s，;35個循環(huán)；72°C延伸5 min，4°C保存。在第二輪PCR反應(yīng)體系中，加入第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ L為模板，反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 10min，94°C變性 40s，56°C退火 40s，72°C延伸 45s，;35 個循環(huán)；72°C延伸 5 min， 4°C保存待測。(3)電泳檢測兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠濃度為I 溴化乙錠濃度為0. 5 μ g/mL,電泳條件以lOV/cm電壓，電泳時間lh。(4)結(jié)果分析第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果在454 bp附近未觀察到DNA條帶，不能進(jìn)行判斷；第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果在195 bp附近觀察到有DNA條帶，與預(yù)期片段大小一致，表明玉米樣品B中檢測出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，呈陽性。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，其特征在于，該方法包括利用I^rimer Premier V5. 0軟件進(jìn)行巢式PCR的引物設(shè)計，用Oligo V6. 22軟件篩選出相互干擾最小的引物；擴(kuò)增所用的引物及擴(kuò)增片段大小為第一輪PCR所用引物引物名稱35S EF 序列(5’ 一 3，) ATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA 35S ER 序列(5，— 3，)TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA擴(kuò)增片段大小4Mbp ；第二輪PCR所用引物引物名稱35S IF 序列(5’ 一 3，)GCTCCTACAAATGCCATCATTGC 35S IR 序列(5’ — 3，)GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC擴(kuò)增片段大小195bp ；第一輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序為在PCR反應(yīng)體系中，加DNA模板2μ L (50ng)；反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性10min、94°C變性40s、58°C退火40s、72°C延伸45s，35個循環(huán)；72°C延伸5 min，4°C保存；第二輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序為在第二輪PCR反應(yīng)體系中，加第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 2uL ；反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性10min、94°C變性40s、56°C退火40s、72°C延伸45s，35個循環(huán)； 72°C延伸5 min，4°C保存待測；兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并樣品分析，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠濃度為2%，膠中溴化乙錠濃度為0. 5μ g/mL，電泳條件以lOV/cm 電壓，電泳時間Ih。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，其特征在于，樣品分析為第二輪PCR擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明樣品中檢測出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，即呈陽性；反之，則未檢出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子， 即呈陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，其特征在于，第一輪PCR產(chǎn)物是否能觀察到與預(yù)期片段大小一致的DNA片段，均不作為判斷結(jié)果；而僅以第二輪PCR產(chǎn)物的觀察結(jié)果作為最后判斷結(jié)果。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，該方法根據(jù)花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子的保守序列，設(shè)計兩個特異性外引物和引用農(nóng)業(yè)部953號公告-6-2007公布的CaMV35S啟動子檢測引物作為內(nèi)引物，該組引物可檢測出不同轉(zhuǎn)基因作物中的花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，具有廣譜性。本發(fā)明的檢測方法具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點，可避免出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果，能切實解決轉(zhuǎn)基因作物的檢測技術(shù)難題。本發(fā)明可直接為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持，可對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)、銷售進(jìn)行有效監(jiān)管，對保障人民健康、環(huán)境安全和生物多樣性具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102534046SQ20111029514
公開日2012年7月4日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者岳靜, 朱志成, 邵雙 申請人:沈陽化工大學(xué)