專利名稱：青蝦kspi基因、其擴增方法及擴增引物組的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因克隆領域，特別涉及青蝦KSPI基因、其擴增方法及擴增引物組。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶抑制因子(Serine proteinase inhibitor, SPI)是一類廣泛存在于各種生物體內的蛋白，在變態、傷口愈合、先天免疫等過程中具有重要的作用。絲氨酸蛋白酶抑制因子主要包括serpin、α -巨球蛋白、Kazal型、Kunitz型等抑制因子家族，其中 Kazal 型絲氨酸蛋白酶抑制因子(Kazal-type serine proteinase inhibitor, KSPI)是研究最廣泛的酶抑制因子家族之一。KSPI最早發現于哺乳動物，隨后又在克氏原蜜蟲下{Procambarus e/ar左ii)、南美白對蟲下{Litopenaeus vannamei) >3 i X^tIf {Penaeus fflo/ (9￡/o/ )、羅氏沼蟲下(Macrobrachium rosenbergii) >{Toxoplasma gondii)禾口家H
iBombyx mori)等多種動物中被鑒定。KSPI在抗凝血、調控自我吞噬和機體防御等過程中具有重要的作用。最近研究發現，KSPI在生殖方面有著重要的功能。Li等在羅氏沼蝦的研究中發現，KSPI能夠抑制生殖腺中精子明膠酶的活性，推測KSPI可能在羅氏沼蝦生殖過程中發揮某種重要作用。Jalkanen等在小鼠的研究中發現，KSPI對小鼠精子的成熟起調節作用。青蝦(Macrobrachium nipponense)是我國重要的淡水養殖經濟品種。目前青蝦的分子研究多集中在群體遺傳多樣性方面，其基因克隆研究較少，而對青蝦KSPI基因克隆的研究尚未見報道。本研究擬以青蝦為實驗材料，根據本實驗室青蝦精巢CDNA文庫中篩選到的一個KSPI基因片段，通過RACE技術克隆出該基因全長cDNA序列，以期為后續青蝦KSPI 基因功能的研究奠定基礎，同時為甲殼類生殖研究積累背景資料。

發明內容
有鑒于此，本發明提供青蝦KSPI基因、其擴增方法及擴增引物組。利用本發明提供的引物組從青蝦精巢組織中克隆到了 KSPI基因序列，對青蝦KSPI基因功能的研究奠定基礎， 同時為甲殼類生殖研究積累背景資料。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案
本發明提供了青蝦KSPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本發明還提供了用于擴增青蝦KSPI基因的引物組，其由如下引物組成 引物組
正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。本發明還提供了一種擴增青蝦KSPI基因的方法，包括如下步驟步驟1 獲得青蝦腦組織總RNA ； 步驟2 合成cDNA ；
步驟3 從本實驗室構建的青蝦精巢cDNA文庫中篩選到KSPI基因片段，以此作為中間序列；
步驟4 用引物組擴增獲得青蝦KSPI基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組由如下引物組成
正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。步驟5 將所述KSPI基因cDNA序列的中間片段、所述KSPI基因的3’端和5’端片段拼接，即得。作為優選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。本發明以青蝦精巢組織為材料，分離了青蝦KSPI基因全長cDNA序列，利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈反應(NeSted-PCR)、3，端cDNA快速擴增 (3，-RACE)以及5，端cDNA快速擴增(5，-RACE)的方法，對青蝦KSPI基因進行了研究，首次從青蝦精巢組織中克隆到了 KSPI基因全長cDNA序列，并對其所編碼的KSPI的序列特征、同源性、進化地位進行了分析，為進一步研究青蝦KSPI基因的表達、功能研究奠定了基礎，同時也為甲殼類生殖研究提供了新的材料。
具體實施例方式本發明公開了青蝦KSPI基因、其擴增方法及擴增引物組。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供了青蝦KSPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本發明還提供了用于擴增青蝦KSPI基因的引物組，其由如下引物組成 引物組
正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。其中，正向外引物3 KSPI 1、正向內引物3 KSPI 2與反向引物——3' RACE試劑盒中提供的3' RACE Outer Primer和3' RACE Inner Primer用于擴增核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示青蝦KSPI基因的3，端片段；
反向外引物5 KSPI 1、反向內引物5 KSPI 2與正向引物——5' RACE試劑盒中提供的 5' RACE Outer Primer 和 5' RACE Inner Primer 用于擴增核苷酸序列如 SEQ ID N0:1所示青蝦KSPI基因的5’端片段。本發明還提供了一種擴增青蝦KSPI基因的方法，包括如下步驟 步驟1 獲得青蝦腦組織總RNA ；
步驟2 合成cDNA ；
步驟3 從本實驗室構建的青蝦精巢cDNA文庫中篩選到KSPI基因片段，以此作為中間序列；
步驟4 用引物組擴增獲得青蝦KSPI基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組由如下引物組成
正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。步驟5 將所述KSPI基因cDNA序列的中間片段、所述KSPI基因的3’端和5’端片段拼接，即得。作為優選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。使用ClustalWl. 83將KSPI蛋白序列與已公布的部分甲殼類KSPI蛋白序列進行了比對。比對結果顯示，青蝦KSPI蛋白序列與羅氏沼蝦最為相似。通過對青蝦中獲得的KSPI基因cDNA編碼的氨基酸序列與其它甲殼類KSPI氨基酸序列，利用DNAstar軟件進行alignment分析和使用MEGA 4構建NJ系統發育樹，可以看出青蝦KSPI與同樣來源于精巢的羅氏沼蝦KSPI進化關系最近聚為一支，其他蝦類來源于肝胰腺和血細胞的KSPI聚為另外兩支。本發明中青蝦由太湖無錫湖區漁民提供，試劑均可由市場夠得，純化及cDNA第一鏈合成試劑盒購自上海生工生物工程有限公司(Sang0n)，3'及5' RACE試劑盒購自寶生物(大連)有限公司(Takara)。下面結合實施例，進一步闡述本發明 實施例1
總RNA提取逐個取青蝦精巢組織，迅速放入盛有液氮的預冷研缽中，共取三只青蝦的精巢組織共約30mg，解剖速度要快并且注意添加液氮；總RNA的提取使用Takara公司的 RNAiso Plus提取試劑結合傳統的酚仿抽提法進行，提取方法參照使用說明書。cDNA第一鏈合成據上海生工生物工程有限公司(Sangon) cDNA合成試劑盒說明書進行。青蝦KSPI基因全長cDNA序列的克隆
根據本實驗室構建的青蝦精巢cDNA文庫中篩選到的KSPI基因片段設計引物，用于3’ 端、5’端快速擴增，得到青蝦KSPI基因全長cDNA序列； KSPI基因cDNA 3，端快速擴增(3，-RACE) 根據KSPI基因中間片段序列，設計特異性正向引物3 KSPI 1和3 KSPI 2 ；與正向引物3 KSPI 1和3 KSPI 2相配對反向引物是3' RACE試劑盒中提供的3‘ RACE Outer Primer 和 3' RACE Inner Primer，進行 cDNA 3，快速擴增，操作步驟按 TaKaRa 3，-RACE 試劑盒說明書進行。正反引物序列如下3 KSPI 1 5' - CTCATCGGGGTTGCATCTGG-3‘
3 KSPI 2 5' - GCACCGAACTTCCAATG -3'
3' RACE Outer Primer 5' -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3‘
3' RACE Inner Primer 5' -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3‘
反轉錄
按照3' RACE試劑盒中的說明進行，獲得3' RT液。
權利要求
1.青蝦KSPI基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.用于擴增青蝦KSPI基因的引物組，其特征在于，其由如下引物組成 引物組正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
3.一種擴增青蝦KSPI基因的方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟1 獲得青蝦腦組織總RNA ；步驟2 合成cDNA ；步驟3 從本實驗室構建的青蝦精巢cDNA文庫中篩選到KSPI基因片段，以此作為中間序列；步驟4 用引物組擴增獲得青蝦KSPI基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組由如下引物組成正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示；步驟5:將所述KSPI基因cDNA序列的中間片段、所述KSPI基因的3’端和5’端片段拼接，即得。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。
全文摘要
本發明涉及基因克隆領域，特別涉及青蝦Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子(Kazal-typeserineproteinaseinhibitor，KSPI)基因、其擴增方法及擴增引物組。利用本發明提供的引物組從青蝦精巢組織中克隆到了一種KSPI基因全長cDNA序列，對青蝦KSPI基因功能的研究奠定基礎，同時為甲殼類生殖研究積累背景資料。
文檔編號C12N15/12GK102367440SQ20111030377
公開日2012年3月7日 申請日期2011年10月10日 優先權日2011年10月10日
發明者喬慧, 傅洪拓, 張響, 蔣速飛 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心