專利名稱：白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法
技術領域：
本發明涉及食用菌雜種的鑒定方法，具體涉及白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法。
背景技術：
白靈菇是白靈側耳的商品名稱，又名翅鮑菇、白靈芝菇、克什米爾神菇等，其分布與新疆阿魏(/^rWa sinkiangensin K. M. Shen)的分布密切相關，僅分布在我國新疆的阿爾泰、托里、木壘、塔城等地有新疆阿魏生長的荒灘，分布海拔高度在720—1000m，其基因資源有限。杏鮑菇iPleurotus eiyngii (DC. :Fr.) Qu6l)發生于傘形花科刺芹屬，刺芹枯死的植株上，在我國新疆、青海、四川西部有自然分布，基因資源較白靈菇豐富。白靈菇和杏鮑菇不僅有很高的營養價值，口感風味好，而且還有很高的藥用價值， 市場前景廣闊。但白靈菇的組織致密性、口感、朵形顏色優于杏鮑菇，而風味、生長周期、生物轉化率和生產管理條件劣于杏鮑菇，因此，可以應用生物技術將兩者的基因融合在一起， 從而獲得具有白靈菇與杏鮑菇特性的雜交種，篩選出優良的雜交種，增加市場上白靈菇的品種，促進白靈菇產業的發展。為了快速篩選白靈菇與杏鮑菇的雜交種，有必要探索鑒定白靈菇與杏鮑菇雜交種的真偽。

發明內容
鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法，為有效鑒定白靈菇與杏鮑菇雜交種的真偽提供便捷的方法，進而在白靈菇與杏鮑菇的雜種中篩選出優良的雜交種，從而縮短白靈菇的育種進程。 。為了實現上述目的，本發明的技術方案是本發明的白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法，包括白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質體制備、原生質體融合、菌絲的培養與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴增、特異酶切片段標記的產生和酶切產物的電泳檢測；其特征在于
1、特異酶切片段標記的產生在8 12μ L ITS-PCR擴增產物，加入2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer，0. 8 1. 2 μ L Eco0109I 酶，5 9. 8 μ L ddH20，37°C水浴 4 7 h ；所述 Eco0109I 酶的酶切 Buffer 成份為 100mmol/L Tris-HCl, ρΗ7· 5，1 OOmmo 1/L MgCl2, 10 mmol/L Dithiothreitol ；
2、酶切產物的電泳檢測取Eco0109I酶的酶切產物15μ L，與3 μ L上樣緩沖液混勻， 點樣于1. 的瓊脂糖凝膠上，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；經電泳檢測，在一個泳道上只有同時出現分子量為675 685bp、4;35 445 bp和235 M5bp的DNA標記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標記；所述上樣緩沖液0. 溴酚藍，40%蔗糖。本發明具有以下優點本發明的白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法，具有檢測時間短、準確性高、容易判斷、穩定性好等優點。
1、檢測時間短該檢測所需時間短，一般只需要10 15天，比通過出菇獲得子實體形態鑒定至少省40天以上。2、準確性高、穩定性好本發明以基因組DNA為材料，DNA是穩定的遺傳物質，是區分物種的本質表現所在，而DNA序列中的保守序列更是穩定，是物種長期進化的分子標記， 不易受外界因素等的影響，因此以保守序列開發的鑒定技術準確性高，穩定性好。3、專一性強本發明充分利用酶的專一性和高效性，且本發明使用的酶對白靈菇和杏鮑菇的雜種具有特異性，產生特異識別性的標記片段，非此雜種得不到這種效果。4、容易判斷本發明的判斷依據是在瓊脂糖電泳上出現的特異DNA標記條帶，DNA 標記條帶少、清晰，一目了然。


圖1為Eco0109I酶的酶切電泳圖；其中，M 3為泳道編號；左側的數字和右側的數字表示DNA片段的分子量。圖1中，1 3泳道分子量為678bp，440 bp和237 bp的DNA 標記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標記。
具體實施例方式下面實施例對本發明做進一步的闡述。一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法，包括以下步驟
1、白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質體制備、原生質體融合 選取優質、高產的白靈菇菌株和杏鮑菇菌株作為雜交親本；
白靈菇單孢菌株原生質體制備用PDA斜面培養基活化白靈菇單孢菌株，轉接于含 IOOmL PDA液體培養基的250 mL廣口三角瓶中，25°C靜置培養6 7d，用移液槍取5 7 mL培養液于含IOOmL PDA液體培養基的250 mL廣口三角瓶中，25°C靜置培養6 7d，挑取 0. 3 0. 6g幼嫩菌絲放入5mL離心管內，5000r/min離心lOmin，倒棄離心出來的液體，在 5mL離心管內加入300ul溶壁酶酶液，置觀 30°C水浴鍋中酶解2 2.證，用塞有棉花的注射器過濾酶解液，得到白靈菇單孢菌株原生質體；
杏鮑菇雙核菌株原生質體制備用PDA斜面培養基活化杏鮑菇雙核菌株，余下步驟同白靈菇單孢菌株原生質體制備；
將制備好的白靈菇單孢菌株的原生質體倒入直徑為90mm的平皿在距紫外燈15cm處照射20min，把制備好的杏鮑菇雙核菌株的原生質體于50°C水浴20min;把白靈菇單孢菌株和杏鮑菇雙核菌株的原生質體以體積比為1 1的比例混合，再將混合液與融合劑以體積比為1 1的比例混合，30°C水浴15min，加入7-8倍體積的0. 6mol/L甘露醇稀釋，取其IOOul 涂布在再生培養基上，靜置培養7-10d，挑起再生菌落由步驟2繼續培養；所述白靈菇菌株和杏鮑菇菌株均從市場上購得；
2、菌絲培養和收集
(1)將步驟1獲得的再生菌株轉接含IOOmLPDA液體培養基的250 mL廣口三角瓶中；
(2)放置在25°C搖床上，轉速90 130r/min培養7 10 d ；
(3)用紗布過濾培養好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；
(4)稱取0.5 1. 3g菌絲，用濾紙包好，保存于_20°C備用。
3、CTAB法提取基因組DNA
(1)取步驟2(4)保存備用的菌絲0. 5 1. 3g放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉入7mL的離心管；
(2)加2.5 mL 65°C預熱的抽提液，同時加入50 μ L巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質變性沉淀；
(3)65°C水浴lh，每隔IOmin振蕩1次；
(4)加入2.5 mL的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質；
(5)8000 r/min, 4°C離心 IOmin,取上清到 7mL 管；
(6)加1/5體積65°C預熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 mL的氯仿異戊醇混勻；
(7)10000r/min, 4°C離心 lOmin，取上清；
(8)加入2.5 mL 65°C預熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65°C水浴Ih ；
(9)12000r/min, 4°C離心IOmin后，去除上清液；
(10)用0.5mL TE溶液或無菌水溶解沉淀IOmin ；
(11)加入0.25mL飽和酚和0. 25mL氯仿異戊醇，混勻；
(12)12000r/min，4°C離心lOmin，取上清，加入2倍體積在4°C預冷的無水乙醇，混勻；
(13)放置-20°C冰箱Ih或過夜；
(14)12000 r/min，4°C離心 10 min，棄上清；
(15)自然風干沉淀，用30μ L TE溶液或無菌去離子水溶解沉淀，-20°C保存備用。4、ITS-PCR 擴增
ITS-PCR 擴增反應體系1 μ L 含量 50 100 ng 的 DNA，2.5 μ L IOXPCR buffer, 2 μ L 濃度為 2. 5 m mol/L 的 dNTP, 1 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 ITS1, ITSl 序列為 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3，，1 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 ITS4, ITS4 序列為 5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3',Ο. 3 μ L 酶活為 5 U/uL 的 iTaq DNA Polymerase, 17. 2 μ L ddH20。ITS-PCR擴增反應程序94°C預變性5 min ;94°C變性45 s，55°C退火45 s，72°C延伸1 min, 35個循環；72°C延伸10 min。5、特異酶切片段標記的產生
10 μ L ITS-PCR 擴增產物，2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer, 1 μ L Eco0109I 酶， 7μ L ddH20，37°C水浴 4h。6、酶切產物的電泳檢測
取Eco0109I酶的酶切產物15 yL，與3 μ L上樣緩沖液混勻，點樣于1.洲的瓊脂糖凝膠上，同時使用DL 2000的DNA MARK作為片段大小的參照，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/ cm電壓下電泳60—90 min，電泳結束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。電泳圖如圖1所示，1 3泳道顯示的分子量為678bp，440 bp和237 bp的DNA標記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種菌株的標志。我們利用本發明的方法，在數百個參加鑒定的菌株中，鑒定出白靈菇與杏鮑菇雜交菌株132個，最后篩選得到3個優良的白靈菇與杏鮑菇雜交菌株。本發明所使用的主要試劑如下(所有化學試劑均為分析純)
1、溶壁酶酶液0.6mol/L甘露醇，洲溶壁酶；
2、融合劑0.6mol/L 甘露醇，25% PEG, 1 OOnmo 1/L CaCl2 ；3、再生培養基20%馬鈴薯，2%葡萄糖，2%瓊脂，0.6mol/L甘露醇；
4、CTAB抽提液100mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB，20 mmol/L EDTA, 1. 4 mol/L NaCl, pH 8. 0;
5、CTAB沉淀液50 mmol/L Tris-HCl, 1. 0% CTAB，10 mmol/L EDTA, pH 8.0;
6、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
7、TE緩沖液10 mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA ；
8、0·5XTBE :44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3U mmol/L EDTA;
9、上樣緩沖液0.1%溴酚藍，40%蔗糖；
10、EB10 mg/mL 溴化乙錠；
IUPCR擴增試劑及酶均購自大連寶生物公司。本發明所使用的主要儀器如下
Sff-CJ-IFB型單人水平垂直兩用凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；
滅菌鍋上海三申；
HYG-A全溫搖瓶柜太倉市實驗室；
冷凍離心機Sigma 3K30 ；
PCR 擴增儀Eppendorf AG22331 Hamburg ；
掌型離心機江蘇海門市麒麟醫用儀器廠Lx-100手掌型離心機；
SDC-6節能型智能恒溫槽寧波新芝生物科技股份有限公司；
凝膠成像系統TAN0N-2008。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
權利要求
1. 一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法，包括白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質體制備、原生質體融合、菌絲的培養與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴增、特異酶切片段標記的產生和酶切產物的電泳檢測；其特征在于(1)特異酶切片段標記的產生在8 12μ L ITS-PCR擴增產物，加入2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer，0. 8 1. 2 μ L Eco0109I 酶，5 9. 8 μ L ddH20，37°C水浴 4 7 h ；所述 Eco0109I 酶的酶切 Buffer 成份為 100mmol/L Tris-HCl, ρΗ7· 5，1 OOmmo 1/L MgCl2, 10 mmol/L Dithiothreitol ；(2)酶切產物的電泳檢測取Eco0109I酶的酶切產物15μ L，與3 μ L上樣緩沖液混勻， 點樣于1. 的瓊脂糖凝膠上，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；經電泳檢測，在一個泳道上只有同時出現分子量為675 685bp、4;35 445 bp和235 M5bp的DNA標記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標記；所述上樣緩沖液0. 1%溴酚藍，40%蔗糖。
全文摘要
本發明涉及一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法，包括白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質體制備、原生質體融合、菌絲的培養與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴增、特異酶切片段標記的產生和酶切產物的電泳檢測。酶切產物的電泳檢測結果，在一個泳道上只有同時出現分子量為675～685bp、435～445bp和235～245bp的DNA標記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標記；本發明的白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標記鑒定方法，具有檢測時間短、準確性高、容易判斷、穩定性好等優點。
文檔編號C12Q1/04GK102312012SQ20111030604
公開日2012年1月11日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者劉新銳, 吳小平, 徐美玲, 朱堅, 江玉姬, 謝寶貴, 鄧優錦 申請人:福建農林大學