專利名稱：轉基因動物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體地涉及轉基因動物及其制備方法。更具體地涉及一組適于轉化細胞的載體、一種適于轉化細胞的載體、一種制備轉基因細胞的方法、一種非人轉基因動物細胞、一種制備非人轉基因動物的方法、一種非人轉基因動物或其后代。
背景技術：
轉基因動物的安全性問題是當前最為重要的社會問題，安全的轉基因技術是轉基因生物品種安全的重要保障。轉基因動植物中的外源基因主要有兩大類，即目的基因和標記基因。標記基因是幫助對轉基因生物工程體進行篩選和鑒定的一類外源基因，它包括選擇標記基因和報告基因。在選擇壓力下，不含標記基因及其產物的非轉化細胞和組織死亡， 而轉化細胞由于有抗性，可以繼續存活，因而有利于從大量的非轉化細胞和組織中選擇出轉化克隆。在制備轉基因動物時，引入標記基因主要是方便轉基因陽性材料的篩選。轉基因一旦成功后，選擇標記基因便不再發揮作用，反而變成了潛在的危險。選擇性標記基因引起的最大的爭議就是轉基因逃逸問題，即導入的標記基因與其野生近緣種等非目標生物間的基因流動，從而有可能破壞整個生態系統；另外一個擔憂是選擇性標記基因編碼產物的毒性，可能影響機體的健康；最后，抗性標記基因以及原核序列還會影響目的基因的表達， 有可能導致表達的沉默。然而，目前的制備轉基因動物的方法仍有待改進。

發明內容
本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。根據本發明的第一方面，本發明提出了一組適于轉化細胞的載體。根據本發明的實施例，所述的一組適于轉化細胞的載體包括第一載體，所述第一載體包含附著子序列； 以及第二載體，所述第二載體包含目的核酸序列。由于第一載體和第二載體中分別包含附著子序列和目的核酸序列，因而附著子序列可以促進目的核酸序列整合到宿主細胞的染色體中，而同時由于附著子序列自身不會與染色體發生整合，因而最終得到的宿主細胞的染色體中不會含有附著子序列，因而最終獲得的轉基因細胞的基因組中僅僅包含有外來的目的核酸序列，而不存在附著子序列，由此可以有效地構建無標記的轉基因細胞。根據本發明的實施例，上述一組適于轉化細胞的載體還可以具有下列附加技術特征根據本發明的一個實施例，所述附著子序列包含編碼染色體骨架結合區和/或核基質附著區的核酸序列。由此，利用該附著子序列，可以有效地將目的核酸序列定位于細胞核中，進而有效地促進目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合。根據本發明的一個實施例，所述第一載體進一步包括編碼復制起始點的核酸序列。根據本發明的具體示例，優選所述復制起始點為oriP。由此，利用復制起始點，附著子序列可以在宿主細胞內自主復制，從而提高目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合的概率。根據本發明的一個實施例，所述第一載體進一步包括編碼篩選標記的核酸序列。 由此，可以有效地篩選轉入第一載體的宿主細胞，提高制備轉基因細胞的效率。根據本發明的一些示例，所述篩選標記為選自編碼發光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種。根據本發明的具體示例，優選所述發光蛋白為選自GFP和EGFP的至少一種。根據本發明的具體示例，優選所述藥物抗性基因為選自新霉素磷酸轉移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。由此，可以方便地進行轉基因細胞的篩選，進一步提高制備轉基因細胞的效率。根據本發明的一個實施例，所述第二載體進一步包含啟動子，所述啟動子與所述目的核酸序列可操作地連接。根據本發明的一些示例，優選所述啟動子為真核細胞啟動子。 根據本發明的具體示例，更優選所述真核細胞啟動子為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種。根據本發明的一個具體示例，最優選所述真核細胞啟動子為CAG啟動子。由此，可以提高目的核酸序列在宿主細胞中的表達效率。根據本發明的一個實施例，所述真核細胞啟動子為組織特異性啟動子。由此，可以根據宿主細胞的類型，選擇適當的啟動子，從而獲得能夠實現目的核酸序列的組織特異性表達。根據本發明的一個實施例，所述第二載體進一步包含增強子序列，所述增強子序列與所述目的核酸序列可操作地連接。根據本發明的一些示例，優選所述增強子為CHS4增強子。由此，可以進一步提高目的核酸序列在宿主細胞中的表達效率。根據本發明的一個實施例，所述目的核酸序列的兩端分別具有適于同源重組的核酸序列。由此，可以提高目的核酸序列與宿主細胞染色體發生整合的概率。根據本發明的一些示例，優選所述適于同源重組的核酸序列為細胞基因組中的非功能片段。由此，在提高目的核酸序列與宿主細胞染色體發生整合的概率的同時，目的核酸序列的引入并不影響宿主細胞正常基因的表達和功能。根據本發明第二方面，本發明提出了一種適于轉化細胞的載體。根據本發明的實施例，該載體包含附著子序列。利用該載體，可以促進目的核酸序列整合到宿主細胞的染色體中，而同時由于附著子序列自身不會與染色體發生整合，因而最終獲得的轉基因細胞的基因組中僅僅包含有外來的目的核酸序列，而不存在附著子序列，由此可以有效地構建無標記的轉基因細胞。根據本發明的實施例，上述適于轉化細胞的載體還可以具有下列附加技術特征根據本發明的一個實施例，所述附著子序列包含編碼染色體骨架結合區和/或核基質附著區的核酸序列。由此，利用該附著子序列，可以有效地將目的核酸序列定位于細胞核中，進而有效地促進目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合。根據本發明的一個實施例，所述載體進一步包括編碼復制起始點的核酸序列。根據本發明的具體示例，優選所述復制起始點為oriP。由此，利用復制起始點，附著子序列可以在宿主細胞內自主復制，從而提高目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合的概率。根據本發明的一個實施例，所述載體進一步包括編碼篩選標記的核酸序列。由此， 可以有效地篩選轉入載體的宿主細胞，提高制備轉基因細胞的效率。根據本發明的一些示例，所述篩選標記為選自編碼發光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種。根據本發明的具體示例，優選所述發光蛋白為選自GFP和EGFP的至少一種。根據本發明的具體示例，優選
5所述藥物抗性基因為選自新霉素磷酸轉移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。由此，可以方便地進行轉基因細胞的篩選，進一步提高制備轉基因細胞的效率。根據本發明的第三方面，本發明提出了一種制備轉基因細胞的方法。根據本發明的實施例，該制備轉基因細胞的方法包括以下步驟使用前面所述的一組適于轉化細胞的載體轉化宿主細胞，以便獲得轉基因細胞；以及分離轉基因細胞，其中所述轉基因細胞的染色體中含有所述目的核酸序列。如前所述，由于第一載體和第二載體中分別包含附著子序列和目的核酸序列，因而附著子序列可以促進目的核酸序列整合到宿主細胞的染色體中， 而同時由于附著子序列自身不會與染色體發生整合，因而最終得到的宿主細胞的染色體中不會含有附著子序列，因而最終獲得的轉基因細胞的基因組中僅僅包含有外來的目的核酸序列，而不存在附著子序列，由此可以有效地構建無標記的轉基因細胞。根據本發明的實施例，上述制備轉基因細胞的方法還可以具有下列附加技術特征根據本發明的一個實施例，所述宿主細胞為真核細胞。根據本發明的一些示例，優選所述真核細胞為動物細胞，所述動物細胞為來自于選自人、牛、羊、豬和兔的至少一種的體細胞。本申請的發明人驚奇地發現，根據本發明的實施例的制備轉基因細胞的方法，特別適合于制備真核轉基因細胞，尤其是動物細胞。當應用于選自人、牛、羊、豬和兔的至少一種的體細胞時，所得到的轉基因細胞，可以通過手工克隆的方法應用于制備轉基因動物。根據本發明的一個實施例，利用所述第一載體和所述第二載體共轉化所述宿主細胞。根據本發明的一些示例，優選通過脂質體法進行所述共轉化。由此，可以提高將第一載體和第二載體引入宿主細胞中的效率。根據本發明的一個實施例，進一步包括通過PCR方法驗證所述轉基因細胞的基因組中含有所述目的核酸序列的步驟。由此，可以方便地篩選目的核酸序列與宿主細胞的染色體成功地發生整合的轉基因細胞，由此，進一步提高制備轉基因細胞的效率。根據本發明的第四方面，本發明提出了一種非人轉基因動物細胞或其培養物。根據本發明的實施例，所述非人轉基因動物細胞是根據上面所述的制備轉基因細胞的方法獲得的。由此，該非人轉基因動物細胞或其培養物的基因組中并不包含標記基因，由此，不會對轉基因細胞的正常運轉造成不利影響。根據本發明的第五方面，本發明提出了一種制備非人轉基因動物的方法。根據本發明的實施例，該制備非人轉基因動物的方法包括以下步驟提取前面所述非人轉基因動物細胞或其培養物的細胞核；將所述細胞核引入所述動物的無核卵母細胞中，以便獲得融合卵母細胞；將所述融合卵母細胞在適宜的條件下進行培養，以便獲得所述非人轉基因動物。由此，可以有效地獲得非人轉基因動物，同時，所獲得的非人轉基因動物的染色體中不含標記基因，從而不會影響動物個體自身的正常運轉。根據本發明的實施例，上述制備非人轉基因動物的方法還可以具有下列附加技術特征根據本發明的一個實施例，所述無核卵母細胞是通過手工克隆方法去除卵子中的遺傳物質而獲得的。由此，可以提高獲得無核卵母細胞的效率，并且能夠提高接受外源細胞核的效率。根據本發明的第五方面，本發明提出了一種非人轉基因動物或其后代。根據本發
6明的實施例，所述非人轉基因動物是根據前面所述的制備非人轉基因動物的方法獲得的。 由此，根據本發明實施例的非人轉基因動物的染色體中不含標記基因，從而不會影響動物個體自身的正常運轉。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。


本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1顯示了根據本發明實施例的一種構建轉基因動物的流程示意圖；圖2顯示了根據本發明實施例的附著子載體的示意圖；圖3顯示了根據本發明實施例的表達載體的示意圖；圖4顯示了根據本發明實施3，細胞開始篩選后第2天、5天、8天的圖片。圖5顯示了根據本發明實施例3，PK15細胞單克隆圖片(陽性細胞帶有綠色熒光)。圖6顯示了根據本發明實施例3，成纖維細胞單克隆圖片(陽性細胞帶有綠色熒光)。圖7顯示了根據本發明實施例3，陽性細胞附著子質粒鑒定圖片(附著子未丟失)。圖8顯示了根據本發明實施例3的陽性細胞附著子質粒鑒定圖片(附著子已丟失)。圖9顯示了根據本發明實施例7的囊胚發育情況。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。如果沒有特別說明，在本文中所使用的術語均是本領域技術人員通常所理解的含義。在本發明中所使用的術語“第一”、“第二”僅僅是為了方便區分不同的成分，而不能以任何方式理解為重要性或其他方面的區別。一組適于轉化細胞的載體根據本發明的第一方面，本發明提出了一組適于轉化細胞的載體。根據本發明的實施例，這一組適于轉化細胞的載體包括第一載體和第二載體。根據本發明的實施例，第一載體包含附著子序列，第一載體有時也可以被稱為附著子載體。第二載體包含目的核酸序列，第二載體有時也可以稱為表達載體。在本文中所使用的術語“附著子序列”是指能夠促進目的核酸序列在宿主細胞的細胞核中定位，從而促進目的核酸序列與宿主細胞染色體發生整合。附著子序列本身并不與宿主細胞染色體發生整合，并且會隨著細胞的增殖而逐漸丟失。因而，由于第一載體和第二載體中分別包含附著子序列和目的核酸序列，因而附著子序列可以促進目的核酸序列整合到宿主細胞的染色體中，而同時由于附著子序列自身不會與染色體發生整合，因而最終得到的宿主細胞的染色體中不會含有附著子序列，因而最終獲得的轉基因細胞的基因組中僅僅包含有外來的目的核酸序列，而不存在附著子序列， 由此可以有效地構建無標記的轉基因細胞。這里所使用的術語“目的核酸序列”應作廣義理解，既可以是具有基因功能的核酸片段，也可以是為調節宿主細胞其他功能所需要的核酸片段例如啟動子、增強子、沉默子等。這里所使用的術語“載體”應作廣義理解，其可以是任何能夠將核酸序列引入宿主細胞內的媒介，包括但不限于質粒、粘粒、病毒、人工染色體寸寸。根據本發明的一些實施例，附著子序列的類型并不受特別限制。根據本發明的一個實施例，所采用的附著子序列包含編碼染色體骨架結合區和/或核基質附著區的核酸序列。由此，利用該附著子序列，可以通過附著子與染色體骨架結合，或者與核基質結合，從而有效地將目的核酸序列定位于細胞核中，進而有效地促進目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合。更優選包含編碼EBNAl和/或核基質附著區的核酸序列，可選地所述染色體骨架結合區是EBNA1。本申請的發明人驚奇地發現，當采用EBNAl作為附著子時，能夠極大地提高構建無標記轉基因細胞/動物的效率。為了便于利用這些載體轉化宿主細胞，第一載體和第二載體還可以分別具有其他的元件，以賦予其附加的功能和效果。根據本發明的一個實施例，第一載體可以進一步包括編碼復制起始點的核酸序列。根據本發明的具體示例，優選所述復制起始點為oriP。由此，利用復制起始點，附著子序列可以在宿主細胞內自主復制，從而提高目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合的概率。本申請的發明人發現，當附著子序列與oriP相連時，所構建的載體在宿主細胞內能夠十分有效地自主復制，可以顯著提高目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合的概率。根據本發明的一個實施例，第一載體可以進一步包括編碼篩選標記的核酸序列。 由此，可以有效地篩選轉入第一載體的宿主細胞，提高制備轉基因細胞的效率。根據本發明的示例，篩選標記的類型并不受特別限制。根據本發明的一些示例，篩選標記可以為選自編碼發光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種。由此，可以非常容易地篩選已經引入第一載體的宿主細胞，例如通過檢測發光強度和在培養基中添加相應的藥物。根據本發明的具體示例，發光蛋白可以為選自GFP和EGFP的至少一種。由此，可以通過檢測所發出的綠色熒光，來篩選和驗證第一載體已經成功地被引入到宿主細胞中。根據本發明的具體示例，所述藥物抗性基因為選自新霉素磷酸轉移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。由此，可以通過在培養基中添加相應的抗生素，在培養后存活下來的細胞即為含有第一載體的宿主細胞。 由此，可以方便地進行轉基因細胞的篩選，進一步提高制備轉基因細胞的效率。根據本發明的一個實施例，第二載體可以進一步包含啟動子，啟動子可以與所述目的核酸序列可操作地連接。這里所使用的術語“連接”應作廣義理解，可以為直接相連，也可以為通過媒介間接相連。“可操作的連接”的意思是指，啟動子能夠發揮其正常生物學功能，從而影響目的核酸序列的表達。根據本發明的實施例，可以采用的啟動子的類型不受特別限制。根據本發明的一些示例，所述啟動子可以為真核細胞啟動子。由此，可以將第一載體和第二載體應用于轉化真核細胞。根據本發明的具體示例，更優選所述真核細胞啟動子為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種。根據本發明的一個具體示例，最優選所述真核細胞啟動子為CAG啟動子。由此，可以提高目的核酸序列在宿主細胞中的表達效率。發明人驚奇地發現，當采用CAG啟動子時，能夠顯著地提高目的核酸序列在宿主細胞中的表達。 根據本發明的其他實施例，所述真核細胞啟動子為組織特異性啟動子。由此，可以根據宿主細胞的類型，選擇適當的啟動子，從而獲得能夠實現目的核酸序列的組織特異性表達。根據本發明的一個實施例，第二載體可以進一步包含增強子序列，其中，增強子序列與目的核酸序列可操作地連接。由此，可以進一步提高目的核酸序列在宿主細胞中的表達效率。根據本發明的實施例，增強子的類型不受特別限制。根據本發明的一些示例，增強子為CHS4增強子。發明人驚奇地發現，當采用CHS4增強子時，能夠顯著地提高目的核酸序列在宿主細胞中的表達。根據本發明的一個實施例，目的核酸序列的兩端分別具有適于同源重組的核酸序列。由此，可以提高目的核酸序列與宿主細胞染色體發生整合的概率。根據本發明的實施例，適于同源重組的核酸序列的類型不受特別限制。根據本發明的一些示例，優選所述適于同源重組的核酸序列為細胞基因組中的非功能片段。由此，在提高目的核酸序列與宿主細胞染色體發生整合的概率的同時，目的核酸序列的引入并不影響宿主細胞正常基因的表達和功能。附著子載體根據本發明第二方面，本發明提出了一種適于轉化細胞的載體。根據本發明的實施例，該載體包含附著子序列。因而，在本發明中，該載體也可以稱為附著子載體。利用附著子載體，可以促進目的核酸序列整合到宿主細胞的染色體中，而同時由于附著子序列自身不會與染色體發生整合，因而最終獲得的轉基因細胞的基因組中僅僅包含有外來的目的核酸序列，而不存在附著子序列，由此可以有效地構建無標記的轉基因細胞。這里所使用的術語“載體”應作廣義理解，其可以是任何能夠將核酸序列引入宿主細胞內的媒介，包括但不限于質粒、粘粒、病毒、人工染色體等等。根據本發明的一些實施例，附著子序列的類型并不受特別限制。根據本發明的一個實施例，所采用的附著子序列包含編碼染色體骨架結合區和/或核基質附著區的核酸序列。由此，利用該附著子序列，可以通過附著子與染色體骨架結合，或者與核基質結合，從而有效地將目的核酸序列定位于細胞核中，進而有效地促進目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合。更優選包含編碼EBNAl和/或核基質附著區的核酸序列，可選地所述染色體骨架結合區是EBNA1。本申請的發明人驚奇地發現，當采用EBNAl作為附著子時，能夠極大地提高構建無標記轉基因細胞/動物的效率。為了便于利用這些載體轉化宿主細胞，附著子載體還可以具有其他的元件，以賦予其附加的功能和效果。根據本發明的一個實施例，附著子載體可以進一步包括編碼復制起始點的核酸序列。根據本發明的具體示例，優選所述復制起始點為oriP。由此，利用復制起始點，附著子序列可以在宿主細胞內自主復制，從而提高目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合的概率。本申請的發明人發現，當附著子序列與oriP相連時，所構建的載體在宿主細胞內能夠十分有效地自主復制，可以顯著提高目的核酸序列與宿主細胞的染色體發生整合的概率。根據本發明的一個實施例，附著子載體體可以進一步包括編碼篩選標記的核酸序列。由此，可以有效地篩選轉入附著子載體的宿主細胞，提高制備轉基因細胞的效率。根據本發明的示例，篩選標記的類型并不受特別限制。根據本發明的一些示例，篩選標記可以為選自編碼發光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種。由此，可以非常容易地篩選已經引入附著子載體的宿主細胞，例如通過檢測發光強度和在培養基中添加相應的藥物。根據本發明的具體示例，發光蛋白可以為選自GFP和EGFP的至少一種。由此，可以通過檢測所發出的綠色熒光，來篩選和驗證附著子載體已經成功地被引入到宿主細胞中。根據本發明的具體示例，所述藥物抗性基因為選自新霉素磷酸轉移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。由此，可以通過在培養基中添加相應的抗生素，在培養后存活下來的細胞即為含有附著子載體的宿主細胞。由此，可以方便地進行轉基因細胞的篩選，進一步提高制備轉基因細胞的效率。轉基因細胞/動物及其制備方法根據本發明的第三方面，本發明提出了一種利用上面所述的載體制備轉基因細胞的方法。該制備轉基因細胞的方法包括以下步驟首先，使用前面所述的一組適于轉化細胞的載體轉化宿主細胞，以便獲得轉基因細胞。即可以采用第一載體(附著子載體)和第二載體(表達載體)轉化宿主細胞，由此可以將附著子載體和表達載體引入到細胞中。根據本發明的實施例，附著子載體和表達載體被引入到細胞中的順序不受特別限制，可以是同時被引入到細胞中，也可以是依次引入到細胞中，既可以先引入表達載體，也可以先引入附著子載體。根據本發明的實施例，宿主細胞的類型不受特別限制。根據本發明的一個實施例，所采用的宿主細胞為真核細胞。根據本發明的一些示例，優選真核細胞為動物細胞。更優選來自于選自人、牛、羊、豬和兔的至少一種的體細胞。本申請的發明人驚奇地發現，根據本發明的實施例的制備轉基因細胞的方法，特別適合于制備真核轉基因細胞，尤其是動物細胞。當應用于選自人、牛、羊、豬和兔的至少一種的體細胞時，所得到的轉基因細胞，可以通過手工克隆的方法應用于制備轉基因動物。根據本發明的一些具體示例，利用所述第一載體和所述第二載體共轉化所述宿主細胞，即可以將附著子載體和表達載體同時引入到宿主細胞中。實現共轉化的方法也不受特別限制，根據本發明的一些示例，可以通過脂質體法進行所述共轉化。由此，可以提高將第一載體和第二載體同時引入宿主細胞中的效率。由此，可以方便地篩選目的核酸序列與宿主細胞的染色體成功地發生整合的轉基因細胞，由此，進一步提高制備轉基因細胞的效率。 需要說明的是，在本文中所使用的術語“轉化”與“轉染”是可以互換使用的，均是指將外源核酸序列弓I入宿主細胞中的操作。接下來，分離轉基因細胞，即染色體中含有所述目的核酸序列的轉基因細胞。如前所述，由于第一載體和第二載體中分別包含附著子序列和目的核酸序列，因而附著子序列可以促進目的核酸序列整合到宿主細胞的染色體中，而同時由于附著子序列自身不會與染色體發生整合，因而最終得到的宿主細胞的染色體中不會含有附著子序列，因而最終獲得的轉基因細胞的基因組中僅僅包含有外來的目的核酸序列，而不存在附著子序列，由此可以有效地構建無標記的轉基因細胞。在分離轉基因細胞后，可以通過PCR方法驗證所述轉基因細胞的基因組中含有目的核酸序列。當然也可以通過分析目的核酸序列表達蛋白的酶活性來驗證。但從效率角度來考慮，優選通過PCR方法驗證，因而，根據本發明的實施例，還進一步包括了通過PCR方法驗證所述轉基因細胞的基因組中含有所述目的核酸序列的步驟。該方法不僅在時間上、效率上、工作量上都較其他方法有很大的改進，可用于各類型無標記轉基因細胞株制備、制備無標記轉基因克隆動物等。
根據本發明的第四方面，本發明提出了一種轉基因動物細胞或其培養物。根據本發明的實施例，轉基因動物細胞是根據上面所述的制備轉基因細胞的方法獲得的。優選，所述動物為非人動物。正如上面所述的，該轉基因動物細胞或其培養物的基因組中并不包含標記基因，由此，不會對轉基因細胞的正常運轉造成不利影響，也不存在額外的關于生物安全性的考慮。根據本發明的第五方面，本發明提出了一種制備非人轉基因動物的方法。根據本發明的實施例，該制備非人轉基因動物的方法包括以下步驟首先，提取非人轉基因動物細胞或其培養物的細胞核。本領域技術人員可以理解， 能夠采用任何已知的方法提取單細胞的細胞核，例如通過顯微操作人工提取。根據本發明的實施例，所采用的細胞是基于前述方法所得到的無標記的細胞(在本發明中，篩選標記有時也簡單地稱為標記)。接著，將所提取的細胞核引入所述動物的無核卵母細胞中，以便獲得融合卵母細胞。根據本發明的實施例，無核卵母細胞的來源并不受特別限制。根據本發明的一個實施例，所述無核卵母細胞是通過手工克隆方法去除卵子中的遺傳物質而獲得的。由此，可以提高獲得無核卵母細胞的效率，并且能夠提高接受外源細胞核的效率。最后，將融合卵母細胞在適宜的條件下進行培養，以便獲得所述非人轉基因動物。 本領域技術人員可以理解，能夠采用常規的方法，從卵母細胞獲得動物個體，例如首先將卵母細胞培養獲得囊胚，進一步將囊胚植入母體中進行發育，獲得動物個體。因而，這里所使用的術語“培養”應作廣義理解，其涵蓋了從卵母細胞獲得動物個體過程中所經歷的各種為細胞/細胞集合體提供能量的操作。由此，可以有效地獲得非人轉基因動物，同時，所獲得的非人轉基因動物的染色體中不含標記基因，從而不會影響動物個體自身的正常運轉，也不存在額外的關于生物安全性的考慮。根據本發明的第五方面，本發明提出了一種非人轉基因動物或其后代。根據本發明的實施例，所述非人轉基因動物是根據前面所述的制備非人轉基因動物的方法獲得的。 由此，根據本發明實施例的非人轉基因動物的染色體中不含標記基因，從而不會影響動物個體自身的正常運轉，也不存在額外的關于生物安全性的考慮。綜上，根據本發明的實施例，本發明提供了一種可以通過將篩選標記構建在附著子質粒上，從而進行篩選細胞克隆方法，能夠避免外源基因例如原核序列整合到宿主細胞例如真核細胞染色體中。并且，在附著子載體隨著宿主細胞的分裂丟失后，篩選標記等具有附屬功能的元件也都會丟失，從而避免了篩選標記基因整合入真核基因組而帶來的潛在的危險，使外源目的核酸序列(在本發明中有時也稱為“目的基因”)的整合更加安全。這將為轉基因技術提供新的篩選途徑和實驗新思路。下面參考具體實施例，對本發明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發明的限制。若未特別指明，實施例中所采用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關產品進行，所采用的試劑和產品也均為可商業獲得的。一般方法
圖1顯示了實施例的一般方法。即1、構建附著子載體，從不同的質粒構建含有附著子序列和篩選基因的附著子載體。2、構建表達載體，從不同的質粒構建含有啟動子、增強子、目的基因片段的表達載體。3、載體共轉，將附著子載體和表達載體共轉染細胞。4、獲得陽性細胞克隆，利用附著子載體上面的篩選標記來篩選抗性細胞克隆。利用PCR技術鑒定陽性細胞克隆中附著子丟失情況。5、手工克隆方法生產轉基因克隆利用手工克隆方法，制備轉基因克隆胚胎，并移植，大規模生產轉基因克隆動物。6、克隆動物鑒定利用克隆動物的DNA和RNA檢測來鑒定克隆動物是否為帶有目的基因的轉基因豬。實施例1構建附著子載體合成引物，引物分別為Neo-F(SEQ ID NO 1) :ATGAGGATCGTTTCGCATGNeo-R(SEQ ID NO :2) TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG 利用上述引物，從商業化載體pEGFP-Nl上擴增出NEO (即新霉素磷酸轉移酶，其可以抵抗G418的殺傷作用)表達盒。其中，PCR條件為95"C 5min,(95°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin) X 30 個循環，72 °C 5min。PCR擴增產物大小為811bp。PCR擴增產物的兩端分別具有KpnI和HindIII酶切位點。利用相應的限制性內切酶對PCR產物進行消化之后，使用相同的限制性內切酶消化攜帶EBNAl的商業化載體pCEP4載體，將經過消化的PCR產物與經過消化的pCEP4載體通過連接酶按照下面的連接條件進行連接連接體系為如下10 X T4連接酶緩沖液 1 μ 1，酶切pCEP4 載體2 μ 1，酶切PCR 產物5μ1，H2O2 μ 1。在16°C進行連接反應4小時。最后，構建獲得了攜帶EBNAl的附著子載體 pEBNA-NEO，所構建的附著子載體的結構示意圖如圖2所示。實施例2表達載體構建合成引物，引物序列為EGFP-Fl(SEQ ID NO 3) :ATGGTGAGCAAGGGCGAGEGFP-Rl(SEQ ID NO :4) :CAACTAGAATGCAGTGAAAAAAAT。利用上述引物，從商業化載體pEGFP-Nl上擴增出pEGFP_Nl載體上擴增EGFP基因 (增強型綠色熒光蛋白)。
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PCR產物的兩端分別具有EcoRI和BioI酶切位點。利用相應的限制性內切酶對 PCR產物進行消化之后，使用相同的限制性內切酶消化商業化載體pcDNA3. 1載體。將經過消化后的PCR產物與經過消化的pcDNA3. 1載體通過連接酶按照下面的連接條件進行連接構建得到PEGFP載體連接體系如下10XT4連接酶緩沖液1μ 1，酶切pcDNA3. 1 載體 2 μ 1，酶切PCR 產物5μ1，H2O 2 μ 1。在16°C進行連接反應4小時。合成引物，引物序列為CHS-Fl(SEQ ID NO 5) :GGAGCTCACGGGGACAGCCHS-Rl(SEQ ID NO :6) ' TCTCACTGACTCCGTCCTGG。利用上述引物，從雞DNA中擴增CHS4片段。PCR產物的兩端分別具有MfeI和MluI酶切位點。利用相應的限制性內切酶對PCR 產物進行消化之后，使用相同的限制性內切酶消化前面制備的構建體PEGFP載體。將經過消化后的PCR產物與經過消化的pEGFP載體通過連接酶按照下面的連接條件進行連接構建得到表達載體CHS-EGFP-CHS 連接如下10XT4連接酶緩沖液1μ 1，酶切pEGFP 載體 2μ1，酶切PCR 產物7μ1。在16°C進行連接反應4小時。設計引物重新擴增CHS4片段，引物兩端添加酶切位點，通過利用相應的限制性內切酶消化和jM連接酶，將CHS4片段-連接入pCHS-EGFP載體中，構建得到pCHS-EGFP-CHS 載體。酶切pCHS-EGFP-CHS載體，獲得CHS-EGFP-CHS表達盒。實施例3重組表達載體在細胞中的表達將前面所構建的附著子載體pEBNA-NEO和表達載體元件CHS-EGFP-CHS用脂質體法按照下列條件分別轉染入HQ5豬腎細胞和豬成纖維細胞中將2 μ g附著子載體ρ^ΝΑ-ΝΕΟ和表達載體元件CHS-EGFP-CHS，加入 100 μ Iopti-MEM培養基中，然后加入脂質體混合，室溫靜置20min，滴加入培養細胞的6cm
培養皿中。在轉染48小時后，在含有15% FBS的DMEM培養基中加入終濃度500 μ g/ml的 G418進行篩選，并觀察EGFP表達情況。直到在熒光顯微鏡下能夠觀察到EGFP能夠持續穩
定表達。實施例4驗證附著子載體在陽性細胞克隆中的丟失在利用G418篩選之后大約6天，開始出現細胞克隆(如圖4所示)。挑取熒光克隆改換用更換為不含G418的新鮮培養基繼續培養(如圖5和圖6所示)。培養2天后，提取細胞克隆的DNA進行PCR鑒定，之后，每次傳代均提取細胞DNA，分別鑒定EBNAl和Hygro
13片段。另外，根據下列實驗驗證附著子在陽性細胞克隆中缺失根據載體提供的EBNAl和Hygro序列，設計鑒定用PCR引物，對每次傳代的細胞 DNA做PCR分析。PCR擴增條件是95"C 5min,(95°C 30s, 60°C 30s,72°C lmin)X30 個循環，72 °C 5min。結果示于圖7和8中。如圖7所示，附著子載體仍然存在于陽性細胞中。但圖8 所示，確定附著子載體在經歷細胞增殖一段時間之后已經丟失。實施例5重組表達載體在豬成纖維細胞中的表達根據與實施例3相同的方法，利用附著子載體pEBNA-NEO和表達載體 CHS-EGFP-CHS轉染豬成纖維細胞，并且驗證EGFP的穩定表達。實施例6轉基因陽性細胞的篩選與鑒定按照與實施例4相同的方法，對實施例5中所得到豬成纖維細胞提取DNA和RNA， 鑒定是否有目的基因存在和表達。同時，鑒定EBNAl和Hygro片段丟失情況。結果顯示，EGFP在豬成纖維細胞有顯著表達，并且EBNAl和Hygro片段已經丟失。 由此，證明本發明的方法可以適用于多種動物體細胞。實施例7體細胞克隆制備無標記轉基因動物根據常規的手工克隆的方法，利用前面實施例中構建的轉基因成纖維細胞制備克隆豬，簡言之，手工克隆的步驟包括卵母細胞的采集和體外成熟，去除卵丘細胞，透明帶消化，去核，胞質與體細胞融合，電激活，體外培養至囊胚，移植胚胎。提供附著子載體丟失的細胞克隆做手工克隆，制備囊胚，待胚胎成熟后，移植至代孕母體內，待手工克隆豬出生。接下來，按照下列條件，通過直接觀察與PCR的方法，鑒定克隆豬為帶有目的基因即EGFP的轉基因豬首先在紫外燈下觀察是否有熒光；其次，取克隆豬的組織樣品，提取 DNA和RNA做PCR鑒定。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。
權利要求
1.一組適于轉化細胞的載體，其特征在于，包括 第一載體，所述第一載體包含附著子序列；以及第二載體，所述第二載體包含目的核酸序列， 其中，所述附著子序列優選包含編碼染色體骨架結合區和/或核基質附著區的核酸序列， 更優選包含編碼EBNAl和/或核基質附著區的核酸序列，可選地所述染色體骨架結合區是 EBNAl ；任選地，所述第一載體進一步包括編碼復制起始點的核酸序列，所述復制起始點優選為 oriP ；任選地，所述第一載體進一步包括編碼篩選標記的核酸序列，所述篩選標記優選為選自編碼發光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種，所述發光蛋白優選為選自GFP和EGFP 的至少一種，所述藥物抗性基因優選為選自新霉素磷酸轉移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種；任選地，所述第二載體進一步包含啟動子，所述啟動子與所述目的核酸序列可操作地連接，所述啟動子優選為真核細胞啟動子，所述真核細胞啟動子優選為選自CAG啟動子和 PGK啟動子的至少一種，可選地所述真核細胞啟動子為組織特異性啟動子；任選地，所述第二載體進一步包含增強子序列，所述增強子序列與所述目的核酸序列可操作地連接，所述增強子優選為CHS4增強子。
2.根據權利要求1所述的一組適于轉化細胞的載體，其特征在于，所述目的核酸序列的兩端分別具有適于同源重組的核酸序列，所述適于同源重組的核酸序列優選為細胞基因組中的非功能片段。
3.—種適于轉化細胞的載體，其特征在于，所述載體包含附著子序列， 其中，所述附著子序列優選包含編碼染色體骨架結合區和/或核基質附著區的核酸序列， 更優選包含編碼EBNAl和/或核基質附著區的核酸序列，可選地所述染色體骨架結合區是 EBNAl ；任選地，所述載體進一步包括編碼復制起始點的核酸序列，所述復制起始點優選為oriPo
4.根據權利要求3所述的適于轉化細胞的載體，其特征在于，所述載體進一步包括編碼篩選標記的核酸序列，所述篩選標記優選為選自編碼發光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種，所述發光蛋白優選為選自GFP和EGFP的至少一種，所述藥物抗性基因優選為選自新霉素磷酸轉移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。
5.一種制備轉基因細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟使用權利要求1或2所述的一組適于轉化細胞的載體轉化宿主細胞，以便獲得轉基因細胞，優選利用所述第一載體和所述第二載體共轉化所述宿主細胞，任選地通過脂質體法進行所述共轉化；以及分離轉基因細胞，其中，所述轉基因細胞的染色體中含有所述目的核酸序列。
6.根據權利要求5所述的制備轉基因細胞的方法，其特征在于，進一步包括 通過PCR方法驗證所述轉基因細胞的基因組中含有所述目的核酸序列的步驟。
7.—種轉基因動物細胞或其培養物，其中所述非人轉基因動物細胞或其培養物是根據權利要求5或6所述的方法獲得的，優選所述動物為非人動物。
8.一種制備非人轉基因動物的方法，其特征在于，包括以下步驟 提取權利要求7所述非人轉基因動物細胞或其培養物的細胞核； 將所述細胞核引入所述動物的無核卵母細胞中，以便獲得融合卵母細胞；將所述融合卵母細胞在適宜的條件下進行培養，以便獲得所述非人轉基因動物。
9.根據權利要求8所述的制備非人轉基因動物的方法，其特征在于， 所述無核卵母細胞是通過手工克隆方法去除卵子中的遺傳物質而獲得的。
10.一種非人轉基因動物或其后代，其中所述非人轉基因動物是根據權利要求8或9所述的方法獲得的。
全文摘要
本發明提供了一組適于轉化細胞的載體、適于轉化細胞的載體、制備轉基因細胞的方法、非人轉基因動物細胞、制備非人轉基因動物的方法、非人轉基因動物或其后代。根據本發明的實施例，所述的一組適于轉化細胞的載體包括第一載體，所述第一載體包含附著子序列；以及第二載體，所述第二載體包含目的核酸序列。利用這一組適于轉化細胞的載體，可以有效地構建無標記的轉基因細胞。
文檔編號C12N15/877GK102367454SQ20111030670
公開日2012年3月7日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者劉歡, 戰麗萍, 李勇, 杜玉濤, 楊煥明, 汪建, 王俊 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司