專利名稱：短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因及其植物表達載體與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，具體涉及短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因及其甲醛脫氫酶基因植物表達載體V^aidh及該基因在提高植物吸收和耐受甲醛能力強的轉基因植物中的應用。
背景技術：
甲醛是一種無色，有強烈刺激氣味的氣體，易溶于水、醇和醚。它反應能力極強， 能與蛋白質，核酸和脂類產生非特異性的反應(Feldman等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1973，13:1-49)，是一種非?；顫姷幕衔?，因此對所有的生物來說都有很高的毒性。 甲醛被廣泛用于工業生產中，是制造樹脂、膠粘劑、油漆、塑料、人造纖維的原料，是膠粘劑工業應用最廣泛的化學原材料。隨著經濟的發展和人民生活水平的提高，各種原料制成的建筑裝飾材料已走入各種室內公共場所和家庭，使甲醛成為室內空氣污染公認最具代表性的化學物質。人們入住新居都要進行室內裝飾和更新家具，其正是室內空氣甲醛污染的主要來源。甲醛污染危害嚴重的場所是居室、辦公室、會議室、賓館、KTV包房、家具商場、建材商場等。室內空氣中游離甲醛濃度在中國規定的允許值是0.08 (mg /立方米)，有調查表明新的賓館客房室內空氣中甲醛濃度最高達0. 36mg/立方米，平均為0. 173mg/立方米， 是室外對照的13倍。而家具商場最高達0. 873mg/立方米，平均為0. 432mg/立方米，是室外對照的33倍。建成一所經過裝飾的實驗室，空氣中甲醛平均濃度高達0. 5mg/立方米，是室外的62.5倍。抽樣檢測發現單位及住戶室內環境污染嚴重，查了 11家只有1戶合格，其中竟有1戶甲醛超標25倍。甲醛為較高毒性物質，當室內空氣中甲醛含量為0. Img/立方米時，就有異味和不適感；達到0.5 mg/立方米時，可刺激眼睛，引起流淚；達到0.6 mg/立方米時，可引起咽喉不適或疼痛。濃度更高時，可引起惡心嘔吐，咳嗽胸悶，氣喘甚至肺水腫；達到30 mg/ 立方米時，會立即致人死亡。長期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻煙癌、 結腸癌、腦瘤、月經紊亂、細胞核的基因突變，DNA單鏈內交連和DNA與蛋白質交連及抑制 DNA損傷的修復、妊娠綜合癥、引起新生兒染色體異常、白血病，這就是所謂的裝修綜合病 (sick-house)。相對于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TDI、VOC等有害物質來說，甲醛具有潛伏周期長(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發、治理難、危害大等特性。植物具有凈化空氣，改善環境的作用。已有研究表明外源甲醛能夠作為碳源被整合入植物光合細胞的代謝中。比如，普通的掛蘭在mC標記的甲醛上生長時通過一碳代謝產生mC標記的產物，如絲氨酸和卵磷脂。甲醛可以和谷胱苷肽，精氨酸，天冬酰氨和四氫葉酸形成加合物后通過不同的途徑進行代謝。對幾種真核生物的生化和遺傳學研究表明谷胱苷肽依賴型甲醛脫氫酶(FALDH)是甲醛代謝的關鍵酶之一。甲醛脫氫酶廣泛存在于微生物和植物體的所有組織中，它催化的反應以甲醛和谷胱苷肽的加合物硫代羥甲基谷胱苷肽(S-hydroxymethylglutathione)為底物產生硫代甲酰基谷胱苷肽(S-formylglutathione)。在植物中還有硫代甲酰谷胱苷肽水解酶，它能把^-formylglutathione分解為甲酸和谷胱苷肽。這兩個酶組成一條甲醛到甲酸的氧化途徑。 Achkor等人為了檢測甲醛脫氫酶的功能，對來源于擬南芥FALDH的基因進行遺傳操作，得到了不同FALDH水平的擬南芥轉基因株系。過量表達此酶的擬南芥對外源甲醛的攝取效率提高25%，FALDH水平降低的植物(由于共抑制表型或者反義表達)和野生型擬南芥相比， 甲醛脫毒速率顯著緩慢，能力下降。這些結果表明植物吸收甲醛的能力與FALDH活力水平相關(Achkor 等，Plant Physiol, 2003，132(4) 2248-2255)。綜上所述，高等植物都擁有甲醛代謝途徑，但其甲醛代謝關鍵酶在高等植物中表達水平較低，穩定性差，使植物無法應對外界環境中高濃度甲醛的脅迫，如何提高植物吸收耐受及代謝甲醛的能力就成為本領域的技術人員尤為關注的問題。很多研究結果說明來自耐熱性微生物的酶穩定性好，應用范圍廣，作用效果好。

發明內容
針對上述不足，本發明的目的是提供一種穩定性好，同時能提高植物吸收、代謝和耐受甲醛能力的短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因/WA序列及分離克隆該基因的引物序列，用該基因轉化植物，使之提高對甲醛的吸收、代謝和耐受能力，克服植物本身甲醛代謝關鍵酶表達水平較低，吸收代謝甲醛能力低的缺點。為了實現上述目的，本發明從耐熱甲基營養短芽孢桿菌iffreviBacillus brevis, 1.931)中克隆甲醛脫氫酶基因/WA，其編碼區由1134個堿基組成，具有序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。本發明的faldh基因編碼FALDH蛋白，它由377個氨基酸殘基組成，具有序列表SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。本發明的基因/WA在植物中表達的 FALDH蛋白可以提高其對甲醛的吸收、代謝和耐受性。本發明提供的上述基因序列是一種能氧化甲醛的新的甲醛脫氫酶基因，用該基因轉化植物，提高其甲醛吸收和代謝能力，并克服它們自身對甲醛耐受力低的缺點。本發明另一目的是提供甲醛脫氫酶基因的植物表達載體pK2-35S-/aA/A，所述載體含有甲醛脫氫酶/WA基因及卡那霉素篩選標記基因K2和組成型啟動子35S。本發明另一目的是將甲醛脫氫酶基因的植物表達載體VhHldh應用在制備吸收和耐受甲醛能力強的轉基因植物中。本發明更詳細的技術方案由下述描述揭示
1、在短芽孢桿菌1. 931菌株中進行/WA基因的克隆
本發明所提供的甲醛脫氫酶基因來源于耐熱甲基營養菌短芽孢桿菌，首先對相近微生物禾中(包括 Escherichia coli K-12, Paracoccus deni tr if leans, Pho tobac terium dams e Iae subsp. Piscicidaj Pichia ρ as tor is, Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1) 脫氫酶氨基酸序列比對找到氨基酸保守序列，根據該保守序列設計簡并引物擴增得到甲醛脫氫酶基因的部分核苷酸序列，然后將得到的部分核苷酸序列在GenBank中比對，根據同源性最高物種的核苷酸序列設計特異引物擴增得到全長基因的方法克隆得到，具體克隆方法如下
(1)從GenBank中查找相近物種甲醛脫氫酶基因的氨基酸序列，根據氨基酸保守序列設計序列如下的一對簡并引物
fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGAfid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC 以短芽孢桿菌基因組DNA為模板擴增，得到faldh基因的部分片段fid ；
(2)回收并純化/WA基因的部分片段/A/，并將其連接到PMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD-/7i/，將正確的重組質粒送測序公司測序；
(3)、將faldh基因的部分序列/7^/在NCBI上進行比對，根據同源性最高的短小芽孢桿 mBacillus pumiIus)的甲醛脫氫酶基因序列設計序列如下的一對特異性引物
fid 7 :GTGAGAGCTGTTACGTACCA fid 8 :TTATGGCTTTAAAATGACC
以短芽孢桿菌基因組DNA為模板擴增，得到faldh基因的全長片段；
(4)回收并純化faldh全長基因片段，并將其連接到PMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-T-/WA。測定重組質粒 PMD18-T-/WA所含的faldh序列，得到全長/WA基因核苷酸序列，并推測出該基因編碼蛋白質的氨基酸序列。利用DNAMAN軟件分析該基因全長1134bp，編碼377個氨基酸的蛋白質。2、植物表達載體pK2-35S_/WA的構建
(1)構建入門載體 pENTR-2B-/WA，用 BatnH I 禾Π Xho I 酶切 pMD18_T_/WA 和 PENTR2B (hvitrogen)，得到目的基因片段faldh和載體片段pENTR_2B，回收后進行連接、 轉化感受態細胞，通過酶切檢測獲得重組質粒PENTR-2B-/WA ；
(2 )構建植物表達載體pK2_35S-/WA，通過Gateway技術的LR反應把faldh基因亞克隆到植物表達載體PK2GW7中，通過酶切檢測獲得/WA基因的植物表達載體本發明的植物表達載體對那些能實施轉基因操作的植物都適用，如煙草、擬南芥、 矮牽牛、非洲菊等。在本發明的實施例中以煙草為例說明該表達載體的應用。Lfaldh基因轉化植物及轉基因植物的檢測
將構建好的植物表達載體pK2-35S-/aA/A轉入農桿菌(C58C1 (pPMP90))中，通過農桿菌介導轉化植物，篩選卡那霉素抗性植株。通過基因組PCR擴增檢測faldh是否插入植物基因組，通過RT-PCR分析檢測/WA基因在轉基因植物中的轉錄水平。選取轉基因株系葉片提取總蛋白，然后進行Western Blot分析檢測FALDH的表達水平。檢測結果轉基因株系中有/WA基因編碼的FALDH條帶，而野生型植物中沒有該條帶，說明FALDH已在轉基因植物中成功表達。4、轉基因植物的FALDH酶活性測定
從植物葉片中抽提可溶性蛋白，用Bradford方法測定植物上清中的蛋白質濃度，通過測定FALDH酶活性，結果表明轉基因植物酶活性比野生型植物提高約3 5倍左右。5、轉基因植物吸收甲醛的能力
取植物材料放入小三角瓶中，加入70ml甲醛處理液處理一定時間。測定處理液殘存甲醛濃度。實驗結果表明，轉基因植物吸收液體中甲醛的速率優于野生型。6、轉基因植物代謝液體和氣體甲醛的能力
將轉/WA基因植物和野生型植物無菌苗置于H13CHO處理液中，處理一定時間后，用無菌吸水紙吸干葉片表面殘留水分，液氮速凍植物材料并研磨成粉，轉移至離心管中離心獲得上清，轉移至核磁管中作13C-NMR分析。實驗結果說明通過轉基因表達的FALDH有氧化甲醛的能力，且穩定性好，能一直在植物中發揮作用。將H13CHO吸到一個小棉花團上，置入植物培養瓶中，通過棉花團上揮發出來的氣體甲醛處理轉基因植物和野生型植物，液氮速凍植物材料并研磨成粉，轉移至離心管中離心獲得上清，轉移上清至核磁管13C-NMR分析。實驗結果表明FALDH在轉基因植物中的過量表達使其吸收和代謝氣體甲醛的能力大大提高。7、轉基因植物對甲醛的抗性
稱量選取長勢良好，大小一致的植物組培苗分別轉移至含有不同濃度HCHO的MS基本培養基上培養一段時間后，觀察植物表型變化。結果說明FALDH的過量表達提高植物對于固體培養基中液體甲醛的抗性。上述實驗數據證明含有甲醛脫氫酶/WA基因的轉基因植物吸收液體甲醛的速率優于野生型；通過轉基因植物表達的FALDH蛋白有氧化甲醛的能力，且穩定性好，能一直在植物中發揮作用；FALDH蛋白在轉基因植物中的過量表達使其代謝氣體甲醛的能力大大提高；對甲醛的抗性增強，與野生型相比，在含有甲醛的培養上生長時轉基因株系的生長受甲醛的影響較小。


圖1是本發明faldh全長基因的克隆策略圖。圖2是本發明faldh基因部分DNA片段TA克隆pMD_/7i/的電泳檢測圖。A B.知eris基因組；B =PCR 擴增 faldh 基因部分 DNA 片段/7i/，M: Marker III ； 1-4 =PCR擴增產物；C 質粒pMD18-T-/WA電泳檢測，stopl 對照質粒-,fldl- fld6 ρΜ -fld 質粒；D 重組質粒 pMD18-T-/7i/ 的 PCR 檢測，MiMarkerIII ； 1-3 和 6-9 是以 pMD18-T-/7i/為模板擴增的PCR產物；4_5 負對照；E 重組質粒pMD18_T-/7i/雙酶切檢測， M: Marker III ； 1-3 為 Sacl ^PEcoRl 雙酶切 pMD18_T_ /7 /產物。圖3是本發明全長基因TA克隆pMD18-T-/WA的檢測。A -.B. brevis 基因組；Μ: Marker III -,B. brevis 基因組；B :PCR 擴增 faldh 基因全長片段，1-5是PCR擴增產物；M: Marker III ；C 質粒ρΜ)18~ ~falΛ電泳檢測，1-9 pMD Hfaldh質粒；對照對照質粒；D 重組質粒pMD Hfaldh的單雙酶切檢測， M: Marker III ；單為單酶切，雙為III和I雙酶切；E 重組質粒pMD18 - -faldh 的 PCR 檢測，1-2 擴增產物；Μ: Marker III。圖4是本發明入門載體pENTR-2B-/WA的構建策略圖。圖5是本發明入門載體PENTR-2B-/WA的電泳檢測圖。A :pENTR-2B-/a7i/A 質粒電泳檢測，1 4 :pENTR-2B_/WA，5 對照質粒 pENTR-2B-ccdB ； B -.BairMl ^WXhol 雙酶切檢測 pENTR-2B-/a/o% ；M :DNA Marker III ；1 -4 :pENTR-2B-/a7i/A 酶切質粒。圖6是本發明用faldh植物表達載體的構建策略圖。圖7是本發明faldh植物表達載體pK2-35S_/WA的檢測及其農桿菌轉化子菌落的檢測。其中A 電泳檢測重組質粒pK2-35S-/WA，1 =PK2Gff7, 2 4 :pK2-35S-/WA質粒樣品。B 酶切檢測重組質粒vhUfaldh, 1 原始質粒，2-4 成2Hfaldh酶切質粒樣品，M:DNA Marker III。C:菌落PCR檢測pK2-;35S-/WA的轉化效果，N:負對照(模板 % PK2Gff7 ) ； M: Marker III ；1 4:菌落 PCR 樣品。圖8是本發明faldh在轉基因煙草中的插入情況以及表達水平的檢測。A難faldh煙草基因組PCR擴增，WT:野生型煙草；1 9:轉基因煙草株系；M: DNA Marker III ；10:正對照(模板為 pK2_35S_/aA/A 質粒)。B 轉/aA/A 煙草RT-PCR擴增， M: Marker III ； 1-3 野生型煙草；4_6 轉基因煙草株系；7 正對照(模板為pK2-35S_/WA 質粒)；WT:野生型煙草；TT2，TT6，TT8 轉基因煙草株系。C 轉基因煙草flfestern Blot分析，CK -.B. brevis自然菌株總蛋白，TT-2 即轉/WA基因煙草2#株系，上樣量分別為25ng 和50ng，TT-6 即轉faldh基因煙草6#株系，上樣量為50ng，TT-8 即轉faldh基因煙草8# 株系，上樣量為50ng，K 無樣品(野生型WT-I飄溢蛋白)，WT-l，WT-2 即野生型煙草株系對照，上樣量為50ng。圖9是本發明FALDH在轉基因煙草中的酶活性測定分析圖，WT:野生型煙草，TT2， TT6, TT8 轉基因煙草株系。圖10是本發明轉基因煙草吸收液體甲醛(2mM)速率的測定分析圖，WT:野生型煙草；TT2, TT6，TT8 轉基因煙草株系。圖11是煙草代謝液體和氣體H13CHO能力的檢測圖，A 液體H13CHO在煙草中的代謝分析。處理時間如譜右端所表示，CK 未處理煙草，Ref 甲酰胺，WT-2h 野生型煙草處理 2h，TT-6-2h 轉faldh基因煙草處理2h，WT_48h 野生型煙草處理48h，TT_6_48h 轉faldh 基因煙草處理48h;
B 氣體H13CH0在煙草中的代謝分析。處理時間如譜右端所表示，CK 未處理煙草，Ref 馬來酸，WT-2h 野生型煙草處理2h，TT-6-2h 轉faldh基因煙草處理2h。圖12是本發明轉/WA基因煙草在含甲醛培養基上的生長狀況。A 轉基因煙草在2mM甲醛培養基上的生長狀況，WT:野生型煙草；TT_6:轉基因煙草；B 轉基因煙草在4mM甲醛培養基上的生長狀況；WT:野生型煙草；TT-6:轉基因煙草。C:不同濃度HCHO對轉基因煙草生物量的影響；WT:野生型煙草；TT-6:轉基因煙草。
下面結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
具體實施例方式本實施例中采用的試劑主要分為分子生物學實驗試劑、植物遺傳轉化所需的培養基以及轉基因植物鑒定和檢測所需的各種試劑。各種限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連)產品，質粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit購自invitrogen公司。其余試劑均為國產分析純。儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發明實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。 實施例1 -.faldh基因的克隆/WA基因的克隆策略如圖1所示。從GenBank中查找相近微生物種(包括fecAericAia coli K-12, Paracoccus denitrificans, Photobacterium damselae subsp. Piscicida, Pichia pas tor is, Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1)甲醛脫氫酶基因的氨基酸序列,根據氨基酸保守序列設計一對簡并引物，序列如下
fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGA fid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC 用下述方法提取基因組DNA 挑取生長良好的單菌落接種于LB液體培養基中于30°C 震蕩培養過夜；按1%接種量轉接到IOOml新鮮LB液體培養基中，于37 °C震蕩培養4h (0D_=2· 0),6000rpm/min離心收集菌體；加入1/10菌液體積的SI溶液(0. 3M Sucrose, 25 uM Tris-HCL (pH8. 0) 25mM EDTA)，混勻，37°C放置廣2h ；加入9/10菌液體積的SII溶液 (0. IM NaCl，0. 1% (ff/V)SDS, 0. IM Tris-HCl )，輕輕混勻；反復凍融裂解使溶液透明，加入等體積的Tris-飽和酚，抽提2次，取上清液；用等體積的氯仿/異戊醇(24 :1)抽提一次； 用1/10體積3M NaAC, 2倍體積無水乙醇沉淀DNA ； 12000rpm,離心5min，用70%乙醇洗滌沉淀，干燥備用；用適量含有RNaseA的水溶解，37°C放置Ih ；電泳檢測(圖2A)，-20°C保存備用。以基因組DNA為模板，用/7 / 3和/7 /4為引物進行PCR，擴增得到/WA基因的部分片段(約600bp，簡稱/7必(圖2Β)；回收并純化/WA基因的部分片段/A/，并將其連接到 PMD-18T (大連寶生物公司)載體上，轉化大腸桿菌感受態DH5 α (天根生化科技)，采用堿裂解法提取質粒DNA(圖2C)，經瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質粒做進一步的PCR檢測和雙酶切檢測。以重組質粒為模板，用引物/A/ 3和/7 /4擴增到0.61Λ 的PCR產物(圖2D )。根據陽性重組質粒pMD-/7i/載體兩端的多克隆位點，用I和雙酶切重組質粒，經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，連接成功的重組質粒pMD-/7i/酶切產物為2. 7kb和0. 6kb左右的條帶(圖2E)，將正確的重組質粒送測序公司測序；將/A/序列在NCBI上進行比對，根據同源性最高的短小芽孢桿菌OfeciBm pumiIus^的甲醛脫氫酶基因序列設計序列如下的一對特異性引物 fid 7 :GTGAGAGCTGTTACGTACCA fid 8 :TTATGGCTTTAAAATGACC
以短芽孢桿菌基因組DNA為模板PCR，擴增得到/WA基因的全長片段約1.21Λ(圖:3B); 回收并純化/WA全長基因片段，并將其連接到PMD-18T載體上(大連寶生物公司)，轉化大腸桿菌感受態DH5ci (天根生化科技)，采用堿裂解法提取質粒DNA(圖3C)，經瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質粒做進一步的PCR檢測和雙酶切檢測。根據陽性重組質粒PMD18-T-/WA載體兩端的多克隆位點，用單酶切和歷力(1111和&01 1雙酶切重組質粒，經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，連接成功的重組質粒PMD18-T-/WA 單酶切產物理論上為3.91Λ，雙酶切產物為2. 71Λ和1.21Λ左右的條帶(圖3D)。以重組質粒為模板，用引物/W 7和/7 / 8擴增到1.21Λ的PCR產物(圖3E)。測定重組質粒 PMD18-T-/WA積,faldh基因序列，得到全長/WA基因核苷酸序列，推測出該基因編碼蛋白質的氨基酸序列，見SEQ ID NO 1。通過分析該基因編碼的蛋白質，得知該基因的編碼區是3-1128bp，由377個氨基酸組成。
實施例2 構建入門載體pENTR-2B-/WA
入門載體PENTR-2B-/WA的構建如圖4所示。用Bamm和損οI 雙酶切PMD18-T-/WA和PENTR-2B*，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，分別回收PMD18-T-/WA被切割后產生的/WA基因片段(1. 2kb)和通路克隆(Gateway)的入門載體pENTR-2B*被切割后產生的載體片段pENTRT-2B*，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接PENTRT-2B*和faldh基因的DNA片斷產生入門載體pENTR-2B_/WA (圖4)。 用連接反應混合物轉化高效率(108)的大腸桿菌感受態細胞φΗδα，購自天根生化科技公司)，把轉化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50 μ g/ml)的平板上，于37 0C過夜培養，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質粒，選出連接成功的質粒載體 PENTR-2B-/WA，進行電泳檢測，其大小為4. 0 kb,已有質粒pENTR_2B*作為對照(圖5A)。 用Bamm (TaKaRa)和Xho I (TaKaRa)雙酶切檢測，連接成功的質粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產生兩條帶，分別為2. 7 1Λ和1.2 kb (圖5B)。確認是連接成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌DH5 α，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒pENTR-2B-/WA。實施例3 植物表達載體pK2-35S_/WA的構建
植物表達載體pK2-35S_/aA/A的構建策略如圖6所示。通過Gateway技術的LR反應把 faldh亞克隆到植物表達載體PK2GW7 (Gateway的目的載體，比利時VIB/Gent公司)中。具體的做法是用質粒抽提試劑盒純化(Gateway的目的載體pK2GW7，在(Gateway的LR反應體系中力口 pENTR-2B-/aA/A 禾口 PK2GW7 #150ng，ly 1 LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen), 混均于25 0C反應過夜，通過整合酶的作用把/WA整合到PK2GW7中獲得faldh的植物表達載體質粒PK2-35S-/WA，其構建流程見附圖9。用反應混合物轉化高效率(108)的大腸桿菌感受態細胞DH5ci (購自天根生化科技公司)，把轉化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素 (Spe, 50 μ g/ml)的平板上，于37 0C過夜培養，篩選Spe抗性重組子菌落。從Spe抗性重組子菌落中提取質粒，選出大小和對照質粒PK2GW7相似的整合成功的質粒PK2-35S-/WA(圖 7A)。然后用酶切驗證重組質粒的正確性，用及和損ol雙酶切檢測pK2-35S-/WA，酶切產物為1.21Λ的條帶(目的基因大小)和11. 1 1Λ條帶(PK2GW7載體大小)(圖7B)。確認是整合成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌DH5 α，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒。PK2GW7攜帶的篩選標記基因為卡那霉素抗性基因(Knf)，這樣可用加有卡那霉素的平板篩選轉基因植物。實施例4 用含faldh基因的植物表達載體轉化農桿菌
制備農桿菌的感受態細胞，用電脈沖法將上述構建好的植物表達載體mnidh 轉入農桿菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壯觀霉素的平板上篩選轉化子。取少量質粒加入農桿菌感受態細胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預冷的電轉化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉化杯置于電轉化儀(BIO-RAD)滑槽中，用Imm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數進行電擊，電擊后立即取出電轉化杯，迅速加入0. 5mlS0C培養基， 混勻，轉移到1.5ml的離心管中J8°C，200rpm搖床培養3 — 5h ；室溫下，7500rpm離心 Imin,棄大部分上清，保留100 μ 1將細胞懸??；把農桿菌涂布于有壯觀霉素(Spe，50 μ g/ ml)的LB固體培養基上二8°C培養2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農桿菌菌落放入 20 μ 1 ddH20中，98°C處理5分鐘后取出10 μ 1農桿菌裂解液作為PCR反應的模板。PCR檢測pK2-35S-/aA/A轉化結果，上下游引物分別為/7 / 7和/7 / 8，正對照擴增體系模板使用 PENTR-2B-/WA質粒，負對照模板使用PK2GW7質粒，擴增片斷理論長度為1. 2 kb,PCR產物經電泳分析顯示其片段大小與理論預測值相符，表明質粒已轉入農桿菌(圖7C)實施例5 用含有/WA基因植物表達載體的農桿菌轉化煙草
挑取攜帶有質粒pK2-35S-/aA/A的農桿菌單菌落接種于50ml的LB培養基中(含Spe， 10(^8/1111)，180卬111，沘1培養2411，待菌液00_至 1.0 左右，離心 IOmin (3000rpm)，沉淀菌體。再用IOml左右的MS液體培養基懸浮，離心IOmin (3000rpm)，沉淀菌體。重復以上操作2 3次。最后加入一定體積的MS液體培養基重懸浮，使菌體的OD6tltl值為0. 5。制備煙草OVicoiiaz7a tabacum cv. Xanth)的無菌苗，通過農桿菌介導，用葉盤法轉化煙草，然后通過組織培養獲得小苗，進一步篩選獲得所需的轉基因植物。把無菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的農桿菌菌液中浸染15 - 20min，用無菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導培養基MSl (MS+NAA02. 1 μ g/ml+BAP 0. 02 μ g/ml)上黑暗共培養2天，將外植體轉移至含潮霉素(25 μ g/ml)的芽誘導培養基MS4 (MS+NAA0. 53 μ g/ml+BAPO. 5 μ g/ml)上進行芽的誘導，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉入卡那霉素(50ug/ml)的MS培養基上進行根的誘導。實施例6 -.faldh基因在轉基因煙草中的插入情況及表達水平的檢測
為了確認通過卡那霉素篩選的轉基因煙草株系確實含有導入的目的基因的DNA片段， 用PCR方法對篩選到的轉基因煙草作進一步的鑒定。首先采用CTAB法提取植物基因組 稱取植物葉片IOOmg左右置于1.5ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入 90(^1預熱到651的2\07^緩沖液(111^8-!1(1 pH 7.5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, CTAB ^0，65°C度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500 μ 1氯仿一異戊醇混合液(24 1)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm)后轉移上清至1. 5ml EP管；再次加入500 μ 1氯仿一異戊醇混合液(24 :1)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm);取出上清置于新的EP管中，加入1/10 體積3M pH5. 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4°C離心20min( 12000rpm);棄上清，用75% 乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，獲得的基因組DNA樣品。 以轉/WA煙草抗性苗基因組作為模板，上下游引物分別為/A/ 7和/A/ 8進行PCR擴增檢測/WA是否插入煙草基因組。擴增產物大小為1.2 1Λ左右，和預期推測一致，說明目的基因均已插入這些轉基因株系的基因組，野生型煙草基因組PCR產物未出現目標條帶(圖 8A)。為了考察目的基因在轉基因煙草株系中的轉錄情況，從轉基因植物中抽取總RNA， 反轉錄成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測/WA基因在轉基因植物中的轉錄水平。采用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA,取植物嫩葉約 0. Ig,加入 Iml 的 TRIzoL 提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm),轉移上清液至新管，加入0. 5ml異丙醇，混勻室溫放置lOmin，4°C離心IOmin (12000rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇Iml清洗，4°C離心5min (7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。所獲得的RNA樣品用凝膠電泳檢測質量和濃度。使用Reverse Transcriptase進行cDNA的合成，取植物總RNA 約 0. 1 μ g-5 μ g, oligo (dT) 50ng, IOmM dNTP mix 1 μ 1，用 DEPC 處理水補足至 10 μ 1，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應混合物9 μ 1 (5 Xreaction buffer 4 μ l,25mM MgCl2 4μ 1,0. IM DTT 2μ 1, RNA 酶抑制劑 1 μ 1 )，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫anin，加入1μ 1 M-MuLV Reverse Transcriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫20min，然后42V保溫70min，合成cDNA。以cDNA為模板，用faldh基因的上下游引物進行RT-PCR分析，考察轉基因煙草中是否有目的基因的轉錄物，結果證明轉基因煙草植株均有目的基因的轉錄物，而野生型的煙草則沒有(圖8B)。選取野生型和轉基因株系葉片提取總蛋白，然后進行Western Blot分析檢測 FALDH的表達水平。蛋白樣品上樣量為50 μ g，一抗為耐熱甲基營養菌召.brevis中FALDH的鼠抗體，二抗為過氧化酶標記的羊抗鼠IgG (KPL，USA)。結果(圖8C)說明轉基因株系TT2， TT6，TT8中有/WA基因編碼的FALDH條帶，而野生型煙草中沒有該條帶，說明FALDH已在轉基因煙草中成功表達。實施例7 轉基因煙草甲醛脫氫酶(FALDH)的酶活性分析
從煙草葉片中抽提可溶性蛋白，取0.2g煙草葉片，加1 ml蛋白抽提液(100 mM Tris-HCl (pH 7.5) ；10% (V/V)甘油；10 mM 巰基乙醇；1 mM PMSF ；5% (ff/V) PVP)研磨， 轉移至EP管中，13000 rpm離心25 min (4 °C )。將上清移到新的EP管中，用Bradford方法測定植物上清中的蛋白質濃度。FALDH酶活性在25°C通過檢測NADH的產生量確定(Koivusalo等，FEBS Lett, 1989，257:105-109)。反應體系(800 μ 1)為0. IM sodium phosphate (pH8. 0), ImM HCHO， ImM glutathione，2. 4mM NAD，蛋白樣品。一個活力單位對應每分鐘生成IMmol NADH的酶量。轉faldh煙草株系在25°C持續光照培養15天后，檢測FALDH酶活性(圖9)。轉基因煙草酶活性比野生型煙草提高約3 5倍左右，這表明faldh已在煙草中過量表達具有活性的FALDH。實施例8 轉基因煙草吸收液體甲醛速率測定
甲醛可與Nash試劑(醋酸氨15%，冰醋酸0. 3%，乙酰丙酮0. 2%)發生化學反應產生有顏色的物質，該物質的最大吸收波長為410nm，因此可以制備標準曲線，根據HCHO-Nash標準曲線即可計算出反應液中甲醛的含量，利用該方法可以測定植物對甲醛的吸收速率。取 2 g左右植物材料放入小三角瓶中，加入70ml處理液(HCH0 2mM, KHCO3 5mM, MES 0.1%)， IOOrpm搖床震蕩培養，25°C持續光照，處理一定時間。取出20 100 μ 1處理液，加水至1 ml，再加入1 ml Nash試劑在30°C保溫30分鐘后，測定0D·，再根據標準曲線計算出處理液殘存甲醛濃度(圖10)。結果表明，3個轉基因煙草株系在2 mM甲醛溶液中處理48小時后殘余甲醛的比率為60%左右，而野生型剩余甲醛的比率為90%左右，這說明轉基因煙草吸收液體中甲醛的速率優于野生型。實施例9 轉基因煙草代謝液體和氣體甲醛能力分析
將轉/WA基因煙草和野生型煙草無菌苗(2g)置于70ml的H13CHO處理液(H13CHO 2mM, KHCO3 5mM, MES 0. 1%)中，25°C持續光照振蕩培養，另外需未處理樣品作為對照；處理時間結束后，將植物材料迅速轉移到4°C預冷的無菌水中清洗植物材料表面殘留的游離H13CHO, 至少3、次。無菌吸水紙吸干葉片表面殘留水分，液氮速凍，研磨；轉移液體至EP管中，室溫離心(12000rpm)20min ；轉移上清至新5mm核磁管，用封在毛細管中的甲酰胺作為內參作 13C-NMR分析(圖11A)。對處理時間不同的樣品和未經任何處理樣品的H13CHO代謝譜進行比較，結果說明用H13CHO處理池后，轉基因植物出現一個H13COOH信號峰，長達4 后轉基因植物中出現較強的H13COOH信號峰，在未轉基因的野生型植物中在H13CHO處理池后有一個很弱的H13COOH信號峰，但在4 后未檢測到H13COOH信號峰，說明通過轉基因表達的FALDH 有氧化甲醛的能力，且穩定性好，能一直在植物中發揮作用。將20μ 1 H13CHO吸到一個小棉花團上，置入植物培養瓶中，通過棉花團上揮發出來的氣體甲醛處理轉基因植物和野生型植物池后，用液氮速凍，研磨；轉移液體至EP管中， 室溫離心(12000rpm)20min ；轉移上清至5mm核磁管，用封在毛細管中的甲酰胺作為外參作 1V-NMR分析(圖11B)。結果表明轉基因煙草吸收的甲醛是野生型煙草的3. 58倍。轉基因煙草中甲酸的生成量是野生型煙草的1. 5倍，檸檬酸的生成量是野生型煙草的21倍，蘋果酸的生成量是野生型煙草的3. 6倍，半胱氨酸的生成量是野生型煙草的1. 89倍，只有甘氨酸的生成量略有減少(為野生型煙草的57. 1%)，轉基因煙草生成"C代謝產物的總量是野生型的2倍，這些數據說明FALDH在轉基因煙草中的過量表達使其代謝氣體甲醛的能力大大提尚。實施例10 轉基因煙草對于培養基中甲醛的抗性分析
稱量選取長勢良好，大小一致(約1. 2g左右)的煙草組培苗分別轉移至含有2 mM和4 mM HCHO的MS基本培養基上，25°C，光周期為IMi光照/ 黑暗的溫室條件下培養10 d，觀察煙草表型變化。結果說明在2 mM HCHO的MS基本培養基上兩種煙草的生長沒有明顯差別(圖12A)，但在含有4 mM HCHO的MS基本培養基上轉/WA基因煙草長勢明顯要好于野生型煙草(圖12B)。這表明FALDH非常有助于提高煙草對于固體培養基中液體甲醛的抗性， 與野生型相比，轉基因株系的生長受甲醛的影響很小。在含有相同濃度HCHO的固體培養基中生長時，轉基因煙草(TT-6)的生物量比野生型植物高(圖12C)。
權利要求
1.短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因，其特征在于甲醛脫氫酶基因具有如SEQID NO. 1所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的甲醛脫氫酶基因，其特征在于基因來源于短芽孢桿菌。
3.權利要求1所述甲醛脫氫酶基因的植物表達載體pK2-35S-/aA/A，所述載體含有甲醛脫氫酶/WA基因及卡那霉素篩選標記基因K2和組成型啟動子35S。
4.權利要求3的所述的植物表達載體在制備吸收和耐受甲醛能力強的轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因faldh及其植物表達載體的構建方法和應用，提供了能提高甲醛耐受能力的短芽孢桿菌faldh基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質的氨基酸序列，用該基因構建植物表達載體pK2GW7-35S-faldh，并通過農桿菌介導轉入植物中，使植物提高對甲醛的吸收、代謝和耐受能力，克服植物本身甲醛代謝關鍵酶表達水平較低，吸收代謝甲醛能力低的缺點；實驗證明含有甲醛脫氫酶faldh基因的轉基因植物吸收液體中甲醛的速率優于野生型；通過轉基因植物表達的FALDH蛋白有氧化甲醛的能力，且穩定性好，能一直在植物中發揮作用；FALDH蛋白在轉基因植物中的過量表達使其代謝氣體甲醛的能力大大提高。
文檔編號C12N9/02GK102337280SQ20111030649
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者孟慶超, 年洪娟, 程琴, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學