專利名稱：一種轉基因魚類細胞及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物指示物技術領域，具體涉及一種轉基因魚類細胞及其應用。
背景技術：
環境中的遺傳毒物能直接或間接地損傷生物體的DNA，使基因和染色體發生突變而誘發腫瘤，甚至通過生殖細胞將這種損傷傳遞給后代，危害人類健康和動植物的生存。因此，建立快速有效的遺傳毒性檢測技術和評價體系具有重大意義。目前的遺傳毒性的檢測終點可分為4大類基因突變、DNA損傷、染色體損傷和染色體組損傷。雖然目前已建立的遺傳毒性檢測技術有200多種，但真正經過驗證有合適的靈敏度和特異性的檢測方法只有十幾種。而且由于一種遺傳毒性檢測方法通常只能反映一個或兩個遺傳學終點，不能涵蓋所有的遺傳學終點，故要對某種藥品的遺傳毒性做出準確評價，往往需要進行多個遺傳毒性檢測實驗。我國常用的方法有微生物回復突變實驗(如Ames實驗)、哺乳動物培養細胞染色體畸變實驗、嚙齒動物微核實驗和體外真核細胞基因突變實驗等。如體內誘變實驗顯示I個或以上陽性結果，則還需要進行生殖細胞遺傳毒性測試。細菌Ames實驗是檢測基因突變的常用方法，快速簡便，特異性高，但靈敏性偏低，不能檢測與真核細胞結構相關的遺傳毒性效果，代表性差。微核實驗和染色體畸變實驗涉及到染色體的制備，實驗操作難度大，比較慢。酵母和哺乳動物細胞基因突變實驗也存在靈敏度低的問題。彗星實驗用于檢測DNA損傷快速靈敏，但假陽性率高。活體動物實驗如轉LacZ基因小鼠突變實驗，成本高，實驗難度大，只有少數實驗室有能力做。隨后，為實現遺傳毒性檢測的快速和高通量，人們又發展出報告基因檢測系統，即將綠色熒光蛋白基因(GFP)和熒光素酶基因(Iuc)與DNA損傷反應相關基因的啟動子相連接，通過檢測熒光信號的變化來檢測細胞內的DNA損傷。RAD54基因是酵母細胞中的DNA損傷修復基因，目前已有多種以RAD54基因啟動子驅動的GFP或Iuc報告基因遺傳毒性檢測系統在酵母中建立起來，并且具有較高的特異性和靈敏性，也適于高通量篩選(ffalmsley et al.,1997. Yeast 13,1535-1545 ;Billinton et al.,1998.Biosensors &Bioelectronics 13，831-838 ;Liu et al.,2008.Mutation Research 653,63-69)。在哺乳動物細胞中存在p53信號轉導通路，當細胞暴露于具有遺傳毒性的化學物質而出現DNA損傷時，p53信號通路可以感受這種損傷信號，上調細胞內p53蛋白的水平。P53是一種重要的轉錄因子，能夠識別并激活其下游一系列靶基因的表達，例如DNA修復基因P53R2、生長停滯和DNA修復基因GADD45a和細胞周期抑制因子p21基因等，引起細胞生長停滯，進行DNA修復，如果損傷太嚴重而無法修復的話，則啟動細胞凋亡。因此，p53又是一種腫瘤抑制因子，并被稱為“基因組衛士”，在維持基因組的穩定上起重要作用。總之，將這些基因的啟動子與報告基因相連，并整合到哺乳動物細胞基因組中，得到的轉基因細胞就可以用于藥品或環境樣品的遺傳毒性檢測。Ohno等(2005，2006)將由P53R2基因啟動子驅動的熒光素酶重構基因(P53R2-1UC)導入人的培養細胞(p53+)中，構建了人轉基因細胞遺傳毒性檢測系統(Ohno et al. , 2005. Mutation Research 588,47-57 ;0hno et al.，2008. Mutation Research 656，27-35)。用各種遺傳毒物和非遺傳毒物處理該細胞，然后檢測熒光素酶基因的表達，發現該系統操作簡便，具有很好的專ー性和靈敏性。Hastwell等(2006,2009)將GADD45a基因啟動子驅動的GFP重構基因(GADD45a_GFP)導入人的TK6細胞(P53+)中，發現所構建的人轉基因細胞遺傳毒性檢測系統具有較高的專ー性和靈敏性(Hastwell et al.,2006. Mutation Research 607,160-175 ;Hastwell et al.,2009.Mutagenesis24(5) ,455-463)。最近，Zager 等(2010)又將 p21 基因啟動子驅動的 GFP 重構基因(P21-GFP)導入人肝癌細胞H印G2(p53+)中，成功構建了哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統，該系統建立在DNA損傷介導的p21基因的表達基礎上，快速簡便，具有較高的專ー性和靈敏性(Zager et al. , 2010. Radiol. Oncol. 44 (I), 42-51)。但是，這些已建立的基于p53信號通路對DNA損傷反應基礎上的哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統，還存在以下幾個問題(I)哺乳動物細胞系大多來源于腫瘤組織，而50%以上的腫瘤組織細胞中的P53基因或p53通路相關基因發生了突變，因此可利用的哺乳動 物細胞并不多。(2)哺乳動物細胞對培養條件的要求高，培養溫度需要恒定在37°C，需要專門的培養設備CO2培養箱，這制約了這些遺傳毒性感受細胞的運輸和商品化。(3)腫瘤細胞生長快，需要每隔3-5天更換培養基，使這些遺傳毒性感受細胞商品化后的保質期難以令人滿意。⑷細胞中GFP的表達量要足夠高，熒光信號的強度才能達到檢測要求。因此，GFP報告基因檢測系統需要設定閾值，相對熒光信號(即遺傳毒物處理組GFP熒光強度/未處理組GFP熒光強度)需要大于此閾值才能認定為陽性結果。(5)處理組與對照組之間的細胞接種密度差異和取樣誤差等可顯著影響檢測結果。因此，有必要建立ー種非哺乳動物的細胞遺傳毒性檢測系統。

發明內容
本發明的目的是提供ー種轉基因魚類細胞及其應用，即能用于遺傳毒性檢測的轉基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc，從而彌補現有技術的不足。本發明將含有螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)報告基因的質粒和含有海腎熒光素酶基因(Renilla luciferase)的質粒轉入到牙鲆鰓細胞中建立了轉基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc，該轉化細胞可以有效地對環境中的有毒物質進行指示，從而促成了本發明。本發明的ー個方面涉及ー個轉基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc，其保藏編號為CCTCC C201251，保藏單位中國典型培養物保藏中心。保藏單位地址湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心，保藏日期2012年4月25日。該轉基因牙鲆鰓細胞攜帶有表達螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)報告基因的質粒pGL3-p21-Iuc (螢火蟲熒光素酶由人p21基因啟動子驅動)和含有表達海腎熒光素酶基因(Renilla luciferase)的質粒pRL-CMV_luc (海腎熒光素酶由細胞肥大病毒啟動子CMV驅動)。本發明的另ー個方面涉及到轉基因牙鲆鰓細胞的應用，用于指示環境樣品或化學藥品的遺傳毒性。本發明還涉及ー個遺傳毒性檢測系統，該系統用轉基因牙鲆鰓細胞作為生物指示物。該遺傳毒性檢測系統的使用方法如下以不同濃度的環境樣品或化學藥品處理轉基因細胞；24小時后，收集處理后的轉基因細胞進行裂解；測定各個細胞裂解液樣品的螢火蟲熒光發光值RLU和海腎熒光發光值RLU，計算每個樣品的相對熒光比值螢火蟲熒光RLU/海腎熒光RLU ;然后根據該比值的大小繪制劑量效應曲線，根據該曲線的變化趨勢，評價所檢測環境樣品或化學藥品的遺傳毒性大小。本發明的牙鲆鰓細胞p2IFGLuc及應用牙鲆鰓細胞p2IFGLuc建立的遺傳毒性檢測系統具有以下優點(I)魚類細胞系大多來源于正常組織，P53信號通路完整；(2)魚類細胞的適溫范圍廣，150C _35°C都能生長，最適溫度20°C _25°C，因而可室溫操作和運輸；(3)魚類細胞生長速度比腫瘤細胞慢，每隔7-10天傳代一次。細胞單層在15°C條件下可維持I個月以上，提高了該細胞產品的保存期限，保證了該細胞產品的運輸和應用；(4)魚類細胞可密閉培養，不需要二氧化碳培養箱；(5)在細胞中引入雙熒光報告基因質粒，采用雙熒光報告基因檢測技術測定，快速靈敏，測定結果穩定?？傊景l明所設計的遺傳毒性檢測系統，操作簡便快速，具有合適的專一性和靈敏度，可快速和高通量篩選藥品和環境污染物的遺傳毒性，這對于保護人類的生命健康和生物種的正常延續具有重要而深遠的意義。


圖I :本發明的轉基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc的形態；圖2 p2IFGLuc細胞應答三種藥物處理的時間效應關系；其中三種藥物分別為博萊霉素(Bleomycin)、絲裂霉素C(Mitomycin C)和酒精(Alcohol);三種藥物的處理濃度分別為博萊霉素30ii g/ml、絲裂霉素ClOii g/ml和酒精30% (v/v) ；control組代表轉染后未加藥物處理的p21FGLuc細胞，數值以平均數土標準誤表不;圖3 p2IFGLuc細胞應答三種藥物處理的劑量效應關系；其中三種藥物分別為博萊霉素(Bleomycin)、絲裂霉素C(Mitomycin C)和酒精(Alcohol);三種藥物的處理時間分別為博萊霉素4h、絲裂霉素C 2h和酒精lh，數值以平均數土標準誤表示；圖4 :在細胞毒性相似條件下，三種藥物處理轉基因細胞p21FGLuc后，熒光蛋白表達情況的比較圖；其中處理條件分別為30ii g/ml博萊霉素，4h ；10u g/ml絲裂霉素C，2h ；30% (v/v)酒精，lh。數值以平均數土標準誤表示；圖5 :不同濃度環磷酰胺(cyclophosphamide)處理轉基因細胞(p21FGLuc)24小時后的熒光素酶上調表達情況；其中S9+表示環磷酰胺經過鼠肝S9復合物激活；S9-表示環磷酰胺未經鼠肝S9復合物激活，數值以平均數土標準誤表示；圖6 :不同濃度鄰苯二甲酸二(2_乙基己基)酷(di (2-ethylhexyl) phthalate)處理p2IFGLuc細胞24h后的熒光素酶上調表達情況；其中DEHP的濃度變化從0. 005到200 U g/ml，0代表control組，即未進行藥物處理的p21FGLuc細胞，數值以平均數土標準誤表示； 圖7 :不同濃度D-甘露糖(Diannitol)處理轉基因細胞(p21FGLuc) 24小時后的熒光素酶上調表達情況，數值以平均數土標準誤表示；圖8 pGL3-Basic報告質粒的結構；
圖9 pRL-CMV報告質粒的結構；圖10 pcDNA3. l/V5_HisA 載體質粒的結構。
具體實施例方式本發明將2個報告質粒穩定轉染到牙鲆鰓細胞FG中，經過長期的篩選獲得了能夠穩定遺傳的轉化細胞，并構建得到轉基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統。轉入牙鲆鰓細胞FG中的2個報告質粒，其中ー個報告質粒pGL3-p21-luc含有螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)報告基因，該基因的表達由人p21基因啟動子驅動，因而其報告基因的表達是DNA損傷信號誘導特異性的，即感受DNA損傷信號，上調螢火蟲熒光素酶基因的表達；另外ー個報告質粒pRL-CMV-luc含有海腎熒光素酶基因(Renillaluciferase)(圖9)，該基因的表達由細胞肥大病毒(CMV)基因啟動子驅動，該基因的表達是組成性表達，不受DNA損傷信號的誘導，與細胞數量呈正相關，作為內對照，校正系統檢測誤差。該魚類細胞遺傳毒性檢測系統在構建過程中，通過報告質?；蚬厕D染抗性質粒引入Neomycin抗性基因，因而需要在培養基中添加一定濃度的藥物G418來選擇和維持報告基因的穩定整合。藥品處理后的轉基因牙鲆鰓細胞的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶基因的表達量，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(Promega公司試劑盒)來測定，具體測定方法參見試劑盒說明書(Promega 公司，Dual- Luciferase Reporter Assay System, Cat.No. E1910)。計算每個樣品的相對熒光比值螢火蟲熒光RLU/海腎熒光RLU，然后根據該比值的大小繪制劑量效應曲線，根據該曲線的變化趨勢，以評價所檢測化學藥品或環境樣品的遺傳毒性大小。上述的質粒pGL3-p21_luc的構建步驟如下用HindIII核酸內切酶酶切PffffP-Luc 質粒(pffffP-Luc 質粒參見文獻El-Diery et al. , 1993. Cell 75 (4)，817-825)，酶切獲得ー個長度為2. 4kb的DNA片段。該片段為人p21基因啟動子序列，然后將該片段插入螢火蟲熒光素酶報告質粒pGL3-basic-luc(Promega公司產品，Cat. #1751)的多克隆位點(見圖8)，操作步驟根據說明書來進行。上述的表達海腎熒光素酶基因(Renilla luciferase)的質粒pRL-CMV-luc，購自Promega 公司(Cat. #E2261)。上述的牙鲆鰓細胞系FG，來源于牙鲆的鰓組織，由中國海洋大學海洋生命學院童裳亮教授于 1997 年建立(Tong et al. , 1997. Aquaculture 156,327-333)?，F在中國海洋大學海洋生命學院進行傳代培養和液氮凍存保種。上述的轉基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc的構建方法如下(I)在六孔細胞培養板中，接種培養FG細胞單層，待細胞鋪板率達到60% -80%,利用Lipofectamine LTX轉染劑(Invitrogen公司產品)，將2個報告質粒(pGL3_p21_luc和pRL-CMV-luc)和I個抗性質粒(pcDNA3. l/V5A_His圖譜見圖10)按照比例5 : I : 1，以每孔2iig DNA的總量，共轉染到FG細胞中，25°C培養。其中，抗性質粒pcDNA3. l/V5A_His，為Invitrogen公司產品，含有Neomycin基因，具有抗G418活性；(2)48小時后，倒掉舊的培養基(生長培養基MEM培養基，添加10%小牛血清、 100IU/ml青霉素和100 Ug/ml硫酸鏈霉素)，換成選擇性培養基(含終濃度為600 y g/ml G418的生長培養基)，繼續培養，定期換液，篩選2周后，得到穩定轉染牙鲆鰓細胞p2IFGLuc0之后，將G418的終濃度降為300 y g/ml維持培養(維持培養基含終濃度為300 u g/ml G418的生長培養基)或凍存。為了驗證上述所得到的轉基因細胞在檢測遺傳毒物的遺傳毒性上的特異性，我們用典型遺傳毒物和非遺傳毒物對p21FGLuc細胞進行了時間依賴和劑量依賴的檢測實驗。
(I)圖2是p21FGLuc細胞應答遺傳毒物博萊霉素(30 ii g/ml)和絲裂霉素C (10 y g/ml)，以及非遺傳毒物酒精(30%，v/v)處理的時間效應檢測結果。從圖4中可見，遺傳毒物博萊霉素和絲裂霉素C的處理，可明顯誘導該魚類細胞遺傳毒性檢測系統的熒光蛋白上調表達，而非遺傳毒性物質酒精卻不能誘導該魚類細胞遺傳毒性檢測系統的熒光蛋白上調表達。而且這個系統對遺傳毒物的應答速度很快。在不同長度的處理時間里，報告基因的表達水平相對穩定。(2)圖3是p21FGLuc細胞應答遺傳毒物博萊霉素和絲裂霉素C，以及非遺傳毒物酒精處理的劑量效應檢測結果。結果表明，該魚類細胞遺傳毒性檢測系統對遺傳毒物表 現出明顯的劑量依賴性表達，對非遺傳毒物卻沒有。(3)在相似的細胞毒性條件下，博萊霉素對p21FGLuc細胞的遺傳毒性要高于絲裂霉素C (圖4)。這表明該轉基因細胞在檢測遺傳毒物的遺傳毒性上具有很好的特異性，檢測結果穩定，并可以比較遺傳毒性的大小。上述轉基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統在檢測環境污染物和化學藥品的遺傳毒性上的應用實例如下實施例I :環磷酰胺(cyclophosphamide)是一種已知的環境遺傳毒物,在已知的細菌、酵母和哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統中，以及微核和染色體畸變實驗中，均顯示陽性結果。環磷酰胺本身不具有遺傳毒性，但經過鼠肝S9復合物的代謝激活后，即形成具有遺傳毒性的磷酰胺代謝產物。我們用不同濃度環磷酰胺處理p21FGLuc細胞24小時后，發現未經代謝激活的環磷酰胺不能上調細胞中螢火蟲熒光素酶基因的表達，而經代謝激活的環磷酰胺可顯著上調細胞中螢火蟲熒光素酶基因的表達(如圖5所示)。這表明，與其他遺傳毒性檢測系統一樣，本遺傳毒性檢測系統也得到了陽性結果。實施例2 :在檢驗該系統的靈敏性時，我們選擇了可疑致癌物鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是增塑劑的一種，是目前比較有爭議的一種化學物質。在細菌、酵母和哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統中，以及微核和染色體畸變實驗中，均顯示陰性結果。但是，DEHP可引起嚙齒類動物肝臟致癌。目前在歐美國家的化妝品行業中已經明確禁止添加DEHP，在食品及玩具中，它也有確定的添加標準?？梢姡藗內匀缓軗腄EHP對人類健康的安全性。已有的研究認為DEHP誘導嚙齒動物肝癌發生與 其誘導肝臟細胞的過氧化物酶體增生有關，但尚缺乏遺傳毒性方面的實驗證據。我們用不同濃度的DEHP處理p21FGLuc細胞后，誘導熒光信號的結果如圖6所示。發現，在環境濃度條件下(0. 005 u g/ml), DEHP就可以明顯誘導p21FGLuc細胞的DNA損傷反應；在50 u g/ml時，DNA損傷反應達到峰值。這表明，p2IFGLuc細胞對DEHP的遺傳毒性檢測結果為陽性，且隨著DEHP的濃度增加，檢測到的熒光信號越來越強，存在明顯的劑量效應關系。本遺傳毒性檢測系統首次提供了 DEHP具有遺傳毒性的實驗證據，至少在檢測DEHP的遺傳毒性上，本系統比其它系統要靈敏得多。實施例3 D-甘露醇(D-mannitol)是典型的非遺傳毒物，在已有的所有遺傳毒性檢測系統中，均為陰性結果。我們用用不同濃度D-甘露醇處理p21FGLuc細胞，發現不能上調細胞中螢火蟲熒光素酶基因的表達(圖7)。因此，本發明的轉化細胞在進行遺傳毒性檢 測的時候，不會發生假陽性結果。
權利要求
1.ー個轉基因牙鲆鰓細胞，其保藏編號為CCTCC C 201251。
2.如權利要求I所述的轉基因牙鲆鰓細胞，其特征在于該轉基因牙鲆鰓細胞攜帶有表達螢火蟲熒光素酶報告基因的質粒pGL3-p21-luc和含有表達海腎熒光素酶基因的質粒pRL-CMV-luc。
3.權利要求I所述的轉基因牙鲆鰓細胞的應用，其特征在干，是用于指示環境樣品或化學藥品的遺傳毒性。
4.一種遺傳毒性檢測系統，其特征在于，所述的遺傳毒性檢測系統是用權利要求I所述的轉基因牙鲆鰓細胞作為生物指示物。
5.權利要求4所述的檢測系統的使用方法，步驟如下首先以不同濃度的環境樣品或化學藥品處理轉基因牙鲆鰓細胞；24小時后，收集處理后的轉基因牙鲆鰓細胞進行裂解；測定各個細胞裂解液樣品的螢火蟲熒光發光值RLU和海腎熒光發光值RLU，計算每個樣品的相對熒光比值螢火蟲熒光RLU/海腎熒光RLU ;然后根據該比值的大小繪制劑量效應曲線，根據該曲線的變化趨勢，評價所檢測環境樣品或化學藥品的遺傳毒性大小。
6.如權利要求5所述的使用方法，其特征在于所述的化學藥品為鄰苯ニ甲酸ニ(2-こ基己基)酷。
全文摘要
本發明涉及一種轉基因魚類細胞及其應用，即能用于遺傳毒性檢測的轉基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc和用該轉化體作為生物指示物的應用。本發明所設計的遺傳毒性檢測系統，操作簡便快速，具有合適的專一性和靈敏度，可快速和高通量篩選藥品和環境污染物的遺傳毒性，這對于保護人類的生命健康和生物種的正常延續具有重要而深遠的意義。
文檔編號C12Q1/02GK102660508SQ20121012878
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者耿德玉, 郭華榮 申請人:中國海洋大學