專利名稱：一種免疫核酸(iRNA)的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫核酸(iRNA)，即錯位免疫核酸(Poly I:CnU)合成、修飾和制劑工藝及其在預防和治療豬圓環病毒的應用，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
豬圓環病毒II (Porcine circovirus II,PCV2)是由德國學者 Tischer I 等 1974 年首次由多株連續傳代的豬腎細胞系(PK-15)中分離得到，實驗結果顯示，該病毒可以持續感染H(-15細胞，但不引起細胞病變，該病毒于1982年獲得命名。根據圓環病毒的致病性和核酸序列的不同，將PCV劃分為兩個型PCV-1和PCV-2。目前認為PCV-I不會引起疾病。豬圓環病毒2型(PCV-幻感染是近20年來發現的豬的一種新疾病，該病已經在世界范圍內廣泛流行，對養豬業的危害日益被人們重視。PCV-2可造成豬斷奶后多系統衰竭綜合癥(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、皮炎禾口腎病綜合癥(Porcine dermatitisand nephropathy syndrome, PDNS)、繁殖障石尋(Reproductive failure)、 A2型先天性震顫(Congenital tremors)、豬呼吸道病復合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)以及豬增生性壞死性間質性肺炎(Porcine proliferative and necrotizing pneumonias)等疾病。目前針對PCV2感染，采取的是綜合防控措施，建立健全疫病監控體系，適時監測 PCV2感染的發生和流行，實行淘汰陽性抗體豬，建立完善的生物安全技術體系，落實全進全出制度，改善飼養管理，尤其要加強對妊娠母豬的飼養管理，增強豬體抵抗力，控制預防母豬的繼發感染，引種時加強抗體水平檢測等措施。同時獸醫研究人員也在開發針對PCV2的疫苗，如PCV2滅活疫苗，弱毒疫苗，基因工程疫苗(核酸疫苗，重組疫苗和活載體疫苗)，但它們有的處于開發階段，有的處于應用階段，不同種類的疫苗免疫保護效果存在較大差異。本發明涉及合成錯位免疫核酸(Poly I:CnU)所需要的多核苷磷酸化酶 (polynucleotide phosphorylase，PNPase)高表達條件的優化與純化，錯位免疫核酸(Poly I:CnU)合成工藝的建立。并將錯位免疫核酸(Poly I:CnU)進行了后期開發，提高其穩定性，同時又保持其抗病毒效果，以應用于獸藥，特別是像能引起豬免疫抑制的PCV2感染，錯位免疫核酸(PolyI = C11U)在抗PCV2感染中可發揮兩方面的功能，其一提高豬的免疫力，其二利用錯位免疫核酸(PolyI = C11U)的抑制病毒增殖的能力。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種錯位免疫核酸(PolyI = C11U)的制備方法。本發明方法制備的錯位免疫核酸(Poly I:C11U)應用于治療豬圓環病毒感染，提供了一種錯位免疫核酸(Poly IC11U)的新用途。本發明方法制備的錯位免疫核酸(Poly I:C11U)還可與疫苗聯合應用，提供了一種錯位免疫核酸(Poly IC11U)與疫苗聯合應用的新用途。本發明所述的錯位免疫核酸(Poly I:C11U)制備方法包括多核苷酸磷酸化酶
3(PNPase)制備、錯位免疫核酸(PolyIiCllU)的初步合成、錯位免疫核酸(Poly I:C11U)純化、UAC-Poly IiCllU納米分子微囊的制備。本發明所述的錯位免疫核酸(Poly I:C11U)在獸醫藥中的用途為用于治療豬圓環病毒引起的感染和與疫苗聯合應用起到免疫增強作用。上述多核苷酸磷酸化酶(PNPase)制備包括=PNPase表達條件優化、實驗用PNPase 的粗提、超濾膜純化、酶活的測定。其中，PNPase表達條件優化包括改良培養基、調整發酵溫度范圍為18 37°C、控制發酵時間、發酵過程連續補充新鮮培養基、濾除細菌代謝產物、離心發酵液、收集菌體用于PNPase提純。其中，實驗用PNPase的粗提包括對收集菌體細菌壁的離心去除、硫酸銨沉淀除雜蛋白、Tris-HCI緩沖液溶解硫酸銨沉淀。其中，超濾膜純化過程為參考PNPase分子量選擇合適孔徑的中空纖維膜對前一步PNPase粗提物進行二次純化，同時除鹽。其中，酶活的測定用紫外吸收測定，測定采用257nm的吸收值，吸收值為1. O時，定為一個酶活力單位。上述錯位免疫核酸(Poly I:C11U)的初步合成包括Poly I合成和Poly C11U合成。其中，Poly I合成為以5’ - 二磷酸肌苷酸(5’ -IDP)為原料，用本發明所制備的 PNPase在Poly I的反應體系中，于37°C反應，反應結束后用酚去除蛋白，然后除酚，再用乙醇沉淀出獲得Poly I。其中，Poly C11U合成為以5’ - 二磷酸胞苷酸(5’ -⑶P)和5’ - 二磷酸尿苷酸 (5’-UDP)為原料，用本發明所制備的PNPase在Poly C-U的反應體系中，于37°C反應，反應結束后用酚去除蛋白，然后除酚，再用乙醇沉淀出獲得PolyC11Ut5上述錯位免疫核酸(PolyI:CllU)純化包括將Poly I和Poly C11U按等摩爾比混合，透析，有機溶劑沉淀，水溶及凍干，得Poly I C11U純品。上述UAC-Poly I :C11U納米分子微囊的制備采用復凝集法，即將咪唑丙烯酸殼聚糖(UAC)溶液和等體積Poly I C11U溶液置于55°C水浴恒溫30min，將兩者在混合器上混合，偶聯制備出UAC-Poly I = C11U納米分子微囊。上述錯位免疫核酸(Poly I:C11U)應用于治療豬圓環病毒感染試驗過程如下主要材料試驗用藥錯位免疫核酸(Poly I:C11U)，自制。PCV2-WS01株(105_2tlTCID5tl，)由楠森獸醫診斷技術研究中心實驗室提供。Dulac細胞由楠森獸醫診斷技術研究中心實驗室提供。分組和處理試驗分為病毒感染陽性對照組，空白對照組，細胞陰性對照組和感染用藥組。根據錯位免疫核酸(Poly IC11U)用量的不同，感染用藥組設立5個濃度梯度組(30，60，120， 250，500 μ g/ml)，每個濃度設立一個用藥對照組。每組5復孔。先用含10%犢牛血清的完全RPMI 1640調整細胞濃度，將對數生長期的Dulac單個細胞置于細胞培養孔中( 孔細胞板)，500μ 1/孔(2\105_°個細胞)，5%0)2，371條件下溫育Mh。在感染用藥組和用藥對照組分別加入不同質量濃度梯度的錯位免疫核酸(Poly I C11U)溶液(30，60，120，250，500 μ g/ml)，100 μ 1/孔，空白對照組和病毒對照組均分別加入完全RPMI1640培養液，500μ 1/孔。37°C 5% CO2下培養1.釙后，在各感染用藥組和病毒對照組加入PCV2 WSOl株(IO5 kiTCID5q)，100 μ 1/孔，空白對照組加入完全RPMI1640培養液，100 μ 1/孔。370C 5% CO2下繼續培養60h后，收集上清和細胞，用real-time PCR方法測定各組PCV2含量，統計分析各用藥組之間病毒抑制率，結合成本確定最適用藥濃度。本發明參考Chung等提供的引物，采用real-time PCR定量檢測PCV2。引物 PCV2-1:5' -TAGGTTAGGGCTGT-GGCCTTA-3 ‘引物 PCV2-2 :PCV2r，5' -TTCTCCCGCACTTTCGGATAT-3 ‘；探針PCV2probe :5' -ATCTCATCATGTCCACCGCCCAGGA-3 ‘ -fluorescin錯位免疫核酸(Poly I C11U)對體外Dulac細胞抗PCV2效果
權利要求
1.一種免疫核酸(iRNA)，即錯位免疫核酸(Poly I:C11U)的制備方法，其特征在于該方法包括多核苷酸磷酸化酶(PNPase)制備、錯位免疫核酸(PolyI:CllU)的初步合成、錯位免疫核酸(Poly I:C11U)純化、UAC-Poly I :C11U納米分子微囊的制備。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述多核苷酸磷酸化酶(PNPase)制備包括=PNPase表達條件優化、實驗用PNPase的粗提、超濾膜純化、酶活的測定。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于上述PNPase表達條件優化包括改良培養基、調整發酵溫度范圍為18 37°C、控制發酵時間、發酵過程連續補充新鮮培養基、濾除細菌代謝產物、離心發酵液、收集菌體用于PNPase提純。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于上述實驗用PNPase的粗提包括對收集菌體細菌壁的離心去除、硫酸銨沉淀除雜蛋白、Tris-HCI緩沖液溶解硫酸銨沉淀。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于上述超濾膜純化過程為參考PNPase 分子量選擇合適孔徑的中空纖維膜對前一步PNPase粗提物進行二次純化，同時除鹽。
6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于上述酶活的測定用紫外吸收測定，測定采用257nm的吸收值，吸收值為1. O時，定為一個酶活力單位。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述錯位免疫核酸(PolyI:C11U)的初步合成包括Poly I合成和Poly C11U合成。
8.根掘權利要求7所述的制備方法，其特征在于上述PolyI合成為以5’-二磷酸肌苷酸(5’ -IDP)為原料，用本發明所制備的PNPase在Poly I的反應體系中，于37°C反應， 反應結束后用酚去除蛋白，然后除酚，再用乙醇沉淀，得Poly I。
9.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于上述PolyC11U合成為以5’ - 二磷酸胞苷酸(5’ -⑶P)和5’ - 二磷酸尿苷酸(5’ -UDP)為原料，用本發明所制備的PNPase在 Poly C-U的反應體系中，于37°C反應，反應結束后用酚去除蛋白，然后除酚，再用乙醇沉淀， 得 Poly CnU。
10.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述錯位免疫核酸(PolyI:CllU) 純化包括將Poly I和Poly C11U按等摩爾比混合，透析，有機溶劑沉淀，水溶及凍干，得Poly I:C11U 純品。
11.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述UAC-PolyI:C11U納米分子微囊的制備采用復凝集法，即將咪唑丙烯酸殼聚糖(UAC)溶液和等體積Poly I = C11U溶液置于 55°C水浴恒溫30min，將兩者在混合器上混合，偶聯制備出UAC-Poly I C11U納米分子微囊。
12.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述方法所制備的錯位免疫核酸 (Poly I:C11U)可應用于治療豬圓環病毒感染。
13.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述方法所制備的錯位免疫核酸 (Poly I:C11U)可與疫苗聯合應用起到免疫增強作用。
全文摘要
本發明涉及一種免疫核酸(iRNA)，即錯位免疫核酸(Poly I:C11U)的制備方法及其對抗豬圓環病毒的用途。本發明方法制備的錯位免疫核酸(Poly I:C11U)，穩定性和抗豬圓環病毒(PCV2)效果大大提高，同時降低了原有藥物的毒副作用。本發明還提供了一種錯位免疫核酸(Poly I:C11U)與豬圓環病毒疫苗聯合應用的方法。
文檔編號C12N15/10GK102399785SQ20111030850
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月13日 優先權日2011年10月13日
發明者韓健寶 申請人:韓健寶