專利名稱：牛帶絳蟲microRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物學領域，尤其涉及一種牛帶絳蟲，具體來說是一種牛帶絳蟲 microRNA及其應用。
背景技術：
牛帶絳蟲(Jaenia saginata)又稱無鉤絳蟲，是一種世界性分布的寄生蟲。主要分布于歐美和我國西部的農牧地區。在我國，每年造成的健康危害和畜牧業經濟損失上百億，是影響我國西部地區社會發展的一個公共衛生問題。目前，可用于牛帶絳蟲的鑒別方法主要是通過成蟲的形態學。但是，由于蟲體發育的時期不同，寄生的宿主不同等因素，均對蟲體的形態有影響，所以形態學的鑒定有一定的局限性，經常不能將其與豬帶絳蟲和亞洲帶絳蟲區分。MicroRNAs (microRNAs)是一類大小長約2(Γ25個核苷酸，內源性的具有調控功能的非編碼RNA，在許多真核生物中都曾經被發現。這類RNA的功能主要是參與機體或細胞的調節途徑，包括發育、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等過程。在寄生蟲研究領域，已有研究表明寄生線蟲存在獨特的microRNA轉錄后調控機制，它們可以通過microRNA實現對宿主和自身基因表達模式的精確調控，從而提高感染和自身增殖的幾率并逃避免疫監視。通過選擇性地抑制或阻斷某一特定發育期線蟲的發育，從而減少和阻斷寄生線蟲的傳播途徑。牛帶絳蟲特異表達的microRNA有可能成為其免疫預防和化學防治的新分子靶標，為核酸疫苗的制備奠定基礎。

發明內容
本發明的目的在于提供一種牛帶絳蟲microRNA及其應用，所述的這種牛帶絳蟲 microRNA及其應用要解決現有技術中的抗蠕蟲藥物造成的寄生蟲抗藥性、以及動物產品和環境中含有藥物殘留的技術問題。本發明一種牛帶絳蟲microRNA，其核苷酸序列為如SEQ ID NO: η所示，η選自1 一 120的正整數；或者與SEQ ID NO: η中的任何一條序列互補的序列，所述互補的序列為DNA 或 RNA。進一步的，所述的互補序列為DNA或RNA。進一步的，所述互補序列為經過修飾的DNA或RNA。進一步的，所述互補序列為經過硫代修飾或甲氧基修飾的DNA或RNA。本發明還提供了上述的牛帶絳蟲microRNA在制備牛帶絳蟲疫苗中的應用。本發明還提供了一種抑制牛帶絳蟲成蟲生長發育的組合物，含有有效量的至少一個寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對應于如SEQ ID NO: 1 120中任一所示的 microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 120中的任何一條序列互補的序列。本發明還提供了一種基因芯片，包括一個固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應于如SEQ ID NO: 1 120中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: 1 120中的任何一條序列互補的序列。
本發明所提供的牛帶絳蟲的microRNA均分別克隆牛帶絳蟲的成蟲，成熟的microRNA 序列長度為18-25 nt。對其microRNA進行深度測序，獲得牛帶絳蟲成蟲的microRNA表達譜，通過比對發現，SEQ ID NO: 1 120所示的microRNA只在牛帶絳蟲成蟲中表達，而在參照基因組日本血吸蟲中不表達。因此，在牛帶絳蟲體內過量表達SEQ IDN0:1 120分子或采用microRNA反向互補序列抑制SEQ IDNO 1 120的表達將影響牛帶絳蟲生理功能及器官分化相關的功能。此外，鑒于牛帶絳蟲與豬帶絳蟲和亞洲帶絳蟲的物種相似性，本發明所提供的牛帶絳蟲microRNA及其反向互補序列亦可應該用于影響豬帶絳蟲以及亞洲帶絳蟲的生理功能及分化相關的功能。因此，本發明牛帶絳蟲microRNA可用于制備帶絳蟲疫苗，特別是牛帶絳蟲疫苗。本發明和已有技術相比，其技術效果是顯而易見的。本發明的牛帶絳蟲microRNA 可以選擇性的抑制或阻斷某一特定發育期蟲體的發育，從而減少或阻斷寄生蟲，尤其是牛帶絳蟲的傳播。本發明microRNA制備成為牛帶絳蟲疫苗時，作為核酸疫苗，避免了傳統抗蠕蟲藥物造成的全球性分布的寄生蟲抗藥性問題，也不會導致動物產品或環境種內藥物的殘留。
具體實施例方式實施例ImicroRNA的獲得 1.總RNA抽提
1)將樣本(牛帶絳蟲成蟲孕節一片)放入研體中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50 - IOOmg組織/ml Trizol加入Trizol，轉移入離心管；
2)加入250μ L氯仿，劇烈振蕩10s，使液體充分混勻呈乳白狀(無分相現象)后，再室溫靜置5min ；
3)在4°C條件下，以 11900r/min 離心 15min ；
4)將上層水相轉移到一個新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，然后在 4°C條件下靜置10- 15min ；
5)在4°C條件下，以11900r/min離心15min，小心并盡可能去掉上清；
6)用ImL75%乙醇洗滌RNA沉淀和管壁，在4°C條件下，以11900r/min離心8min，然后小心棄去乙醇；
7)將RNA沉淀進行干燥(不能完全干燥)處理后，用10μ L RNase - free水將RNA溶解， 直接用于反轉錄。2.總RNA純度和完整性檢測
1)純度檢測取ι μ L RNA樣品50倍稀釋，在BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀上測定OD值，OD 260/0D 280的比值大于1. 8。2)總RNA完整性取RNA樣品1 μ L，1%瓊脂糖凝膠電泳80 VX 20 min,用凝膠成像系統觀察總RNA 5S rRNA, 18S rRNA和^S rRNA條帶，三條帶條帶完整。3. small RNA序列的獲得和篩選
用15% PAGE膠回收20-30 nt的small RNA，加上5，和3，端接頭(購自Illumina公司)后實施RT-PCR (反轉錄試劑盒購自hvitrogen公司)。產物經6 %TBE PAGE膠純化后進行Solexa測序。然后屏蔽掉可能為接頭序列的部分、測序質量差的序列(例如測序信號很低等)及長度小于18 nt的序列獲得clean reads。4. microRNA 的鑒定
用 BLAST 程序(NCBI，www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast) M clean reads 與 GenBank 禾口 Rfam database (version 9.0) (http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/microRNA) 進行比對分析，去除非編碼RNA序列，包括rRNA，tRNA, snRNA, snoRNA，和other ncRNA ； 通過Repeatmasker (http://www. repeatmasker. org)去除轉座子等重復序列；然后搜索 Sanger miRBase (version 13. 0)數據庫，尋找序列相似性microRNA。將牛帶絳蟲所表達的microRNA與已報道的日本血吸蟲進行比較，分別屏蔽掉兩兩共有相關的序列，獲得牛帶絳蟲特有的microRNA (例舉120條)。此外，為了提高反向互補序列的作用和細胞內穩定性，上述牛帶絳蟲特異性 microRNA的反向互補序列可以是DNA或RNA，還可以對反向互補序列進行硫代、甲氧基等修飾。實施例2
本發明一種基因芯片，包括一個固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應于如SEQ ID NO: 1 120中任一所示的 microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 120中的任何一條序列互補的序列。由于芯片的制造技術屬于本領域的常規技術，在此不再贅述。
權利要求
1.一種牛帶絳蟲microRNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO: η所示，η選自 1 - 120的正整數；或者與SEQ ID NO: η中的任何一條序列互補的序列。
2.根據權利要求1所述的牛帶絳蟲microRNA，其特征在于所述的互補序列為DNA或RNA。
3.根據權利要求2所述的牛帶絳蟲microRNA，其特征在于所述互補序列為經過修飾的 DNA 或 RNA。
4.根據權利要求3所述的牛帶絳蟲microRNA，其特征在于所述互補序列為經過硫代修飾或甲氧基修飾的DNA或RNA。
5.權利要求1-4中任一所述的牛帶絳蟲microRNA在制備牛帶絳蟲疫苗中的應用。
6.一種抑制牛帶絳蟲成蟲生長發育的組合物，其特征在于含有有效量的至少一個寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對應于如SEQ ID NO: 1 120中任一所示的microRNA 序列或者與SEQ ID NO: 1 120中的任何一條序列互補的序列。
7.一種基因芯片，包括一個固相載體，其特征在于在所述的固相載體上固定有至少一個寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應于如SEQ ID NO: 1 120中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: 1 120中的任何一條序列互補的序列。
全文摘要
本發明一種牛帶絳蟲microRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:n所示，n選自1－120的正整數；或者與SEQIDNO:n中的任何一條序列互補的序列。本發明還提供了上述的任一所述的牛帶絳蟲microRNA在制備牛帶絳蟲疫苗中的應用。還提供了一種抑制牛帶絳蟲成蟲生長發育的組合物。本發明還提供了一種基因芯片。本發明首次從牛帶絳蟲分離獲得一類新的microRNA，這些microRNA在牛帶絳蟲生活史中的表達具有重要意義，可用于影響牛帶絳蟲幼蟲生理功能、發育、分化相關等功能，并為制備牛帶絳蟲基因工程疫苗以及防治牛帶絳蟲病提供了新的途徑。
文檔編號C12N15/113GK102329798SQ201110318198
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者劉宏坤, 周曉農, 張永年, 徐民俊, 朱興全, 李 浩, 王尚位, 艾琳, 郭儉, 陳家旭, 陳木新, 陳紹榮, 陳韶紅 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所