專利名稱：一種重組大腸桿菌發酵生產果膠酶的方法
技術領域：
一種重組大腸桿菌發酵生產果膠酶的方法，屬于發酵工程技術領域。
背景技術：
堿性果膠酶一般指聚半乳糖醛酸裂解酶(E. C. 4. 2. 2.2,簡稱PGL)，其最適pH在 8 10，可以在高pH條件下以反式消去作用斷開果膠聚合物主鏈，產生Δ4:5不飽和的寡聚半乳糖醛酸。堿性果膠酶可用于紡織品前處理的精練工藝，從而取代傳統的堿煮法，不但能夠降低能耗和廢水處理難度，同時還可以提高產品質量，提升產品的國際競爭力，是目前紡織生物技術領域的一個研究熱點。目的蛋白的產量和分泌效率取決于多個因素，其中適宜的流加策略和誘導策略對于發酵罐水平蛋白表達來說，是關鍵因素。然而，需要注意的是，在指數流加過程中，當誘導開始后，實際比生長速率(μ Ρ)往往明顯低于設定比生長速率(ysJ，營養物質不斷的積累，從而導致細胞生理和代謝的大幅變化，進而影響目的蛋白的合成。

發明內容
本發明所解決的技術問題是提供一種利用重組大腸桿菌發酵生產堿性果膠酶的方法。為解決上述問題提供如下技術方案Whcherichia coli BL21(DE3)為出發菌株，其特征在于，步驟如下1)發酵培養基中初始甘油濃度為6_14g L-1，待甘油耗盡DO上升后，按照比生長速率為0. 15-0. 23h-l指數流加甘油；2)直至菌體干重達到12-18g L-I，降低溫度同時加入IPTG進行誘導，以6_18mL h-1的速率進行甘油培養基流加直至發酵結束。具體而言步驟如下誘導前(菌體生長階段)控制重組大腸桿菌生長階段溫度為37°C，發酵培養基為 MTB，初始甘油濃度為6-14g L-1，待發酵罐中甘油耗盡，DO陡然上升后，以指數方式流加甘油(μ set = 0. 2)，以通氣量和攪拌轉速控制DO為30%，直到菌體干重達到12-18g L-I ；誘導后(PGL高表達階段)將溫度降低為同時加入0. 05mM IPTG，以6_18mL h-1的速率進行甘油培養基流加，維持DO為30% ；整個過程用25%氨水(ν/ν)控制pH為7. 0，空氣流量設為1. 8(L mirT1)。菌種E.coli BL21DE3 (pET-20b(+) PGL)，為胞外分泌表達，構建方法見 Shuying Fang, Jian Chen, et al. Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in a recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach. Bioresource Technology,doi :10.1016/j.biortech. 2011. 09. 020. In Press。培養基成分如下種子培養基(LB)酵母粉5g L—1，胰蛋白胨6-14g L-l,NaCl 6_14g L-1，氨芐青霉素 0. ImM, pH 7. 0發酵培養基(MTB)甘油6-14g L-1，酵母粉 24g L—1，蛋白胨 12g L-1，KH2P0417mM, K2HP0472mM,氨節青霉素 0. ImMMTB 培養基甘油 6-14g L-1，酵母粉 24g L-1，蛋白胨 12g L-1，KH2P0417mM, K2HP0472mM,氨節青霉素 0. ImM固體平板培養基LB培養基，1. 5%瓊脂流加甘油培養基甘油500g ΙΛ酵母粉50g L—1，蛋白胨50g L—1培養方法如下種子培養將保藏的菌種接入裝有25mL LB培養基的250mL三角瓶中，回旋式搖床轉速200r/min，培養溫度為37°C，培養8h。發酵培養將LB中菌液以5%接種量接種至全自動3L發酵罐(BioFlo 110，New Brunswick Scientific Co.)指數流加按照如下公式進行F{t；=F(t)流加速率, :細胞密度，Vtl 初始體積，Sf 補料液中甘油濃度，yset:比生長速率為0. 2，Yx/S 對底物細胞得率。乙酸是好氧發酵的胞外副產物，當其濃度超過2. Og L—1，將影響細胞生長和外源蛋白合成，乙酸的生成的抑制可以通過控制比生長速率來實現，對于^^！^！^油化COli BL21(DE3)，控制比生長速率0. 15-0. 23h_l以下時乙酸濃度不超過2. Og L-1。堿性果膠酶測定方法取一定量發酵液于IOOOOr mirT1離心lOmin，上清液作為堿性果膠酶活性測定的樣品。反應體系中包括粗酶稀釋液20 μ 1，2mL含0. 2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH緩沖液(0. 2moir1, pH 9. 4，含有0. 44mmol L-1的CaC12)，以無活性的酶液(即提前加入終止液的酶液)作為空白對照，以含底物的緩沖溶液的加入起動酶促反應；反應條件為45°C反應 15min，用3mL0. 03mol L—1的磷酸終止反應，在235nm處測定其吸光度值。一個標準酶活單位定義為每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產生1 μ mol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。
OD23 5 X 106 X dilution factor X volume of mixture酶活計算
103 XtX 4600 XbX volume of enzyme preparation4600 (L/mol/cm)不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾吸光系數t(min)酶促反應時間(在酶反應的線性范圍內)b (cm)比色杯厚度本發明方法簡單易行，大幅提高了堿性果膠酶的產量與生產強度以及分泌表達效率，有利于大規模工業化生產。同時對于指導其他大腸桿菌表達系統分泌表達外源蛋白量的提高有重要意義。
具體實施例方式實施例1
菌種E.coli BL21DE3 (pET_20b (+) PGL)，為胞外分泌表達。培養基1)種子培養基(LB)酵母粉5g L—1，胰蛋白胨6_14g L-I, NaCl 6_14g L-1，氨芐青霉素ImM，pH 7. 02)發酵培養基(MTB)甘油 6-14g L_l，酵母粉Mg Λ 蛋白胨 12g L—1，KH2PO417mM， K2HP0472mM,氨節青霉素 0. ImM幻固體平板培養基LB培養基，1. 5 %瓊脂4)甘油流加培養基甘油500g L—1，酵母粉50g L—1，蛋白胨50g L-1培養方法1)種子培養將保藏的菌種接入裝有25mL LB培養基的250mL三角瓶中，回旋式搖床轉速200r/min，培養溫度為37°C，培養他。幻發酵培養將LB中菌液以5%接種量接種至全自動3L發酵罐(BioFlo 110,New Brunswick Scientific Co.)。采用MTB培養基(包含100 μ g mL—1氨芐青霉素)為發酵培養基，整個過程可以分為三個階段1)初始甘油濃度為6g L-1，培養溫度為37°C，當DO反彈甘油耗盡后，開始第二階段；2)按照如下公式進行指數流加甘油培養基，比生長速率為0. 151Γ1Fit；=:‘“巧，路‘)(1)
^i1X SF(t)為流加速率(L h-1)，X0為細胞密度(gcell L-1)，V0為初始體積(L)，Sf代表補料液中甘油濃度(g Γ1), Psrt為設定的比生長速率OT1)，^s對底物細胞得率fe。ell gg^ee^r1)，依據計算公式，每小時調整一次流加速率，當細胞干重達到12g L-1，加入0. 05mM IPTG，同時將培養溫度降至^°C，開始誘導果膠酶(PGL)表達；3)甘油流加速率為恒定的6mLh_l，在整個過程中，用25% (ν/ν)的氨水控制pH為 7.0，維持DO為30%，空氣流量為1. SLmirT1。堿性果膠酶總產量與胞外產量分別為303. OU mL—1和219.3U mL—1，生產強度為 6. 4U Hir1IT1。實施例2 發酵過程參數略有不同，其余材料和方法同實施例1，采用MTB培養基(包含 IOOyg mL—1氨芐青霉素)為發酵培養基，整個發酵過程可以分為三個階段1)初始甘油濃度為IOg L-I，培養溫度為37°C，當DO反彈甘油耗盡后，開始第二階段；2)按照如下公式進行指數流加甘油培養基，比生長速率為0.池―1Fit；=:‘”巧Γ 路”《
iC'Σ SF(t)為流加速率(L h-1)，X0為細胞密度(gcell L-1)，V0為初始體積(L)，Sf代表補料液中甘油濃度(g Γ1), Psrt為設定的比生長速率0Γ1)，Yx/S對底物細胞得率fe。ell k—1)，依據計算公式，每小時調整一次流加速率，當細胞干重達到16g L-1，加入0. 05mMIPTG，同時將培養溫度降至^°C，開始誘導果膠酶(PGL)表達；3)甘油流加速率為恒定的12mL h_l，在整個過程中，用25% (ν/ν)的氨水控制ρΗ 為7.0，維持DO為30%，空氣流量為1. SLmirT1。堿性果膠酶總產量與胞外產量分別為371. 8U mL—1和257. 8U mL—1，生產強度為 7. IU mLH實施例3 發酵過程參數略有不同，其余材料和方法同實施例1，采用MTB培養基(包含 IOOyg mL—1氨芐青霉素)為發酵培養基，整個發酵過程可以分為三個階段1)初始甘油濃度為14g L-I，培養溫度為37°C，當DO反彈甘油耗盡后，開始第二階段；2)按照如下公式進行指數流加甘油培養基，比生長速率為0. 231Γ1
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bS1X SF (t)為流加速率(L h-1)，X0為細胞密度(gcell L-1)，V0為初始體積(L)，Sf代表補料液中甘油濃度(g Γ1), Psrt為設定的比生長速率0Γ1)，Yx/S對底物細胞得率fe。ell k—1)，依據計算公式，每小時調整一次流加速率，當細胞干重達到18g L-1，加入0. 05mM IPTG,同時將培養溫度降至^°C，開始誘導果膠酶(PGL)表達；3)甘油流加速率為恒定的18mL h_l，在整個過程中，用25% (ν/ν)的氨水控制ρΗ 為7.0，維持DO為30%，空氣流量為1. SLmirT1。堿性果膠酶總產量與胞外產量分別為330. 5U mL—1和193. 8U mL—1，生產強度為 5. IU mdT1。
權利要求
1.一種重組大腸桿菌發酵生產果膠酶的方法，以E. coli BL21DE3(pET-20b(+)PGL)為出發菌株，其特征在于，步驟如下1)發酵培養基中初始甘油濃度為6-14gL—1，待甘油耗盡DO上升后，按照比生長速率為 0. 15-0. 231Γ1指數流加甘油培養基；2)直至菌體干重達到12-18gΙΛ降低溫度同時加入IPTG進行誘導，以6_18mL IT1的速率進行甘油培養基流加直至發酵結束。
2.權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1)每小時調整一次甘油流加速率，流加速率按照如下方式計算F(t)流加速率, :細胞密度，Vtl 初始體積，Sf 補料液中甘油濃度，Psrt 比生長速率為02，YX/S 對底物細胞得率。
3.權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1)中指數流加控制DO為30%。
4.權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1)中溫度為37°C。
5.權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2)中溫度降為^rc。
6.權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2)中加入0.05mM IPTG0
7.權利要求1所述方法，其特征在于，發酵過程中用25%的氨水控制pH為7.0。
8.權利要求1所述方法，其特征在于，所述甘油培養基甘油500gL—1，酵母粉50g Γ1, 蛋白胨50g L—1。
全文摘要
一種重組大腸桿菌發酵生產果膠酶的方法，屬于發酵工程技術領域。以Escherichia coliBL21DE3)為出發菌株，按照一定比生長速率流加甘油培養基，本發明簡單易行，大幅提高了堿性果膠酶的產量與生產強度以及分泌表達效率，有利于大規模工業化生產，同時對于指導其他大腸桿菌表達系統分泌表達外源蛋白量具有重要意義。
文檔編號C12R1/19GK102367437SQ20111032684
公開日2012年3月7日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者劉龍, 堵國成, 張東旭, 房淑穎, 李江華, 陳堅 申請人:江南大學