專利名稱：乳糖在重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于乳糖應用領域，尤其涉及乳糖(分子式C12H22O11)在重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1中的新用途。
背景技術：
人膜島素樣生長因子-I(human Insulin-like growth factor-1, hIGF-1)是人體內一種重要的促生長因子，具有許多生理學活性及潛 的藥用價值。近年來，hIGF-1在治療臨床疾病方面比較認可的適應癥包括Laron侏儒綜合征、糖尿病、胰島素抵抗綜合征等多種頑疾，并取得了良好的效果。因此其臨床應用價值日益受到人們的重視，顯示出巨大的應用潛力，hIGF-1的制備成為國內外研發的熱點之一。現代分子生物學技術的發展使hIGF-1的大量獲得成為可能，目前國際上已經有人利用基因重組技術生產制備hIGF-1并作為藥物開發，美國Insmed公司使用原核大腸桿菌系統表達獲得hIGF-1，商品名為美卡舍明一林菲培(Mecasermin Rinfabate),已獲得FDA批準用于治療嚴重原發性hIGF-1缺乏患兒。近年來國內關于hIGF-1體外表達的報道也不少，但大多為實驗室規模的研究，從我國國家食品藥品監督管理局網站檢索得知，目前國內尚無單位申報hIGF-1新藥。高密度細胞培養技術(high cell density cultivation, HCDC)即高密度發酵技術，是為大規模生產重組蛋白而發展起來的一門發酵工藝，與傳統的發酵技術相比，該技術可以減少培養體積、縮短生產周期、減少設備投資等，從而達到降低生產成本、提高生產效率的目的，這為高效生產hIGF-1蛋白提供了新的思路。然而，國內公開報道的關于hIGF-1蛋白基因工程菌高密度發酵的工藝尤其是在誘導劑的使用上還存在一定不足與缺陷。在乳糖操縱子調控機理基礎上設計和構建的表達系統常用的誘導劑是非代謝性乳糖類似物異丙基_ 0 -D-巰基半乳糖苷(isopropylthio- ^ -D-galactoside, IPTG),其誘導效率高，只需要少量即可對lacUV5與T71ac等強啟動子產生持久的誘導作用，從而高效表達重組蛋白。然而，IPTG對人體有潛在毒性且價格昂貴，應用于基因工程新藥工業化生產存在成本較高及產品中的IPTG殘留可能造成人體損害等局限性，有些國家不提倡使用或甚至明文規定在工業化生產人重組蛋白質的過程中不得使用IPTG，因此IPTG在基因工程新藥hIGF-1的工業化制備中的應用受到限制。目前國內公開報道的基于乳糖操縱子機理構建的工程菌高密度發酵表達hIGF-1使用的誘導劑均為IPTG，所以一般僅限于實驗室研究水平，難以實現進一步的產業化大規模生產。要構建能夠進一步實現產業化生產并且具有成藥可能性的hIGF-1制備工藝，必須尋找在高密度發酵表達過程中能夠代替IPTG的誘導劑。乳糖(lactose)是一種無毒、價格低廉的二糖，易溶于水，有多種存在形式，商品化的乳糖主要以a-單水化合物形式存在，又稱為a-乳糖。作為原核細胞的常用碳源，乳糖對乳糖操縱子也具有天然的誘導作用，也可用于誘導宿主菌表達重組產物，但其誘導效率不如IPTG。近年來國內外均有學者嘗試使用乳糖代替IPTG作為誘導劑誘導外源蛋白在細菌中的表達，本課題組于國內首次公開報道使用乳糖誘導大腸桿菌在搖瓶水平表達hIGF-1 的研究[楊漸，俞昌喜，廖聯明，廖虹婷.乳糖誘導人胰島素樣生長因子-1在大腸桿菌中的 表達，海峽藥學，2010，22 (8):248-252]，但乳糖在重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1中 作為誘導劑的應用未見文獻報道。究其原因主要是乳糖本身可被細菌利用作為代謝能源， 使用乳糖作為誘導劑，其作用機制較為復雜，誘導條件不容易掌握，需要對誘導劑濃度、誘 導時機、誘導時間、添加方式等誘導條件進行探索研究后才能使其能夠穩定高效誘導重組 大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1。
發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種乳糖尤其是以a-單水化 合物形式存在的商品乳糖(即a-乳糖)乳糖在制備誘導重組大腸桿菌高密度發酵表達 hIGF-1的誘導劑中的應用，即在重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1中作為誘導劑的使 用方法，包括乳糖誘導劑量、誘導時機、誘導時長、添加方式等，即乳糖作為誘導劑在重組大 腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1中的應用。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是乳糖尤其是以a -單水化合物形式 存在的商品乳糖(即乳糖)作為誘導劑在重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1中的應 用，即乳糖在制備誘導重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1的誘導劑中的應用。所述的乳糖是由半乳糖通過a-1，4-糖苷鍵連接葡萄糖而形成的二糖，其分子式 為C12H220n，結構式為
權利要求
1.一種乳糖在制備誘導重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-l的誘導劑中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于乳糖采用如下結構式的乳糖
全文摘要
本發明公開一種乳糖在重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1中的應用，尤其是以α-單水化合物形式存在的商品乳糖在重組大腸桿菌高密度發酵表達hIGF-1中的應用。乳糖能夠誘導基于乳糖操縱子原理構建的含有外源hIGF-1原核大腸桿菌表達系統高密度發酵表達hIGF-1，表達產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳分析分子量符合設計理論值，蛋白質免疫印跡分析結果提示誘導產物具有人源性IGF-1抗原活性，表明乳糖可以在重組大腸桿菌的高密度發酵中作為誘導劑誘導hIGF-1的表達。其表達成本低，表達效率高，且乳糖本身對人體無毒，因此可為安全、無毒的hIGF-1制備工藝的建立奠定基礎，使其產業化生產成為可能。
文檔編號C12R1/19GK102719506SQ201210229149
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者俞昌喜, 廖聯明, 楊漸, 許盈, 陳理 申請人:福建醫科大學