一種利用重組大腸桿菌發酵生產l-4-羥脯氨酸的方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程領域，公開了一種利用重組大腸桿菌發酵生產L-4-羥脯氨酸的方法，該重組大腸桿菌由如下方法構建：根據公布的脯氨酸-4-羥化酶基因和色氨酸啟動子序列，先優化設計色氨酸串聯啟動子和脯氨酸-4-羥化酶結構基因，然后全基因合成色氨酸串聯啟動子基因和脯氨酸-4-羥化酶結構基因后，將啟動子和結構基因連接到pAMP質粒上，構建了可過量表達脯氨酸-4-羥化酶的重組質粒pAMP-P2trp-Hyp。本發明還公開了所述大腸桿菌在生產4-羥基脯氨酸中的應用，搖瓶發酵結果表明，本發明的重組大腸桿菌的4-羥基脯氨酸的產量達到0.31g/L，提示該重組菌具有良好的工業開發前景。
【專利說明】—種利用重組大腸桿菌發酵生產L-4-羥脯氨酸的方法
【技術領域】
[0001]一種利用重組大腸桿菌發酵生產L-4-羥脯氨酸的方法，屬于微生物基因工程領域。
【背景技術】
[0002]輕脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)為亞氨基酸,是脯氨酸羥基化后的產物,根據其羥基化位置的不同，可分為3-羥基脯氨酸(3-Hyp)或4-羥基脯氨酸(4_Hyp)。自然界中反式-4-羥基脯氨酸較為常見，反式-4-羥脯氨酸是動物組織蛋白如膠原等的重要組成部分。4-羥脯氨酸廣泛應用于醫藥、化工、動物飼料、營養和美容業等方面。在醫藥方面，4-羥脯氨酸作為原料可用于合成消炎藥、碳青霉烯類、血管緊張肽轉化酶抑制劑。在化工合成方面，4-羥脯氨酸是合成多種聚合物的必不可少的手性原料，且發揮著重要作用。在家禽飼料中添加羥脯氨酸，可防止因甘氨酸合成不足而造成的營養不良。4-羥脯氨酸在食品營養方面也有重要作用，由于嬰兒消化系統不完全，需以羥脯氨酸作為營養物質來補充甘氨酸、丙酮酸和葡萄糖。另外，4-羥脯氨酸還具有消除氧化劑和調整細胞的氧化還原狀態的潛在效果，因此許多化妝品中都添加有羥脯氨酸，以期保養皮膚和延緩衰老。
[0003]目前，合成4-羥脯氨酸的方法有化學合成法、生物提取法以及微生物酶法。生物提取法利用動物蛋白來源如明膠、豬皮為原料經酸、堿或蛋白水解酶水解后提取羥脯氨酸，該法純化步驟長，提取率低，成本高，浪費大量原料，且廢棄物污染嚴重，很容易被市場淘汰。而化學合成方法合成步驟較多，成本高，也不適合工業生產。隨著DNA重組技術的發展以及微生物資源的發現，使得發酵法生產4-羥脯氨酸成為工業上很有前景的生產方法。
[0004]目前國內尚未有報道利用重組大腸桿菌發酵法生產4-羥基脯氨酸。

【發明內容】

[0005]針對目前生物提取法獲 得L-4-羥脯氨酸成本高，污染大，提取率低的缺陷，本發明要解決的問題是提供一種利用重組大腸桿菌發酵生產L-4-羥脯氨酸的方法。
[0006]本發明通過將經密碼子優化后的脯氨酸-4-羥化酶基因連接在高效啟動子上，在大腸桿菌中過量表達該羥化酶，在發酵培養基中以葡萄糖為碳源，并通過添加L-脯氨酸來獲得L-4-羥脯氨酸。
[0007]本發明所述的一種利用重組大腸桿菌發酵生產L-4-羥脯氨酸的方法，其特征在于，所述的重組大腸桿菌由如下方法構建:將色氨酸串聯啟動子P2trp和脯氨酸-4-羥化酶結構基因Hyp連接到pAMP質粒上，構建含Hyp基因的表達載體pAMP-P2trp-Hyp，將所構建的重組質粒pAMP-P2trp-Hyp轉化至大腸桿菌中，得到過量表達脯氨酸_4_羥化酶基因的重組大腸桿菌。
[0008]其中，所述的Hyp結構基因來源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp)。
[0009]上述的色氨酸串聯啟動子來源于ptrpLl質粒(購自Stratagene, Germany)。
[0010]上述表達Hyp基因的載體為pAMP，該質粒來源于上海旭冠公司。[0011]本發明所述重組大腸桿菌的構建步驟:
[0012]I色氨酸串聯啟動子的優化
[0013]色氨酸串聯啟動子來源于ptrpLl質粒(購自Stratagene, Germany),該質粒的色氨酸啟動子來源于大腸桿菌K12菌株的色氨酸操縱子，是一個適合工業生產應用的強啟動子，在SD序列跟起始密碼子序列之間有Cla I酶切位點，同時，色氨酸啟動子的-35區上游有HindIII酶切位點，這樣便于將啟動子連接到其他的表達載體上，同時，利用酶切等分子操作還可以優化SD序列與起始密碼子之間的距離，使得目的基因得到高效表達。由于兩個色氨酸啟動子串聯起來可提高表達強度，因此，根據PtrpLl質粒的色氨酸啟動子，通過全基因合成，合成色氨酸串聯啟動子。
[0014]2脯氨酸-4-羥化酶基因的優化[0015]基本方法是根據指孢囊菌(Dactylosporangium sp)的脯氨酸_4_輕化酶基因，通過優化羥化酶基因的密碼子，消除一些低使用率的密碼子，同時通過同義轉換，優化mRNA的一級結構，使得核糖體能夠順利地沿著起始密碼子向后翻譯。并利用同義轉化方法消除HindIILBamH IjEcoR I酶切位點。通過個基因合成，合成脯氨酸_4_羥化酶基因。
[0016]3脯氨酸-4-羥化酶基因表達載體的構建
[0017]基本方法是通過全基因合成的方法合成色氨酸串聯啟動子基因和優化后的脯氨酸-4-羥化酶基因，然后根據設計的酶切位點，將啟動子基因連接在羥化酶基因的5’端，最后，將帶有色氨酸串聯啟動子基因的脯氨酸-4-羥化酶基因片段連接到pAMP質粒上，構建重組質粒 pAMP_p2trp_Hyp。
[0018]44-羥脯氨酸發酵重組菌株的構建
[0019]基本方法是將所構建的重組質粒pAMP-p2trp_Hyp轉化至大腸桿菌中，從而獲得過量表達Hyp基因的重組大腸桿菌。
[0020]本發明所述重組大腸桿菌在生產4-羥脯氨酸中的應用，其特征在于，所述應用是以所述重組大腸桿菌在補加L-脯氨酸的完全培養基中將L-脯氨酸轉化為L-4-羥脯氨酸。其中，補加L-脯氨酸的完全培養基配方為:胰蛋白胨10g/L,酵母抽提物5g/L,氯化鈉IOg/L，調節pH為7.0-7.2后121°C火菌15min，接種前加入L-脯氨酸(過濾除菌)至終濃度為200mMo
[0021]本發明所述重組大腸桿菌在生產4-羥脯氨酸中的應用，具體方法是:
[0022]搖瓶培養:挑取重組大腸桿菌單菌落，接種到LB液體培養基(含氨芐青霉素50 μ g/mL)中，37°C、200rpm過夜培養后，按2%接種量接入250mL搖瓶完全培養基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% NaCl，200mML-脯氨酸，pH7.0-7.2)，在旋轉式搖床中30°C、200rpm 培養 24h。
[0023]4-羥脯氨酸的定量測定:將發酵液離心后，取上清，稀釋后取5ml于IOml試管中，加入2ml氯胺T(氯胺T溶液:將1.41g氯胺T溶于IOml水中，依次加入IOml正丙醇和80ml緩沖溶液，其中緩沖溶液配方為:將50g檸檬酸，26.3gNa0H和146.1g結晶乙酸鈉溶于水至1L，然后與200ml水以及300ml正丙醇混合。)，搖勻后在室溫中放置20min，然后加入2ml顯色劑(顯色劑:稱取IOg對二甲氨基苯甲醒,用35ml高氯酸溶解,緩慢加入65ml異丙醇)，搖勻后迅速將試管移至60°C水浴鍋中，保溫20min，再用冷水冷卻，室溫放置30min，然后用分光光度計在560nm波長處測定吸光度。[0024]本發明所提供的利用重組大腸桿菌發酵生產L-4-羥脯氨酸的方法，具有重要的工業應用價值。
[0025]通過搖瓶發酵培養，L-4-羥脯氨酸的產量達到0.31g/L，具有較好的工業開發前
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1.重組大腸桿菌發酵生產L-4-羥脯氨酸的代謝途徑。
[0027]圖2.色氨酸串聯啟動子圖譜。
[0028]圖3.表達質粒的構建圖譜。
【具體實施方式】
[0029]一般性說明:實施例所涉及的酶均購自TaKaRa公司，質粒提取試劑盒與瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自BBI公司，操作完全按照相應說明進行。全基因合成由上海旭冠公司完成。
[0030]LB培養基(％):1%胰蛋白胨，0.5<%酵母抽提物，1%恥(:1，？!17.0-7.2。
[0031]Amp抗性平板:I % 胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% NaCl,氨節青霉素50 μ g/ml。
[0032]SOC培養基(用于感受態細胞的復蘇):2% (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母抽提物，0.05% (W/V)NaCl,2.5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM 葡萄糖。
[0033]5XKCM(大腸桿菌轉化緩沖液):0.5M KCl,0.15M CaCl2,0.25M MgCL20
[0034]4-羥脯氨酸測定方法:將發酵液離心后，取上清，稀釋后取5ml于IOml試管中，加入2ml氯胺T (氯胺T溶液:將1.41g氯胺T溶于IOml水中，依次加入IOml正丙醇和80ml緩沖溶液，其中緩沖溶液配方為:將50g檸檬酸，26.3gNa0H和146.1g結晶乙酸鈉溶于水至1L,然后與200ml水以及300ml正丙醇混合。)，搖勻后在室溫中放置20min,然后加入2ml顯色劑(顯色劑:稱取IOg對二甲氨基苯甲醒,用35ml高氯酸溶解,緩慢加入65ml異丙醇),搖勻后迅速將試管移至60°C水浴鍋中，保溫20min,再用冷水冷卻，室溫放置30min,然后用分光光度計在560nm波長處測定吸光度。
[0035]實施例1:色氨酸串聯啟動子序列的設計
[0036]色氨酸串聯啟動子來源于ptrpLl質粒(購自Stratagene, Germany),,質粒圖譜如說明書附圖2，該質粒的色氨酸啟動子來源于大腸桿菌K12菌株的色氨酸操縱子，是一個適合工業生產應用的強啟動子，在SD序列跟起始密碼子序列之間有Cla I酶切位點，同時，色氨酸啟動子的-35區上游有HindIII酶切位點，這樣便于將啟動子連接到其他的表達載體上，由于兩個色氨酸啟動子串聯起來可提高表達強度，因此，根據PtrpLl質粒的色氨酸啟動子，通過全基因合成，合成色氨酸串聯啟動子。
[0037]通過優化色氨酸串聯啟動子，將HindIII酶切位點AAGCTT修改為EcoR I酶切位點GAATTC，同時，為了使串聯啟動子內部的酶切位點單一，因此將兩個色氨酸啟動子的結合部位的Cla I酶切位點ATCGAT修改為ATGTCGAC,使得連接處變為Sal I酶切位點，同時，在第二個色氨酸啟動子序列的Cla I酶切位點后面加入一個HindIII酶切位點AAGCTT，這樣可利用酶切等分子操作來優化SD序列與起始密碼子之間的距離，使得目的基因得到高效表達。[0038]本實施方式中色氨酸啟動子基因序列的原始序列，見SEQ ID NO:1。本實施方式中優化的色氨酸串聯啟動子序列提交給上海旭冠公司人工合成:優化的色氨酸串聯啟動子序列見 SEQ ID NO:2o
[0039]實施例2:脯氨酸-4-羥化酶基因序列的設計
[0040]根據大腸菌桿的密碼子使用頻率來優化基因密碼子，消除低使用率的密碼子，同時利用同義轉化方法消除HindIII，BamH I,EcoR I酶切位點，故將原始序列中的并將終止子修改為TAAT強終止子，為了便于將脯氨酸-4-羥化酶基因連接到其他質粒載體上，因此在終止子后面插入一個酶切位點BamH I (GGATCC)。
[0041]還要考慮到mRNA的二級結構，首先要保證AUG起始密碼子后及其后的幾個堿基組成的密碼子翻譯口袋呈打開狀態，降低核糖體結合到mRNA上的能勢，使得核糖體能夠順利地沿著起始密碼子向后翻譯。
[0042]本實施方式中脯氨酸-4-輕化酶基因序列的原始序列,見Genbank Accession號D78338.1。本實施方式中優化的脯氨酸-4-羥化酶基因序列提交給上海旭冠公司人工合成；優化的脯氨酸-4-羥化酶序列見SEQ IDNO:3。
[0043]實施例3:脯氨酸-4-羥化酶基因表達載體及重組大腸桿菌的構建
[0044]先分別合成設計好的色氨酸串聯啟動子與脯氨酸-4-羥化酶基因，由于色氨酸串聯啟動子基因序列5端序列帶有EcoR I (GAATTC)酶切位點，3’端有HindIII (AAGCTT)酶切位點，而脯氨酸-4-羥化酶基因5’端序列帶有HindIII (AAGCTT)酶切位點，而3’端有BamHI (GGATCC)酶切位點。將色氨酸串聯啟動子基因序列用限制性內切酶EcoR I和HindIII雙酶切，將脯氨酸-4-羥化酶基因用HindIII和BamH I雙酶切，同時，將質粒載體pAMP也分別用EcoR I和BamH I消化處理。將雙切酶后的色氨酸串聯啟動子基因序列、脯氨酸_4_羥化酶基因以及PAMP質粒載體用瓊脂糖凝膠試劑盒回收，然后用T4 DNA連接酶將三個基因片段連接起來。連接體系為25yL:
[0045]色氨酸串聯啟動子基因片段:5 μ L
[0046]脯氨酸-4-羥化酶基因片段:5 μ L
[0047]PAMP 質粒:2 μ L
[0048]IOXbuffer:2.5 μ L
[0049]T4 DNA Iigase:2 μ L
[0050]16°C連接過夜后，將6μ L的連接液轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，轉化過程為:將6 μ L連接液加入至50 μ L的JM109感受態細胞中，然后再加入10 μ L的5 X KCM緩沖液，混勻后，在冰上放置30min后,42°C熱激90s,然后在冰上放置5min后,加入500 μ L的SOC培養基，37°C, 200rpm培養60min后，涂布至Amp抗性平板上，培養12h后，提取質粒進行驗證。然后進一步測序驗證基因序列是否正確。從而得到了構建好的pAMP-p2trp-Hyp重組質粒，質粒圖譜如說明書附圖3,同時獲得重組大腸桿菌JM109/pAMP-p2trp-Hyp。
[0051]實施例4:重組菌株的發酵實驗
[0052]搖瓶培養:在Amp抗性平板上挑取重組大腸桿菌JM109/pAMP-p2trp_Hyp單菌落，接種到LB液體培養基(含氨芐青霉素霉素50 μ g/mL)中，37°C、200rpm過夜培養后，按2%接種量接入250mL搖瓶完全培養基(1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母抽提物，1 % NaCl，200mM L-脯氨酸，pH7.0-7.2)，在旋轉式搖床中30°C、200rpm培養24h，然后取發酵液檢測4-羥脯氨酸濃度。4-羥脯氨酸的測定方法詳見實施例一般性說明。發酵結果顯示，重組大腸桿菌JM109/pAMP-p2trp-Hyp 的 4- 羥脯氨酸產量達到 0.31g/L。
【權利要求】
1.一株產L-4-羥脯氨酸的重組大腸桿菌的構建方法，其特征在于，先優化并合成色氨酸串聯啟動子基因P2trp和脯氨酸-4-羥化酶結構基因Hyp，然后將色氨酸串聯啟動子P2trp和結構基因Hyp連接到質粒上，構建可過量表達脯氨酸_4_羥化酶的重組質粒，將重組質粒轉化到宿主大腸桿菌中，得到產L-4-羥脯氨酸的重組菌。
2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述的色氨酸串聯啟動子基因是來源于ptrpLl質粒,所述的脯氨酸-4-輕化酶基因來源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp)。
3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述的表達脯氨酸-4-羥化酶結構基因的載體為PAMP質粒。
4.如權利要求1所述的構`建方法，其特征在于，所述宿主為大腸桿菌。
【文檔編號】C12R1/19GK103509813SQ201210203625
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月20日 優先權日:2012年6月20日
【發明者】張震宇, 劉合棟, 袁春偉 申請人:江南大學