專利名稱：一種產生穩定濃度梯度的微流控芯片及細胞共培養方法
技術領域：
本發明屬于將微流控芯片技術應用于生物醫學研究領域，具體涉及一種產生穩定濃度梯度的微流控芯片及細胞共培養方法。
背景技術：
細胞生物學研究正在 從對單種細胞的觀察和研究，發展到對兩種甚至多種細胞相互作用的觀察和研究。對于復雜的生物學體系，多種細胞同時存在的體系才能更好的模擬真實存在的細胞微環境，從而更全面深入的探索細胞之間的復雜網絡以及介導它們之間相互作用的信號通路等，對于研究機體發育、炎癥反應、免疫反應，器官的功能以及腫瘤發生機制均有十分重要的意義。細胞共培養是目前研究細胞-細胞之間相互作用比較常用的方法。傳統上研究細胞共培養方法一般分為三類:混合共培養、微載體共培養和bodyen小室共培養。混合共培養就是將兩種及以上的細胞混合后在孔板內進行共培養，細胞共用培養液，通過分泌到培養液中的細胞因子進行細胞與細胞之間的相互作用，從而影響細胞的形態、增值或者其他行為；微載體共培養即將一種細胞培養在微載體上，另一種細胞培養在培養皿中，隨后將徽載體細胞電加~培養皿中.過一定時間即可觀察兩種細胞相互作用，但這種方法一般應小于4小時，防止細胞從微載體遷移至培養皿中；bodyen小室共培養是一種底部由有機材料的微孔膜制成的培養套皿，因為可溶性物質可以自由通過，培養在套皿中的細胞可通過膜與培養在培養皿中的細胞發生相互作用。以上三種方法均存在試劑消耗量大，細胞用量多，不能方便的實現流體控制等諸多缺點。同時比較難以模擬生物體內復雜的微環境，對于實驗結果難以實時追蹤，只能獲得最終結果，有可能缺失重要的生物學信息。而微流控芯片技術其特有的微尺寸特征與細胞大小正好匹配，通過對芯片功能的要求自行靈活設計，在一定程度上實現集成特征，非常適合進行細胞功能和細胞微環境相互作用的研究。

發明內容
本發明的目的是提供一種產生穩定濃度梯度的微流控芯片及細胞共培養方法，本發明具有操作簡單、制作簡單和樣品用量少等特點。本發明提供了一種產生穩定濃度梯度的微流控芯片，該微流控芯片由灌流通道、入口池、培養小室、廢液池和微通道組成；其中:灌流通道包括灌流通道A (I)、灌流通道B
(2);入口池包括樣品入口池A (3)、樣品入口池B (4)、灌流通道A入口池(5)、灌流通道B入口池(6);廢液池包括灌流通道A廢液池(7)，灌流通道B廢液池(8);培養小室包括培養小室A (9)和培養小室B (10);培養小室A和培養小室B左右相連形成一個細胞共培養單元；培養小室的上端與樣品入口池相連，下端連接廢液池，灌流通道與培養小室通過微通道相連。本發明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。
本發明還提供了基于上述微流控芯片的細胞共培養方法，利用該芯片可以產生穩定的濃度梯度，進而進行細胞接觸式共培養和/或細胞混合式共培養；具體步驟如下:(I)濃度梯度表征:用移液器取一定量的三維基質膠matrigel，通過樣品入口池B和A順序加入培養小室B和A，將其放入37°C培養箱孵育20-30min，待膠凝后，向灌流通道A和B分別加入含有異硫氰酸熒光素(FITC)標記的熒光染料的培養液和不含有熒光染料的培養液，并保證以0.4 μ Ι/min流速持續灌流；(2)細胞接觸式共培養:通過樣品入口池B將涎腺腺樣囊性癌細胞(ACCM)和matrigel的混合物加入培養小室B，放置于CO2培養箱內；待膠凝20-30min后，通過樣品入口池A將間充質干細胞(MSCs)加入培養小室A，放置于CO2培養箱內；待膠凝20-30min后，灌流通道A和B中加入細胞培養液，細胞培養液每天更換一次；(3)細胞混合式共培養:將涎腺腺樣囊性癌細胞(ACCM)和間充質干細胞(MSCs)以10:1的比例混合在matrigel中，通過樣品入口池B加入細胞混合物和matrigel,放置于CO2培養箱內，待膠凝20-30 min后,通過樣品入口池A加入不含任何細胞的matrigel,待膠凝20-30 min后，形成膠與細胞的清晰界面，然后在灌流通道A和B分別加入含有細胞趨化因子的培養液和不含有細胞趨化因子的培養液。本發明提供的 細胞共培養方法，所述三維基質膠matrigel為小鼠癌組織中提取的基底膜樣物質，低溫(0_4°C)時為液態，室溫時凝固成膠態；所述細胞趨化因子為基質細胞衍生因子CXCL12 ;所述濃度梯度表征中，細胞共培養單元橫向的濃度梯度用異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐(FIEC-dextran,分子量為10000 Da)分子表征。總之，本發明可在一塊幾平方厘米的芯片上進行細胞接觸式共培養和混合式共培養，同時能夠維持穩定的細胞趨化因子的濃度梯度，從而在體外構建腫瘤細胞的微環境，有效的模擬生物體內細胞與細胞因子，細胞與基質、細胞與細胞之間的相互作用。本發明具有操作簡單、制作簡單和樣品用量少等特點，具有重要的生物醫學研究價值和經濟價值。


圖1本發明微流控芯片整體結構示意圖，其中:(1)灌流通道A，(2)灌流通道B，
(3)樣品入口池A，(4)樣品入口池B，(5)灌流通道A入口池，(6)灌流通道B入口池，(7)灌流通道A廢液池，(8)灌流通道B廢液池，(9)培養小室A，( 10)培養小室B ；
圖2顯示相鄰的兩個培養小室在不同灌流時刻的實際拍攝熒光圖片，其中:(a)0h;(b) 5h ; (c) 24h ；
圖3相鄰培養小室5 h時產生穩定熒光濃度梯度及熒光強度分布 圖4相鄰培養小室24 h時能夠維持穩定熒光濃度梯度及熒光強度分布 圖5芯片上細胞接觸式共培養:兩種細胞在不同的培養小室中，膠凝后，兩側灌流通道均加入細胞培養液；
圖6芯片上細胞混合式共培養:一側培養小室無細胞，一側培養小室加入兩種細胞混合物，形成細胞混合式共培養，兩側灌流通道分別加入含有細胞趨化因子的培養液和不含有細胞趨化因子的培養液；
圖7芯片上接觸式共培養涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM與間充質干細胞MSCs ；
圖8間充質干細胞MSCs在涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM的誘導作用下發生的遷移距離隨著共培養時間的變化柱狀圖；圖9細胞趨化因子存在的條件下，涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM的定向遷移；
圖10細胞趨化因子存在的條件下，間充質干細胞MSCs促進涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM的定向遷移。
具體實施例方式下面的實 施例將對本發明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發明。實施例1
所用微流控芯片為本實驗室自行設計及制備。芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。如圖1所示，灌流通道尺寸為長10 mm，寬500 μ m，高200-300 μ m (圖中黑色區域)，培養小室A的尺寸為直徑I mm，高120 μπι (圖中灰色區域)，培養小室B的尺寸為直徑I mm，高50 μπι (圖中淺灰色區域)。用移液器取5μ I的三維基質膠Matrigel，通過樣品入口池順序加入培養小室B和Α，并將其放入37°C培養箱孵育20-30 min。待膠凝后，向灌流通道A和B分別加入含有FITC_dextran的培養液和不含有熒光染料的培養液，并保證以0.4 μ Ι/min的流速持續灌流。結果顯不在O h時在相鄰的兩個培養小室中未發現有滅光物質存在,此時定乂為最初的起始點，隨著灌流通道A和B中培養液的引入和持續灌流；在5 h時,在相鄰的兩個培養小室的橫向方向上形成了 FITC-dextran的濃度梯度(圖2)，其熒光強度的分布圖見圖3 ;在24 h時，在相鄰的兩個培養小室的橫向方向上依然可以穩定的保持著FITC-dextran的濃度梯度(圖2)，其熒光強度的分布圖見圖4。在持續灌流的條件下，該芯片可以產生穩定的濃度梯度，能夠保證下一步實驗中產生細胞趨化因子的穩定濃度梯度的需要。實施例2
細胞接觸式共培養:包括細胞活體標記、細胞加樣、細胞芯片共培養和拍照檢測四部分。首先，利用CellTracker Red和CellTracker Green分別對涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM和間充質干細胞MSCs進行活體細胞染色，終濃度均采用5 μ M0染色完成后，進行細胞消化，通過樣品入口池B將涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM和matrigel的混合物加入培養小室B，放置于CO2培養箱內；待膠凝20-30 min后，通過樣品入口池A將間充質干細胞MSCs加入培養小室A ;放置于CO2培養箱內；待膠凝20-30 min后，灌流通道A和B中加入細胞培養液，細胞培養液每天更換一次。在O h，24 h, 48 h分別進行拍照記錄細胞所處位置，將最初兩種細胞的相交面作為細胞遷移的起始位置。從圖片中可以看出隨著共培養時間的加長，間充質干細胞MSCs定向的朝著涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM所處的位置發生移動，箭頭處明顯可見(圖7)。數據分析圖也顯示了相同的結果(圖8)。實施例3
腫瘤細胞的定向遷移:包括細胞活體標記、細胞加樣、細胞芯片培養、細胞趨化因子濃度梯度生成、細胞拍照。首先，利用CellTracker Red對涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM進行活體細胞染色，終濃度均采用5 μ M0染色完成后，進行細胞消化。將涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM混在matrigel三維基質膠中，通過樣品入口池B加入細胞和matrigel的混合物,放置于CO2培養箱內，待膠凝20-30 min后，通過樣品入口池A加入不含任何細胞的matrigel，待膠凝20-30 min后，可以形成膠與細胞的清晰界面，隨后通過注射泵在灌流通道A和B分別引入含有有細胞趨化因子的培養液和不含有細胞趨化因子的培養液，并保證0.4 μ 1/min的流速持續灌流。可以看到隨著培養時間的加長，ACCM細胞在細胞趨化因子CXCL12的作用下，發生了定向移動。(圖9)
實施例4
細胞混合式共培養:包括細 胞活體標記、細胞加樣、細胞芯片共培養和拍照檢測四部分。首先，利用CellTracker Red和CellTracker Green分別對涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM和間充質干細胞MSCs進行活體細胞染色，終濃度均采用5 μ M0染色完成后，進行細胞消化。將涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM和間充質干細胞MSCs混合在matrigel三維基質膠中，通過樣品入口池B加入細胞混合物和matrigel，放置于CO2培養箱內，待膠凝20-30 min后，通過樣品入口池A加入不含任何細胞的matrigel,待膠凝20-30 min后，可以形成膠與細胞的清晰界面，隨后通過注射泵在灌流通道A和B分別引入含有細胞趨化因子的培養液和不含有細胞趨化因子的培養液，并保證0.4 μ Ι/min的流速持續灌流。可以看到，同單獨只有細胞趨化因子CXCL12的情況下相比，涎腺腺樣囊性癌細胞ACCM的遷移距離得到了較大的增加，這說明在這種共培養條件下，間充質干細胞MSCs具有促進ACCM細胞遷移能力提高的作用(圖10)。
權利要求
1.一種產生穩定濃度梯度的微流控芯片，其特征在于:該微流控芯片由灌流通道、入口池、培養小室、廢液池和微通道組成； 其中:灌流通道包括灌流通道A (I)、灌流通道B (2)； 入口池包括樣品入口池A (3)、樣品入口池B (4)、灌流通道A入口池(5)、灌流通道B入口池(6)； 廢液池包括灌流通道A廢液池(7 )，灌流通道B廢液池(8 ); 培養小室包括培養小室A (9)和培養小室B (10)； 培養小室A和培養小室B左右相連形成一個細胞共培養單元；培養小室的上端與樣品入口池相連，灌流通道與培養小室通過微通道相連。
2.按照權利要求1所述產生穩定濃度梯度的微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。
3.關于權利要求1所述微流控芯片的細胞共培養方法，其特征在于:利用該芯片產生穩定的濃度梯度，進而進行細胞接觸式共培養和/或細胞混合式共培養；具體步驟如下: (1)濃度梯度表征:用移液器取三維基質膠matrigel，通過樣品入口池B和A順序加入培養小室B和A，將其放入37°C培養箱孵育20-30min，待膠凝后，向灌流通道A和B分別加入含有異硫氰酸熒光素FITC標記的熒光染料的培養液和不含有熒光染料的培養液，并保證以一定的流速持續灌流； (2)細胞接觸式共培養:通過樣品入口池B將涎腺腺樣囊性癌細胞(ACCM)和matrigel的混合物加入培養小室B，放置于CO2培養箱內；待膠凝20-30min后，通過樣品入口池A將間充質干細胞(MSCs)加入培養小室A，放置于CO2培養箱內；待膠凝20-30min后，灌流通道A和B中加入細胞培養液，細胞培養液每天更換一次； (3)細胞混合式共培養:將涎腺腺樣囊性癌細胞(ACCM)和間充質干細胞(MSCs)以10:1比例混合在matrigel中，通過樣品入口池B加入細胞混合物和matrigel,放置于CO2培養箱內，待膠凝20-30 min后，通過樣品入口池A加入不含任何細胞的matrigel，待膠凝20-30min后，形成膠與細胞的清晰界面，然后在灌流通道A和B分別加入含有細胞趨化因子的培養液和不含有細胞趨化因子的培養液。
4.按照權利要求3所述細胞共培養方法，其特征在于:所述三維基質膠matrigel為小鼠癌組織中提取的基底膜樣物質，低溫時為液態，室溫時凝固成膠態。
5.按照權利要求3所述細胞共培養方法，其特征在于:所述細胞趨化因子為基質細胞衍生因子CXCL12。
6.按照權利要求3所述細胞共培養方法，其特征在于:所述濃度梯度表征中，細胞共培養單元橫向的濃度梯度用異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐FIEC-dextran分子表征。
7.按照權利要求3所述細胞共培養方法，其特征在于:所述步驟(I)中的灌流流速為0.4 μ1/min。
8.按照權利要求6所述細胞共培養方法，其特征在于:所述FIEC-dextran分子的分子量為 10000 Da。
全文摘要
本發明提供一種產生穩定濃度梯度的微流控芯片及細胞共培養方法，該微流控芯片由灌流通道、入口池、培養小室、廢液池和微通道組成，本發明可在一塊幾平方厘米的芯片上進行細胞接觸式共培養和混合式共培養，同時能夠維持穩定的細胞趨化因子的濃度梯度，從而在體外構建腫瘤細胞的微環境，有效的模擬生物體內細胞與細胞因子，細胞與基質、細胞與細胞之間的相互作用，本發明具有操作簡單、制作簡單和樣品用量少等特點，具有重要的生物醫學研究價值和經濟價值。
文檔編號C12N5/0775GK103087912SQ20111033133
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者秦建華, 馬慧朋 申請人:中國科學院大連化學物理研究所