專利名稱：Rna干擾沉默水稻黑條矮縮病毒多個基因的載體構建方法
技術領域：
本發明提供了水稻黑條矮縮病毒多基因干擾的構建方法，屬于分子遺傳學領域， 專用于水稻抗黑條矮縮病的轉基因育種。
背景技術：
水稻黑條矮縮病(Rice black-streaked dwaf disease)是一種以灰飛虱為主要介體進行傳播的病毒病，主要侵染禾谷類作物和禾本科雜草。病株癥狀為濃綠矮縮，葉片僵直，不抽穗或穗小。葉背的葉脈和莖桿上有短條瘤狀突起，該突起在發病初期呈臘白色，后變為黑褐色。發病田塊一般減產10%-40%，重病田甚至顆粒無收。該病曾于20世紀60 年代中期在我國華東諸省市不少地區廣泛發生，此后年發病面積逐年下降，但近年來，隨著灰飛虱的大爆發，該病又迅速回升流行，近年來江蘇部分地區危害嚴重。已有研究證實水稻黑條矮縮病病原是水稻黑條矮縮病毒(rice black-streaked dwaf virus, RBSDV)。該病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)， 全基因組測序工作已經完成，總長^141bp，基因組由10條雙鏈RNA組成，按分子量大小命名為Sl-SlO ；RNA依賴的RNA聚合酶、外殼蛋白、沉默抑制子等重要功能基因已經明確。該病的流行病學研究表明，水稻黑條矮縮病毒不能由卵傳遞到下一代，RBSDV必須由灰飛虱在帶毒的寄主植物食毒后才能帶毒和傳播病毒。由于江淮流域近幾年灰飛虱蟲量基數大，而田間雜草，禾本科作物，如玉米是RBSDV的寄主，因此通過灰飛虱的食毒和傳毒， 該病可能在江淮流域水稻生產區大發生。抗病育種是防治水稻黑條矮縮病的有效手段，而抗病資源是開展水稻抗病育種的前提。目前水稻黑條矮縮病的接種鑒定技術體系還未完全建立，抗病資源鑒定工作才起步， 主要依靠田間自然誘發鑒定，抗病育種尚屬空白。因此篩選新的水稻黑條矮縮病抗病資源和借助基因工程手段創造抗水稻黑條矮縮病的新資源對于防治RBSDV具有重要意義。RNA干擾不僅是生物基因表達調控的一種基本機制，同時RNA干擾也是動植物抗病毒的一種防衛機制。將病毒的某一序列設計成可轉錄為雙鏈RNA結構導入植物體使之表達，可誘發RNA沉默，使植物通過RNA沉默病毒基因獲得抗病毒能力。但一些研究也發現 RNA沉默抗病效率不高甚至根本達不到抗病效果的現象。已有研究都主要是針對單鏈正義的RNA病毒基因組序列為靶位點來設計siRNA，， 選擇的基因主要是復制酶基因、外殼蛋白基因。沉默抑制子基因發現后，發現干擾沉默抑制子基因較其它基因的效果更好。利用miRNA方法在同一載體中設計針對多個基因的靶位點干涉的途徑對艾滋病毒具有很好的抑制效果。目前還沒有利用RNA沉默機制來研究雙鏈 RNA病毒的抗病性的研究報道。本發明利用利用重疊PCR將多個病毒基因編碼片段連接，構建發夾結構，針對基因組復雜的雙鏈RNA病毒RBSDV進行基因沉默，并以多個病毒基因為靶位點進行沉默，以期獲得多基因沉默抗水稻黑條矮縮病的新資源，提高抗病效率。

發明內容
技術問題本發明的目的是利用重疊PCR將多個病毒基因編碼片段連接，構建發夾結構，針對基因組復雜的雙鏈RNA病毒RBSDV進行基因沉默，并以多個病毒基因為靶位點進行沉默， 主要用于水稻黑條矮縮病的轉基因高效分子育種。技術方案水稻黑條矮縮病多基因沉默RNA干擾載體構建方法，其特征在于用于克隆水稻黑條矮縮病毒4個基因片段和重疊PCR的引物片段Si，RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)Sl-For :5，GGTGGAACGAAAGTTCAGTAGATC 3，Sl-Rev :5’ GGTGCTTCAGGCAAAAAGTTGTCAGAATTTGGACTACACTTGGACGAA 3，片段S2，核心蛋白基因(CPl)S2-For 5，CTGACAACTTTTTGCCTGAAGCACCAGAGCGACAAGAAGAATCGAAA3，S2~Rev :5’ TGGGATCAGACGAAAATATTGGACGCAAAAGTAGTTGTGTAAGCGGG 3，片段S6，沉默抑制子基因(SS)S6~For 5 CGTCCAATATTTTCGTCTGATCCCACTCGAATCATCCGTCACTTCTGAGT 3，S6-Rev 5' TGCGTTTGTTGACCATTACCATGAAGGACAAAACCTTTCCAATTATCGAG 3'片段S10，外殼蛋白基因(CP2)SlO-For 5' TTCATGGTAATGGTCAACAAACGCAGGAAACATTACTTTGAAGCCC 3'SlO-Rev :5’ CCACCATAATGTGTAACATCCGTA 3’其中，在下游引物Sl-Rev和上游引物S2-For的5 ‘端加相同的片段 GGTGCTTCAGGCAAAAAGTTGTCAG，用于進行重疊PCR，將片段Sl和S2連接；同理，在下游引物 S2-Rev和上游引物S6—For的5'端加相同的片段TGGGATCAGACGAAAATATTGGACG用于進行重疊PCR，將片段S2和S6連接；在下游引物S6-Rev和上游引物SlO-For的5'端加相同的片段TGCGTTTGTTGACCATTACCATGAA，用于進行重疊PCR，將片段S6和SlO連接。擴增水稻黑條矮縮病毒的cDNA，可以獲得S1、S2、S6和和SlO共4個片段，大小分別為235bp,340bp,317bp,277bp ；然后利用引物Sl-For和引物S2-Rev,以片段Sl和片段 S2為模板進行PCR，將片段Sl和片段S2連接，獲得605bp片段；利用引物S6-For和引物 SlO-Rev,以片段S6-For和SlO-Rev為模板進行PCR，將S6和SlO連接，獲得574bp片段； 最后以引物Sl-For和引物SlO-Rev，以605bp片段和574bp為模板進行PCR獲得1179bp片段。利用該病毒多基因融合片段可以用于后續的RNA干擾載體構建。有益效果本研究所提供的水稻黑條矮縮病多基因干擾構建方法，具有如下優點通過本發明獲得了可對水稻黑條矮縮病毒多個基因進行干擾的RNA干擾表達載體構建方法。


圖1水稻黑條矮縮病毒S1、S2、S6、S10片段PCR擴增產物在的瓊脂糖膠電泳結果；(M 為 DNA ladder, a 為 lOObp，b 為 300bp, c 為 500bp, d 為 700bp, e 為 11Λ，f 為 1. 5kb, g 為 2kb ；1、2、3、4 為 RBSDV S1、S2、S3、S4 的 RT-PCR 產物)圖2S1與S2，S6與SlO融合的PCR產物在1 %的瓊脂糖膠電泳結果(M為 DNAladder, a 為 lOObp，b 為 300bp，c 為 500bp，d 為 700bp，e 為 1. Okb, f 為 1. 5kb, g 為 2. Okb ； 1是S6與SlO重疊PCR產物，2是Sl與S2重疊PCR產物)圖3S1、S2、S6與SlO重疊PCR產物在的瓊脂糖膠電泳結果。(M為DNA ladder, a 為 lOObp，b 為 300bp，c 為 500bp，d 為 700bp，e 為 1. Okb, f 為 1. 5kb, g 為 2. 01Λ ;1 為 4 個片段重疊PCR產物)
具體實施例方式下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。(一 )水稻黑條矮縮病多基因融合片段的構建方法1、RBSDV 總 RNA 提取和 cDNA 合成所用的玻璃、瓷器、鐵器均采用干熱(180°C )滅菌4h以上；配試劑等均用0. 1% DEPC處理水。實驗步驟如下50_100mg感染水稻黑條矮縮病的水稻葉片組織加入液氮充分研磨，待樣品凍融之前加Iml Trizol，樣品體積不能超過Trizol的10%，繼續研磨直至完全溶解，吸入離心管， 1200g離心IOmin (40C )，取上清，15-30°C 5min ；加0. 2ml氯仿(19 1的氯仿異戊醇) 溶液，用力搖15s，15-30°C 2-3min,2-8°C< 1200g離心15min，上層液相約為總體積的60% ； 取上清，加0. 5ml異丙醇，混勻，15-300C 10min，2_8°C< 1200g離心IOmin ；去上清，加75% 乙醇Iml (0. DEPC水配制)，振蕩，2-8°C< 7500g 5min ；去乙醇，空氣干燥，用0. 1 % DEPC 處理的水溶解，于_70°C冷凍保存。按下列反應體系和條件進行反轉錄反應逆轉錄反應體系(25μ 1)為先將總 RNA 1 μ 1 (2 μ g), Oligo dT (15)引物 2. 5 μ 1 和純水混合，70°C變性5min后，迅速冰上冷卻；然后再依次添加其它成分。包括5Xbuffer 2· 5μ 1，dNTP(10mmol/L)2. 5μ 1，RNasin 0. 5μ 1，逆轉錄酶(AMV) 1 μ 1，純水 12. 5 μ 1。 42 °C，Ih ;95°C，加熱5min終止反應。2、RBSDV多個基因部分編碼區的克隆、測序以及重疊PCR連接根據已測序的RBSDV的基因組序列設計引物。分別設計合成RBSDV的RNA依賴的 RNA 聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRP)、核心蛋白(Core protein)、沉默抑制基因(Putative silencing suppressor)、外殼蛋白(Coat protein)編碼基因的 4對引物。 用于本研究RT-PCR的黑條矮縮病病毒的4個片段所在基因組位置及片段大小見下表1 (詳情請登陸:http://www. iah. bbsrc. ac. uk/dsRNA virus proteins/Fiji virus, htm)。在設計好的下游引物和另一對引物的上游引物添加相同的20個堿基，通過重疊PCR可以分別將 Sl和S2，S2和S6，S6和SlO連接，最后將S1，S2，S6和SlO連接成一個片段，送公司測序確認。用于克隆4個基因片段和重疊PCR的引物RNA 依賴的 RNA 聚合酶(RdRp)Sl-For :5，GGTGGAACGAAAGTTCAGTAGATC 3，
5
Sl-Rev :5，GGTGCTTCAGGCAAAAAGTTGTCAGAATTTGGACTACACTTGGACGAA 3，核心蛋白基因(CPl)S2-For 5' CTGACAACTTTTTGCCTGAAGCACCAGAGCGACAAGAAGAATCGAAA3>S2-Rev :5’ TGGGATCAGACGAAAATATTGGACGCAAAAGTAGTTGTGTAAGCGGG 3，沉默抑制子(SS)S6-For :5，CGTCCAATATTTTCGTCTGATCCCACTCGAATCATCCGTCACTTCTGAGT 3'S6-Rev 5' TGCGTTTGTTGACCATTACCATGAAGGACAAAACCTTTCCAATTATCGAG 3'外殼蛋白(CP2)SlO-For 5' TTCATGGTAATGGTCAACAAACGCAGGAAACATTACTTTGAAGCCC 3'SlO-Rev :5’ CCACCATAATGTGTAACATCCGTA 3’表1用于構建干擾RBSDV的RNA依賴的RNA聚合酶基因(Si)、核心蛋白基因(S2)、 沉默抑制子基因(S6)和外殼蛋白基因(SlO)所在基因組信息
權利要求
1.RNA干擾沉默水稻黑條矮縮病毒多個基因的載體構建方法，其特征在于利用重疊 PCR方法將黑條矮縮病毒的多個基因的編碼片段融合為一個片段，構建成方向重復的RNA 干擾載體，對病毒多個基因進行干擾，以達到抗病目的。
全文摘要
本發明涉及水稻抗黑條矮縮病的多基因沉默RNA干擾載體構建方法，屬于分子遺傳學領域。用重疊PCR方法將水稻黑條矮縮病毒編碼基因融合成一個片段，在片段連段再加酶切位點，分別連接到內含子前和后，利用過量表達啟動子構建成干擾多個病毒基因的干擾載體。
文檔編號C12N15/66GK102443602SQ20111033130
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者仲維功, 朱金燕, 楊杰, 王軍, 范方軍 申請人:江蘇省農業科學院