microRNA的測序試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物領域，特別涉及核酸的檢測技術，具體為microRNA的測序方法，根據靶位點設計待測microRNA的特異性的擴增引物和待測microRNA的焦磷酸測序引物，所述擴增引物的其中一條引物被生物素標記；提取待測樣本的DNA，用設計的所述擴增引物進行PCR擴增反應，得擴增引物，其中，所述特異性擴增引物中的任一條用生物素標記；將所得PCR擴增物采用堿變性分開成單鏈，取其中生物素標記單鏈PCR擴增產物純化后，與所述測序引物進行雜交反應，并分析結果;本發明所選取的microRNA靶序列，以及應用本發明的試劑盒能夠實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測microRNA基因型，能夠滿足臨床檢驗實際工作的需要，利于microRNA基因檢測預測疾病的發生、發展風險。
【專利說明】microRNA的測序試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體涉及適用于二重PCR及二重焦磷酸測序法檢測microRNA基因多態性的試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]microRNA是一類進化高度保守、內源性表達、單鏈非編碼、長約18_25個核苷酸(nucleotide nt)的小 RNA 分子。microRNA 通過與祀分子 mRNA 序列 3’-UTR、5’UTR及開放閱讀框互補匹配引起靶分子mRNA降解或翻譯抑制，調控著人類功能基因的表達和活性。microRNA是重要的轉錄后調節因子，在細胞增殖、分化與凋亡、應激抵抗、脂肪代謝等生理過程中發揮重要作用，microRNA表達失衡參與各種疾病的發生發展過程。其基因多態性影響著自身及鄰近microRNA表達、二級結構和與靶基因作用能力(RNA2009, 15(9): 1640-1651)，是引起個體及種族間疾病發生發展差異性的原因之一。
[0003]眾多研究表明miCToRNA基因多態性影響著腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病的發生、預后風險。如has-miR-146a rs2910164G — C增加乳腺癌(PLoS0ne2012,7(2):e31615)、肝癌(Carcinogenesis2008, 29 (11):2126-2131)、肺結核(HumImmuno12011, 72(7):598-602)發病風險；has-miR-196a_2rsll614913T — C 縮短肺癌生存時間(J Clin Invest2008, 118(7):2600-2608);has_miR-499rs3746444A —G提高乳腺癌發病率(Hum Mutat2009, 30(1):79-84) ；has-miR-608rs4919510G — C 增加結直腸癌(CancerEpidemiol Biomarkers Prev2012, 21 (1): 217-227; PLoS 0ne2012, 7 (5): e36306)、腎癌(Carcinogenesis2010, 31(10): 1805-1812)、鼻咽癌(Cancer Res2013)預后及乳腺癌(PLoS0ne2012, 7(5):e35252)發 生風險。
[0004]microRNA基因多態性檢測方法包括直接測序法、熒光標記探針法、限制性內切酶法等。焦磷酸測序技術是新一代基于酶級聯反應的DNA序列分析技術，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，將DNA單鏈上的每一個dNTP聚合與一次熒光信號釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。該技術具有其獨特的優勢，無需電泳、DNA片段無需熒光標記。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量、靈敏度高等特點，符合臨床大樣本檢測要求。目前，還沒有基于焦磷酸測序技術的microRNA基因多態性檢測方法。
[0005]本發明是基于上述現有技術，并針對現有技術的不足進行改進發明的。

【發明內容】

[0006]有鑒于此，本發明提供一種microRNA的測序方法，該方法以焦磷酸測序技術為基礎，準確度高，操作簡便。
[0007]為實現上述目的，本發明的技術方案為:
[0008]microRNA的測序方法，所述測序方法為焦磷酸測序法,或結合二重PCR擴增技術，具體包括以下步驟:[0009]A特異性引物的設計引物設計[0010]根據祀位點設計待測microRNA的特異性的擴增引物和待測microRNA的焦磷酸測序引物，所述擴增引物的其中一條引物被生物素標記；
[0011]B PCR 反應
[0012]提取待測樣本的DNA，用步驟A涉及的所述擴增引物進行PCR擴增反應，得擴增引物，其中，所述特異性擴增引物中的任一條用生物素標記；
[0013]C焦磷酸測序
[0014]將步驟B所得PCR擴增物采用堿變性分開成單鏈，取其中生物素標記單鏈PCR擴增產物純化后，與步驟A所述測序引物進行雜交反應，并分析結果。
[0015]進一步,所述的microRNA的測序方法,所述祀位點包括has_miR-146ars2910164、has_miR-149rs2293832、 has-miR-196a_2rsll614913、 has_miR-492rs2289030、has_miR-544b rs10934682>has_miR-604rs2368392、has-miR-605rs2043556 和has-miR-608rs4919510位點中的一個或多個。
[0016]進一步,所述的microRNA的測序方法,在步驟B中，has_miR-146a rs2910164和has-miR-608rs4919510 進行二重 PCR, has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556進行二重 PCR，has-miR-196a-2rsll614913 和 has-miR-604rs2368392 進行二重PCR, has-miR-492rs2289030 和 has_miR-544b rsl0934682 進行二重 PCR。
[0017]進一步，所述的microRNA的測序方法，在步驟B中，has_miR-146a rs2910164和 has-miR-608rs4919510 進行二重 PCR 的退火溫度為 62 °C ；has-miR-149rs2293832 和has-miR-605rs2043556 進行二重 PCR 的退火溫度為 55 °C ;has-miR-196a_2rsl 1614913和 has-miR-604rs2368392 進行二重 PCR 的退火溫度為 52 °C ；has-miR-492rs2289030 和has-miR-544b rs 10934682 進行二重 PCR 的退火溫度為 58°C。
[0018]進一步，所述的microRNA的測序方法，在步驟A中，所述擴增引物具體為:has-miR-146a rs2910164位點的特異性引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2 所示；
[0019]上游引物:5’ accatctctgaaaagccgatgt3’
[0020]下游引物:bio_5，caagcccacgatgacagagatat3，
[0021]1?Β8-π?Κ-149ι^2293832位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID Ν0:3所示，下游引物如SEQ ID Ν0:4所示;
[0022]上游引物:bio_5’gctctggctccgtgtctt3’
[0023]下游引物:5’cgtcagccacctctcaca3’
[0024]has-miR-196a-2rsll614913位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID NO:5 ^示，下游引物如SEQ ID N0:6所示;
[0025]上游引物:5，agctgatctgtggcttaggtagtt3，
[0026]下游引物:bio_5，tcgacgaaaaccgactgat3，
[0027]has-miR-492rs2289030位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:7所示，下游引物如SEQ ID N0:8所示;
[0028]上游引物:bio_5，aggacctgcgggacaaga3’
[0029]下游引物:5，agcacccaaacactcaaacca3，[0030]has-miR-544b rsl0934682位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:9所示，下游引物如SEQ ID NO: 10所示；
[0031]上游引物:5’ gcggccagaagcaataattaagac3’
[0032]下游引物:bio_5，ggcactttgttagaaatgcacaacc3，
[0033]has-miR-604rs2368392位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:11所示，下游引物如SEQ ID NO: 12所示；
[0034]上游引物:5’ gtctaaaaaccgtctccagagc3’
[0035]下游引物:bio_5，gtcagaaaacctgcctgctag3’
[0036]has-miR-605rs2043556位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:13所示，下游引物如SEQ ID NO: 14所示；
[0037]上游引物:bio_5，ttgggaaaaacagagaaggc3，
[0038]下游引物:5，gaggccaggaaaaaacacat3，
[0039]has-miR-608rs4919510位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:15所示，下游引物如SEQ ID NO: 16所示；
[0040]上游引物:bio_5，gccagcctggacaatataatgagact3，
[0041]下游引物:5，gcagcctttgatggaagctctt3，
[0042]進一步，所述的microRNA`的測序方法，在步驟A中，所述測序引物具體為:
[0043]has-miR-146a rs2910164的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所不:5’ ttgtgtcagtgtcagacc3’
[0044]has-miR-149rs2293832的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所不:5’ ccggcgacctgcgtt3>
[0045]has-miR-196a-2rsll614913 的測序引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 19 所:5，gaactcggcaacaag3，
[0046]has-miR-492rs2289030的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所不:5’ aacttggttcagaagtcat3’
[0047]has-miR-544b rsl0934682的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所不:5’ tgttaaaatgcagaatcc3’
[0048]has-miR-604rs2368392的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所不:5’ ggagagcatcgtgctt3’
[0049]has-miR-605rs2043556的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所不:5’ cctgtatctgcagtcct3>
[0050]has-miR-608rs4919510的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所不:5’ agatgcctttttaaacg3’
[0051]本發明的目的之二在于提供一種試劑盒，其能用于檢測microRNA多態性。
[0052]為實現上述目的，本發明的技術方案為:
[0053]用于檢測microRNA多態性的試劑盒,所述試劑盒包括待測microRNA的特異性擴增引物，待測microRNA的特異性焦磷酸測序引物，以及PCR反應液、PCR產物篩選液、焦磷酸測序反應液。
[0054]進一步，所述的試劑盒，所述特異性擴增引物has-miR_146a rs2910164位點的特異性引物:所述特異性擴增引物如SEQ ID NO: 1-2所示，和/或所述特異性擴增引物如SEQID NO:3-4所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID NO:5-6所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID NO:7-8所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID N0:9_10所示;和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID NO: 11-12所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ IDNO: 13-14所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID NO: 15-16所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID NO: 17-18所示。
[0055]所述的用于檢測microRNA多態性的試劑盒在制備用于診斷膿毒癥診斷試劑盒中的應用。
[0056]本發明的有益效果在于:(I)本發明提供的PCR引物二重組合擴增目的片段，電泳結果顯示二重組合下的兩條目的DNA條帶均等明亮、單一，說明本發明提供的二重組合PCR擴增引物效率高，兩對引物擴增效率相當。(2)從對樣本microRNA基因多態性焦磷酸測序結果(附圖1)可以看出，采用本發明的試劑盒及方法，能夠簡捷、直觀、準確的對microRNA基因型進行檢測和判讀。
[0057]綜上,本發明所選取的microRNA祀序列，以及應用本發明的試劑盒能夠實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測microRNA基因型，能夠滿足臨床檢驗實際工作的需要，利于miCToRNA基因檢測預測疾病的發生、發展風險。【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1 為 has-miR-146a rs2910164 和 has_miR-608rs4919510 雙重 PCR 的基因型分
析結果圖；
[0059]圖 2 為 has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556 雙重 PCR 的基因分析結果圖；
[0060]圖 3 為 has-miR-196a-2rsl 1614913 和 has_miR-604rs2368392 雙重 PCR 的基因分
析結果圖；
[0061]圖 4 為 has-miR-492rs2289030 和 has_miR-544b rs 10934682 雙重 PCR 的基因分
析結果圖。
【具體實施方式】
[0062]以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。
[0063]【具體實施方式】
[0064]下面結合實施例對上述試劑盒及檢測方法進行詳細描述。
[0065]一引物的設計
[0066]利用NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov) GenBank 革F1 序列位點及其附近約 500bp 基因組序列。利用焦磷酸測序儀附帶軟件“Assay Design”設計單核甘酸多態性位點PCR擴增引物及焦磷酸測序引物，選擇評分最高的引物對。設計好的引物委托上海生物工程有限公司合成，并進行其中一條PCR引物5’端生物素修飾。
[0067]I)組合 1:has-miR-146a rs2910164 和 has_miR-608rs4919510[0068]has_miR-146a rs2910164
[0069]上游引物:5，accatctctgaaaagccgatgt3’
[0070]下游引物:bio_5，caagcccacgatgacagagatat3，
[0071]has-miR-608rs4919510C/G
[0072]上游引物:bio_5，gccagcctggacaatataatgagact3，
[0073]下游引物:5，gcagcctttgatggaagctctt3，
[0074]測序引物
[0075]has-miR-146a rs2910164:5’ ttgtgtcagtgtcagacc3’
[0076]has_miR-608rs4919510:5， agatgcctttttaaacg3’
[0077]2)組合 2:has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556
[0078]has-miR-149rs2293832
[0079]上游引物:bio_5，GCTCTGGCTCCGTGTCTT3，
[0080]下游引物:5，CGTCAGCCACCTCTCACA3’
[0081]has-miR-605rs2043556 [0082]上游引物:bi0-5，TTGGGAAAAACAGAGAAGGC3 ’
[0083]下游引物:5，GAGGCCAGGAAAAAACACAT3，
[0084]測序引物
[0085]has-miR-149rs2293832:5’ CCGGCGACCTGCGTT3’
[0086]has-miR-605rs2043556:5’ CCTGTATCTGCAGTCCT3’
[0087]3)組合 3:has-miR-196a-2rsll614913 和 has_miR-604rs2368392
[0088]has-miR-196a_2rsl1614913
[0089]上游引物:5’ AGCTGATCTGTGGCTTAGGTAGTT3 ’
[0090]下游引物:bio-5，TCGACGAAAACCGACTGAT3’
[0091]has-miR-604rs2368392
[0092]上游引物:5，GTCTAAAAACCGTCTCCAGAGC3’
[0093]下游引物:bio-5，GTCAGAAAACCTGCCTGCTAG3，
[0094]測序引物
[0095]has-miR-196a-2rsll614913:5，GAACTCGGCAACAAG3，
[0096]has-miR-604rs2368392:5，GGAGAGCATCGTGCTT3’
[0097]4)has-miR-492rs2289030 和 has-miR-544b rsl0934682 組合
[0098]has-miR-492rs2289030
[0099]上游引物:bio-5，AGGACCTGCGGGACAAGA3，
[0100]下游引物:5’ AGCACCCAAACACTCAAACCA3 ’
[0101]has_miR-544b rsl0934682
[0102]上游引物:5’ GCGGCCAGAAGCAATAATTAAGAC3，
[0103]下游引物:bio-5，GGCACTTTGTTAGAAATGCACAACC3，
[0104]測序引物
[0105]has-miR-492rs2289030:5，AACTTGGTTCAGAAGTCAT3，
[0106]has-miR-544b rsl0934682:5’TGTTAAAATGCAGAATCC3’[0107]二全血基因組DNA提取
[0108]實驗前試劑材料準備與檢查工作如下:
[0109]檢查全血基因組DNA純化試劑盒(以美國Promega公司生產試劑為例)、焦磷酸測序試劑保質期及確保Wash Buffer中已添加乙醇，并在瓶蓋做好標記；異丙醇和75%乙醇；高壓滅菌有效期內的1.5ml Eppendorf (EP)管和各種型號移液器和槍頭。從-80冰箱取出EDTA抗凝管收集的創傷患者外周血，室溫下解凍并上下顛倒數次混勻；分別移取300ul全血和900ul Cell Lysis Solution加入做好對應樣本標記的1.5ml EP管,室溫孵育10分鐘，每隔2-3分鐘顛倒混勻一次；1000Og, 4°C離心I分鐘；取出EP管，觀察白色沉淀，棄去紅色上清；重復操作2-3次,直到沉淀中無紅色團塊；加入300ul Nuclei Lysis Solution,充分振蕩混勻，用Iml或200ul移液器將沉淀完全打散，室溫放置10分鐘以充分裂解細胞；加入 IOOul Protein Precipitation Solution,劇烈振蕩 20 秒可見顆粒狀沉淀；12000g,4°C離心3分鐘；觀察上清，若不清澈，增加離心時間，若清澈用移液器緩慢吸出上清液到新的1.5ml EP管中，記錄體積,加入等體積預冷異丙醇(_20°C預冷),輕輕上下顛倒數次至白色絮狀DNA析出；12000g，4°C離心3分鐘，可見管底白色沉淀，棄上清；加入500ul預冷75%乙醇(_20°C預冷)，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；12000g，4°C離心2分鐘，棄上清；在清潔的實驗臺上放置新濾紙，倒扣EP管，吸干液體，風干DNA沉淀；目測沉淀大小，加入50-100ul DNARehydration Solution，65°C水浴放置15分鐘，每隔5-6分鐘取出渦旋振蕩充分溶解DNA沉淀；完全溶解后用Nano-Space紫外分光光度計測定核酸濃度和純度，核酸濃度大于20ng/ul視為合格，如濃度不足，可加入乙醇再次沉淀DNA并溶解。在管壁和管蓋再次標清樣本編號，保存DNA樣本至_80°C冰箱備用。
[0110]三聚合酶鏈反應
[0111]在試劑制備區配制50ul PCR反應體系(DNA模板除外)，各組分及添加量如下表:
[0112]
【權利要求】
1.microRNA的測序方法，其特征在于，所述測序方法為焦磷酸測序法，或結合二重PCR擴增技術，具體包括以下步驟: A特異性引物的設計引物設計 根據靶位點設計待測microRNA的特異性的擴增引物和待測microRNA的焦磷酸測序引物，所述擴增引物的其中一條引物被生物素標記； B PCR反應 提取待測樣本的DNA，用步驟A涉及的所述擴增引物進行PCR擴增反應，得擴增引物，其中，所述特異性擴增引物中的一條用生物素標記； C焦磷酸測序 將步驟B所得PCR擴增物采用堿變性分開成單鏈，取其中生物素標記單鏈PCR擴增產物純化后，與步驟A所述測序引物進行雜交反應，并分析結果。
2.根據權利要求1所述的microRNA的測序方法，其特征在于:所述靶位點包括 has_miR-146a rs2910164> has_miR-149rs2293832、has-miR-196a_2rsl 1614913、has-miR-492rs2289030>has_miR-544b rsl0934682> has_miR-604rs2368392、has-miR-605rs2043556 和 has_miR-608rs4919510 位點中的一個或多個。
3.根據權利要求2所述的microRNA的測序方法，其特征在于:在步驟 B 中，has-miR-146a rs2910164 和 has_miR-608rs4919510 進行二重 PCR，和 / 或 has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556 進行二重 PCR，和 / 或has-miR-196a-2rsll614913 和 has_miR-604rs2368392 進行二重 PCR，和 / 或has-miR-492rs228903`0 和 has_miR-544b rsl0934682 進行二重 PCR。
4.根據權利要求3所述的microRNA的測序方法，其特征在于:在步驟B中，has-miR-146a rs2910164 和 has_miR-608rs4919510 進行二重 PCR 的退火溫度為 62 °C ；has-miR-149rs2293832 和 has-miR-605rs2043556 進行二重 PCR 的退火溫度為 55 °C ;has-miR-196a-2rsl 1614913 和 has_miR-604rs2368392 進行二重 PCR 的退火溫度為 52°C ；has-miR-492rs2289030 和 has_miR-544b rs 10934682 進行二重 PCR 的退火溫度為 58°C。
5.根據權利要求3所述的microRNA的測序方法，其特征在于:在步驟A中，所述擴增引物具體為: has-miR-146a rs2910164位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示； has-miR-149rs2293832位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示； has-miR-196a-2rsll614913位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:5所示，下游引物如SEQ ID NO:6所示； has-miR-492rs2289030位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:7所示，下游引物如SEQ ID NO:8所示； has-miR-544b rsl0934682位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID N0:9所示，下游引物如SEQ ID NO: 10所示； has-miR-604rs2368392位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID NO: 11所示，下游引物如SEQ ID NO: 12所示；has-miR-605rs2043556位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID NO: 13所示，下游引物如SEQ ID NO: 14所示； has-miR-608rs4919510位點的特異性引物:其上游引物如SEQ ID NO: 15所示，下游引物如SEQ ID NO: 16所示。
6.根據權利要求3所述的microRNA的測序方法，其特征在于:在步驟A中，所述測序引物具體為: has-miR-146a rs2910164的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示: has-miR-149rs2293832的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所示； has-miR-196a-2rsll614913的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示; has-miR-492rs2289030的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示； has-miR-544b rsl0934682的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示； has-miR-604rs2368392的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示； has-miR-605rs2043556的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示； has-miR-608rs4919510的測序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示。
7.用于檢測microRNA多態性的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒包括待測microRNA的特異性擴增引物，待測microRNA的特異性焦磷酸測序引物，以及PCR反應液、PCR產物篩選液、焦磷酸測序反應液。
8.根據權利要求7所述的試劑盒,其特征在于:所述特異性擴增引物has-miR-146ars2910164位點的特異性引物如SEQ ID NO: 1_2所示，和/或所述特異性擴增引物如SEQ IDN0:3-4所示；和/或所述特 異性擴增引物如SEQ IDN0:5-6所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID N0:7-8所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID Ν0:9_10所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ IDN0:11-12所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID NO: 13-14所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQ ID NO: 15-16所示；和/或所述特異性擴增引物如SEQID NO: 17-18 所示。
9.權利要求7所述的用于檢測microRNA多態性的試劑盒在制備用于診斷膿毒癥診斷試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103509863SQ201310376423
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月26日 優先權日:2013年8月26日
【發明者】張安強, 蔣建新, 顧瑋, 曾靈, 楊策 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院