專利名稱：高通量測序文庫的構建方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體地，涉及DNA甲基化檢測技術，特別是涉及基因組特定區域的甲基化檢測。更具體地，本發明提供了一種構建高通量測序文庫的方法、一種確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的方法、一種用于確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的裝置以及一種用于構建樣本的基因組特定區域高通量測序文庫的試劑盒。
背景技術：
DNA甲基化是研究最為深入的表觀遺傳學機制，DNA甲基化在維持正常細胞功能、抑制寄生DNA成分對基因組完整性的損害、染色質結構修飾、X染色體失活、基因組印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。然而，目前對基因組特定區域如啟動子區域、CpG島區域、CpG島外區域以及印記基因區域的甲基化檢測的研究，仍有待改進。

發明內容
本發明旨在解決現有技術問題的至少之一。由此，為了代表性檢測基因組上特定區域的甲基化信息，本發明提供了高通量測序文庫的構建方法及其應用。根據本發明的一個方面，本發明提供了一種構建高通量測序文庫的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟:將基因組DNA片段化，以便獲得DNA片段；將所述DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段；在所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得具有粘性末端A的DNA片段；將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連，以便獲得連接產物；利用特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲，以便獲得目的片段；將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿 嘧啶，獲得經過轉換的目的片段；將所述經過轉換的目的片段進行PCR擴增，以便獲得擴增產物；以及分離純化所述擴增產物，所述擴增產物構成所述高通量測序文庫。利用根據本發明實施例的構建高通量測序文庫的方法，能夠有效地構建基因組DNA樣品的高通量測序文庫，特別是能夠有效地構建基因組DNA樣品的已知甲基化位點的特定區域的高通量測序文庫，從而能夠有效、充分地應用于高通量測序技術，通過對文庫的測序，然后基于對測序結果的數據分析，能夠有效地獲得基因組特定區域的甲基化位點信息，實現對基因組DNA樣品的基因組特定區域的甲基化檢測。根據本發明的另一方面，本發明提供了一種確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的方法。根據本發明的實施例，該方法包括下列步驟:根據前面所述構建高通量測序文庫的方法，構建所述樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫；對所述樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫進行測序，以便得到測序結果；以及對所述測序結果進行數據分析，以便確定所述樣本的基因組特定區域的甲基化信息。利用根據本發明實施例的確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的方法，能夠準確地確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息，從而實現對樣本的基因組特定區域的甲基化檢測。根據本發明的再一方面，本發明提供了一種用于確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的裝置。根據本發明的實施例，該裝置包括:文庫制備單元，所述文庫制備單元用于制備樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，所述文庫制備單元內設置有特異性探針；測序單元，所述測序單元與所述文庫制備單元相連，并且從所述文庫制備單元接收所述樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，以便用于對所述樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫進行測序，獲得測序結果；以及數據分析單元，所述數據分析單元與所述測序單元相連，并且從所述測序單元接收所述測序結果，以便對所述測序結果進行數據分析，確定所述樣本的基因組特定區域的甲基化信息。利用根據本發明實施例的用于確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的裝置，能夠方便準確地確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息，可以應用于多種針對基因組特定區域的甲基化的研究。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種用于構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包括:特異性探針，所述特異性探針是對已知甲基化位點特異性的。利用根據本發明實施例的用于構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫的試劑盒，能夠方便有效地構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。


本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
圖1:顯示了根據本發明一個實施例的構建高通量測序文庫的方法的流程示意圖；圖2:顯示了根據本發明一個實施例的方法確定基因組特定區域甲基化信息時，在不同覆蓋深度下(覆蓋深度> I及覆蓋深度> 5)，每條染色質上的捕獲區域占探針靶區域的百分比圖。圖3:顯示了根據本發明一個實施例的方法確定基因組特定區域甲基化信息時，在不同覆蓋深度下，各條染色質中檢測到甲基化信息的啟動子占該染色質的總啟動子的百分比圖。圖4:顯示了根據本發明一個實施例的方法確定基因組特定區域甲基化信息時，基因組上啟動子區域、CpG島、CpG島外(在本文中指為CGI shore)及印記基因區域的甲基化水平分布結果。(a)顯示了根據本發明一個實施例的確定的樣本的基因組CpG島、CGI shore區域的甲基化水平分布圖。(b)顯示了根據本發明一個實施例的確定的樣本的基因組啟動子區域的甲基化水平分布圖。
(c)顯示了樣本的基因組特定區域的原始分布和根據本發明一個實施例的確定的樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫的reads分布及啟動子、CpG島區域的甲基化水平分布圖。圖5:顯示了根據本發明一個實施例的用于確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的裝置的示意圖。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。構建高通量測序文庫的方法根據本發明的一個方面，本發明提供了一種構建高通量測序文庫的方法。參考圖1，根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟:首先，將基因組DNA片段化，以便獲得DNA片段。在本發明中所使用的術語“DNA”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經過修飾的或者未經修飾的DNA。本領域的技術人員可以理解，基因組DNA的來源不受特別限制，可以從任何可能的途徑獲得，可以是通過市售直接獲得，也可以是從其他實驗室直接獲取，還可以是直接從樣本中提取。根據本發明的實施例，可以從樣本中提取獲得基因組DNA。根據本發明的一個實施例，構建高通量測序文庫的方法可以進一步包括從樣本中提取基因組DNA的步驟。根據本發明的一些具體示例，樣本可以來源于哺乳動物、植物、和微生物的至少一種。根據本發明的一些實施例，哺乳動物可以為人和小鼠的至少一種。根據本發明的一個實施例，基因組DNA可以為人類全血基因組DNA，優選為外周血單核細胞基因組DNA。發明人發現，當采用YH cell基因組DNA構建高通量測序文庫時，從樣本中提取基因組DNA的操作方便易行，且獲得的DNA質量好、甲基化信息完整，由其構建的樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫能夠方便地應用于高通量測序技術，從而基于對測序結果的數據分析就能方便有效地獲得樣本的基因組特定區域的甲基化信息。根據本發明的實施例，基因組DNA的量不受特別限制，根據本發明的具體示例，優選基因組DNA的量為2 μ g。發明人驚奇地發現，當基因組DNA的量為2μ g時，根據本發明實施例的構建高通量測序文庫的方法構建的樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，能夠非常方便地應用于高通量測序技術，如Solexa測序技術，且文庫測序結果準確，可重復性好，包含的特定區域的甲基化信息準確、甲基化位點覆蓋率高。其次，將DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段。根據本發明的一個實施例，在將DNA片段進行末端修復前，可以進一步包括純化DNA片段的步驟，由此，使得后續的末端修復易于進行。根據本發明的實施例，將DNA片段進行末端修復可以利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進行，其中，所述Klenow片段具有5’ 一3’聚合酶活性和3’ — 5’聚合酶活性,但缺少5’ — 3’外切酶活性。由此,能夠方便準確地對DNA片段進行末端修復。根據本發明的實施例，還可以進一步包括對經過末端修復的DNA片段進行純化的步驟，由此能夠方便地進行后續處理。接下來， 在經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得具有粘性末端A的DNA片段。根據本發明的一個實施例，可以利用Klenow(3’ -5’ exo-)，即具有3’ 一5’外切酶活性的Klenow，在經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A。由此，能夠方便準確地將堿基A添加到經過末端修復的DNA片段的3’末端。根據本發明的實施例，還可以進一步包括對具有粘性末端A的DNA片段進行純化的步驟，由此能夠方便地進行后續處理。接著，將具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連，以便獲得連接產物。本發明中所使用的術語“甲基化接頭”是指這樣的一種接頭，在其核苷酸序列中，所有C位點均被甲基化修飾。根據本發明的一個實施例，在將具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連前，可以進一步包括對常規測序所使用的接頭進行甲基化的步驟。由此，能夠有效避免測序接頭對后續重亞硫酸鹽處理等操作的干擾。本領域的技術人員可以理解，對接頭進行甲基化的方法不受特別限制，可以利用本領域已知的任何方法對測序接頭進行甲基化。根據本發明 的一些實施例，甲基化接頭中還可以進一步包含標簽，由此可以方便地同時構建多種樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，并能夠有效地應用于高通量測序平臺，從而在對測序結果進行數據分析后，基于標簽的序列信息，就能夠準確地區分多種樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫的序列信息以及樣本的基因組特定區域的甲基化信息，由此，能夠充分地利用高通量測序平臺，且能夠節省時間、降低成本。根據本發明的一個實施例，將具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連是利用T4DNA連接酶進行的，由此可以方便地獲得連接產物。根據本發明的實施例，還可以進一步包括對連接產物進行純化的步驟，由此能夠方便地進行后續處理。然后，利用特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲，以便獲得目的片段。根據本發明的實施例，這里的術語“特異性探針”是指探針是對已知甲基化位點特異性的。根據本發明的具體示例，特異性探針是基于采用人類基因組作為參考序列，并且采用基因組上已知具有甲基化位點的特定基因區域作為靶序列而設計的，具體地，已知具有甲基化位點的基因區域包括選自啟動子區域、CpG島區域、CpG島外區域以及印記基因區域的至少一種，由此，利用根據本發明實施例的特異性探針進行雜交捕獲，能夠有效地捕獲樣本中與靶序列互補的序列，即樣本中已知具有甲基化位點的基因區域(在本說明書中，有時也稱為“基因組特定區域”)。此外，根據本發明的一個實施例，在雜交捕獲前，可以進一步包括利用諸如c0t-lDNA和接頭封閉序列的單鏈寡核苷酸對連接產物(尤其是連接產物的基因組序列中的重復區域)和連接產物上的甲基化接頭進行雜交封閉的步驟。發明人驚奇地發現，當使用^t-1DNA和接頭封閉序列分別對連接產物(尤其是連接產物的基因組序列中的重復區域)和連接產物上的甲基化接頭進行雜交封閉后，能夠顯著地增強對連接產物的雜交捕獲。根據本發明的實施例，Cj-1DNA的使用量不受特別限制，根據具體的示例，優選采用過量的^t-1DNA對連接產物的基因組序列中的重復區域進行雜交封閉。其中，這里所使用的術語“過量”是指qt-lDNA的量遠大于待進行雜交捕獲的連接產物的量，即采用qt-lDNA的量可以是待進行雜交捕獲的連接產物的量的2倍以上。根據本發明的具體示例，優選，采用^t-1DNA的量為待進行雜交捕獲的連接產物的量的5倍。根據本發明的一些實施例，采用^t-1DNA的量小于待進行雜交捕獲的連接產物的量的5倍，則封閉雜交不徹底，重復序列的非特異性強雜交背景信號干擾強烈，嚴重影響核酸雜交的效率；而采用^t-1DNA的量大于待進行雜交捕獲的連接產物的量的5倍，則過多的^t-1DNA會影響探針與連接產物的結合，同樣會影響核酸雜交的效率。由此，采用待進行雜交捕獲的連接產物的量的5倍的c0t-lDNA對連接產物的基因組區域重復序列進行雜交封閉，能夠方便、有效地進行封閉，以去掉重復序列DNA，從而在后續的核酸雜交過程中，能夠有效避免重復序列產生的非特異性強雜交背景信號的干擾，顯著提高核酸雜交的效率，增強雜交效果。根據本發明的實施例，接頭封閉序列包括選自Blockl和Block2的至少一種，由此，能夠有效地對連接產物上的甲基化接頭進行封閉。根據本發明的實施例，可以采用Iug的連接產物進行所述雜交捕獲，由此能夠提高雜交捕獲的效率。根據本發明的具體示例，利用特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲，可以進一步包括利用鏈霉素磁珠捕獲目的片段，由此，能夠高效地捕獲目的片段。接下來，將目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，獲得經過轉換的目的片段。根據本發明的實施例，在將目的片段進行重亞硫酸鹽處理之前，可以進一步包括將目的片段與片段化的λ-DNA混合。發明人發現，通過添加外源DNA ( λ -DNA)，即將目的片段與外源DNA混合，然后進行重亞硫酸鹽高效共處理，對目標DNA片段能夠起到保護作用，最大限度地降低重亞硫酸鹽對微量DNA的破壞，可以進一步提高檢測精度，使得較少量的基因組DNA，甚至納克級，例如50-150ng基因組的甲基化檢測成為現實。根據本發明的實施例，片段化的λ-DNA的添加量不受特別限制，根據具體的示例，優選片段化的λ -DNA的量為200-400ng，更優選為200ng。本領域技術人員能夠理解，可以通過本領域已知的任意方法制備這些片段化的λ -DNA，例如可以隨同前面的DNA片段化處理一起進行制備。此外，將目的片段進行重亞硫酸鹽處理，可以通過本領域已知的任何方法進行，根據本發明的具體示例，可以采用商品化的試劑盒進行，優選地采用EZ DNAMe thy lation-Go IdK it (ZYMO)進行。發明人驚奇地發現，米用 EZ DNA Methylation-GoldKit (ZYMO)對目的片段進行重亞硫酸鹽處理時，方便快捷，且處理效果好，目的片段中非甲基化的胞嘧啶能夠高效準確地轉換為`尿嘧啶，并且利于后續處理。然后，將經過轉換的目的片段進行PCR擴增，以便獲得擴增產物。根據本發明的實施例，可以使用熱啟動taq DNA聚合酶對經過轉換的目的片段進行PCR擴增。根據本發明的實施例，熱啟動taq DNA聚合酶的種類不受特別限制，根據本發明的具體示例，熱啟動taqDNA聚合酶可以為r_taq聚合酶，由此PCR擴增效率高、用時少。最后，分離純化擴增產物，所得到的擴增產物構成全基因組甲基化高通量測序文庫。根據本發明的實施例，分離純化擴增產物的方法不受特別限制，根據本發明的具體示例，可以通過選自磁珠純化、純化柱純化和2%的瓊脂糖凝膠電泳的至少一種進行，優選通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行。根據本發明的一些具體示例，高通量測序文庫的文庫片段長度為300-450bp，由此，高通量測序文庫能夠方便有效地應用于高通量測序平臺如Solexa測序平臺，且可重復性好，測序結果真實可靠，包含特異性探針所針對的基因組特定區域的甲基化信息較完整。利用根據本發明實施例的構建高通量測序文庫的方法，能夠有效地構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，從而能夠有效、充分地應用于高通量測序技術，通過對高通量測序文庫的測序，然后基于對測序結果的數據分析，就能夠有效地獲得樣本的基因組特定區域的甲基化信息，實現對樣本的基因組特定區域的甲基化檢測。確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的方法和裝置
根據本發明的另一方面，本發明提供了一種確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的方法。根據本發明的實施例，該方法包括下列步驟:根據本發明實施例的構建高通量測序文庫的方法構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫；對該樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫進行測序，以便得到測序結果；以及對測序結果進行數據分析，以便確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息。根據本發明的一些實施例，測序是利用高通量測序技術進行的。本領域的技術人員可以理解，可以通過本領域已知的任何高通量測序技術進行測序，根據本發明的具體示例，優選地利用Hiseq2000測序儀進行測序。發明人發現,利用Hiseq2000測序儀對樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫進行測序，能夠有效地獲得測序結果，且測序用時少、效率高、測序結果準確，可重復性好。利用根據本發明實施例的確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的方法，能夠有效地構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，并且能夠通過高通量測序技術如Solexa測序技術實現對文庫的準確測序，基于對測序結果的數據分析，就能夠準確地確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息，從而實現對樣本的基因組特定區域的甲基化檢測，且特定區域的甲基化位點覆蓋多，獲得甲基化信息完整。根據本發明的再一方面，本發明提供了一種用于確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的裝置1000。參考圖5，根據本發明的一個實施例，該裝置包括:文庫制備單元100、測序單元200以及數據分析單元300。根據本發明的實施例，文庫制備單元100用于制備樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，其中，文庫制備單元100內設置有特異性探針。根據本發明的實施例，特異性探針是對已知甲基化位點特異性的。根據本發明的具體示例，特異性探針是基于采用人類基因組作為參考序列，并且采用基因組上已知具有甲基化位點的特定基因區域作為靶序列而設計的，具體地，已知具有甲基化位點的基因區域包括選自啟動子區域、CpG島區域、CpG島外區域以及印記基因區域的至少一種，由此，利用根據本發明實施例的特異性探針進行雜交捕獲，能夠有效地捕獲樣本中與靶序列互補的序列，即樣本中已知具有甲基化位點的基因區域。由此，文庫 制備單元100可以適于實施前面所述的高通量測序文庫構建方法。測序單元200與文庫制備單元100相連，可以從文庫制備單元100接收所制備的樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，并對所接收的樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫進行測序，從而可以獲得測序結果。數據分析單元300與測序單元200相連，可以從測序單元200接收所獲得的測序結果，并且能夠進一步對測序結果進行數據分析，從而基于分析結果確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息，最終實現對樣本的基因組特定區域的甲基化檢測。本領域技術人員能夠理解的是，可以采用本領域中已知的任何適于進行上述操作的裝置作為上述各個單元的組成部件。在本文中所使用的術語“相連”應作廣義理解，可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，對于本領域的普通技術人員而言，可以根據具體情況理解上述術語的具體含義。利用根據本發明實施例的用于確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的裝置，能夠方便準確地確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息，從而可以應用于多種針對基因組特定區域，如已知甲基化位點的基因組區域的甲基化的研究，例如可以用于對基因組特定區域的甲基化異常進行檢測。試劑盒根據本發明的另一方面，本發明提供了一種用于構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包括:特異性探針，該特異性探針是對已知甲基化位點特異性的。根據本發明的一些具體示例，特異性探針是基于采用人類基因組作為參考序列，并且采用基因組上已知具有甲基化位點的特定基因區域作為靶序列而設計的，具體地，已知具有甲基化位點的基因區域包括選自啟動子區域、CpG島區域、CpG島外區域以及印記基因區域的至少一種，由此，利用根據本發明實施例的特異性探針進行雜交捕獲，能夠有效地捕獲樣本中與靶序列互補的序列，即樣本中已知具有甲基化位點的基因區域。本領域的技術人員可以理解，試劑盒中還可以進一步包括構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫所需的任何其他組分，在此不再贅述。利用根據本發明實施例的用于構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫的試劑盒，能夠方便有效地構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫。需要說明的是，根據本發明實施例的構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫的方法及其應用，是本申請的發明人經過艱苦的創造性勞動和優化工作完成的。下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1:本實施例以2 μ g的人類外周血單核細胞基因組DNA為樣本，按照下列步驟實施。
`
一、基因組DNA片段化:利用C0VariS-S2打斷儀，按照下表設置的參數，將樣本基因組DNA進行片段化處理，以便獲得DNA片段。
處理I~ 負載比(％)| 10 ^5
循環/脈沖 200^
時間(s)50
處理2 時間(s)O
處理3 時間(s)O
處理4 時間(s)O
~lm3
將獲得的DNA片段進行電泳檢測，要求DNA片段主帶集中在150_300bp之間，無蛋白、RNA污染。利用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)或磁珠純化，將檢測合格的DNA片段純化回溶到32 μ I的洗脫緩沖液中，備用。用同樣的方法制備200_400ng的片段化的λ -DNA，其中λ -DNA為外源非甲基化的。二、末端修復:I)將上一步獲得的DNA片段按照下表在1.5mL的離心管中配制末端修復反應體系:
權利要求
1.一種構建高通量測序文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將基因組DNA片段化，以便獲得DNA片段； 將所述DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段； 在所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得具有粘性末端A的DNA片段； 將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連，以便獲得連接產物； 利用特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲，以便獲得目的片段； 將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，獲得經過轉換的目的片段； 將所述經過轉換的目的片段進行PCR擴增，以便獲得擴增產物；以及 分離純化所述擴增產物，所述擴增產物構成所述高通量測序文庫， 其中， 任選地，進一步包括從樣本中提取基因組DNA的步驟，優選所述樣本來源于哺乳動物、植物、和微生物的至少一種，更優選所述哺乳動物為人和小鼠的至少一種，優選所述基因組DNA為人類全血基因組 DNA，更優選所述基因組DNA為外周血單核細胞基因組DNA ； 優選，所述基因組DNA的量為2 μ g ; 任選地，利用covariS-S2打斷儀將基因組DNA片段化； 任選地，所述DNA片段的長度為約150-300bp，優選200_300bp ； 任選地，在將所述DNA片段進行末端修復前，進一步包括純化DNA片段的步驟； 任選地，將所述DNA片段進行末端修復是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進行的，其中，所述Klenow片段具有5’ 一 3’聚合酶活性和3’ 一 5’聚合酶活性，但缺少5’ 一 3’外切酶活性； 任選地，將所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A是利用Klenow (3，-5’ exo_)進行的； 任選地，所述甲基化接頭中包含標簽； 任選地，將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連前，進一步包括對接頭進行甲基化的步驟； 任選地，將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連是利用T4DNA連接酶進行的； 任選地，在獲得連接產物后，進一步包括對連接產物進行純化的步驟； 任選地，所述特異性探針是對已知甲基化位點特異性的，優選所述特異性探針是基于采用人類基因組作為參考序列，并且采用已知具有甲基化位點的基因區域作為靶序列而設計的，可選地，所述已知具有甲基化位點的基因區域包括選自啟動子區域、CpG島區域、CpG島外區域以及印記基因區域的至少一種； 任選地，在所述雜交捕獲前，進一步包括利用^t-1DNA和接頭封閉序列分別對所述連接產物和所述連接產物上的甲基化接頭進行雜交封閉的步驟，優選采用過量的^t-1DNA對所述連接產物進行雜交封閉，可選地，所述接頭封閉序列包括選自Blockl和Block2的至少一種； 任選地，采用I μ g的連接產物進行所述雜交捕獲；任選地，利用特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲進一步包括利用鏈霉素磁珠捕獲所述目的片段； 任選地，在將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理之前，進一步包括將所述目的片段與片段化的λ -DNA混合，優選所述片段化的λ -DNA的量為200-400ng，更優選200ng ； 任選地，將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理是采用EZ DNA Methylation-GoldKit (ZYMO)進行的； 任選地，使用熱啟動taq DNA聚合酶進行所述PCR擴增； 任選地，分離純化所述擴增產物是通過選自磁珠純化、純化柱純化和2%的瓊脂糖凝膠電泳的至少一種進行的，優選通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行； 任選地，所述高通量測序文庫的文庫片段長度為300-450bp。
2.一種確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的方法，其特征在于，包括下列步驟: 根據權利要求1所述的方法構建所述樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫； 對所述樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫進行測序，以便得到測序結果；以及 對所述測序結果進行數據分析，以便確定所述樣本的基因組特定區域的甲基化信息。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述測序是利用高通量測序技術進行的。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述測序是利用Hiseq2000測序儀進行的。
5.一種用于確定樣本的基因組特定區域的甲基化信息的裝置，其特征在于，包括: 文庫制備單元，所述文庫制備單元用于制備樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，所述文庫制備單元內設置有特異性探針； 測序單元，所述測序單元與所述文庫制備單元相連，并且從所述文庫制備單元接收所述樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫，以便用于對所述樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫進行測序，獲得測序結果；以及 數據分析單元，所述數據分析單元與所述測序單元相連，并且從所述測序單元接收所述測序結果，以便對所述測序結果進行數據分析，確定所述樣本的基因組特定區域的甲基化信息。
6.根據權利要求5所述的裝置，其特征在于，所述特異性探針是對已知甲基化位點特異性的。
7.根據權利要求6所述的裝置，其特征在于，所述特異性探針是基于采用人類基因組作為參考序列，并且采用已知具有甲基化位點的基因區域作為靶序列而設計的。
8.根據權利要求7所述的裝置，其特征在于，所述已知具有甲基化位點的基因區域包括選自啟動子區域、CpG島區域、CpG島外區域以及印記基因區域的至少一種。
9.一種用于構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫的試劑盒，其特征在于，包括: 特異性探針，所述特異性探針是對已知甲基化位點特異性的。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性探針是基于采用人類基因組作為參考序列，并且采用已知具有甲基化位點的基因區域作為靶序列而設計的，可選地，所述已知具有甲基化位點的基因區域包括選自啟動子區域、CpG島區域、CpG島外區域以及印記基因區域的至少一種 。
全文摘要
提供了高通量測序文庫的構建方法及其應用。構建高通量測序文庫的方法包括將基因組DNA片段化；將DNA片段進行末端修復；在經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A；將具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連；利用特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲，以便獲得目的片段；將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶；將經過轉換的目的片段進行PCR擴增；分離純化擴增產物，該擴增產物構成高通量測序文庫。采用本發明的構建高通量測序文庫的方法及其應用，能夠方便有效地構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫。
文檔編號C40B40/06GK103103624SQ20111036203
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者王君文, 高飛, 蔣慧, 武靖華, 吳紅龍 申請人:深圳華大基因科技有限公司, 深圳華大基因研究院