專利名稱：可誘導增加拷貝數的質粒及其用于篩選正交性琥珀抑制tRNA的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過誘導增加拷貝數的質粒載體及其構建方法，屬于基因工程技術領域，國際專利分類為C12N 15/69。
背景技術：
近二十年來，一種遺傳密碼擴充技術突破了在生物體內由20種天然氨基酸編碼蛋白質的限制，從而使含有非天然基團氨基酸(unnatural amino acids，UAAs)的蛋白質分子能夠得以在大腸桿菌，酵母，哺乳動物中表達出來。遺傳密碼擴充技術的核心在于設計篩選獲得一對特異性正交氨酰tRNA合成酶和tRNA系統(orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNAsystem)，并利用“空白密碼子”如琥珀密碼子TAG等作為非天然氨基酸的編碼密碼子。正交性的涵義是指該正交氨酰tRNA合成酶僅特異性的將特定非天然氨基酸酰化到該正交tRNA上，而不會催化天然氨基酸的氨酰化反應；該正交tRNA僅能夠被該正交氨酰tRNA合成酶所識別，而不會被內源性氨酰tRNA合成酶所識別。該技術的方法包括 設計建立一個基于氨酰tRNA合成酶活性位點的合成酶突變文庫和一個基于tRNA非保守區位點的tRNA突變文庫，通過對文庫進行篩選從而獲得針對特定非天然氨基酸的正交氨酰 tRNA合成酶和tRNA系統。文庫的傳統篩選方法為氯霉素法。氯霉素法原理為將氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因中的一個非活性位點突變為琥珀密碼子TAG，若氨酰tRNA合成酶能夠將非天然氨基酸酰化到tRNA上，并由該氨基酰化的tRNA將氨基酸引入到氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因中的琥珀密碼子TAG上，則全長氯霉素乙酰轉移酶被翻譯表達，宿主菌在加入了氯霉素的培養基中存活；若氨酰tRNA合成酶不能將非天然氨基酸酰化到tRNA上，則氯霉素乙酰轉移酶基因的翻譯在琥珀密碼子TAG終止，全長氯霉素乙酰轉移酶不能表達，宿主菌在加入了氯霉素的培養基中死亡。基于該原理，篩選出的單菌落在以下情況下具有正交性在加入了非天然氨基酸和氯霉素的培養基中存活，同時在不加入非天然氨基酸加入氯霉素的培養基中死亡。本專利提供了一種雙復制子調控的質粒的構建及其在篩選正交tRNA 中的應用。本專利篩選方法的原理為高水平轉錄的異源tRNA如果被內源性氨酰tRNA合成酶識別將導致宿主菌的死亡。若tRNA突變文庫中的tRNA被宿主菌體內的內源性氨酰 tRNA合成酶識別，同時該tRNA的轉錄豐度很高，則導致宿主菌死亡，從而正交性差的tRNA 被篩選除去；若tRNA突變文庫中的tRNA不被宿主菌體內的內源性氨酰tRNA合成酶識別， 即使tRNA的轉錄豐度很高，菌株存活。本專利中構建的重組質粒是一種可誘導的雙復制子調控的質粒，在沒有誘導劑如IPTG的存在下，質粒的復制起始點為F因子復制起始點，該復制起始點是嚴謹型低拷貝復制起始點；在誘導劑IPTG存在條件下，Pl裂解復制起始點被啟動從而發揮作用，該復制起始點是高拷貝復制起始點。通過這種可誘導的雙復制子調控的質粒來調控異源tRNA的轉錄豐度，利用該質粒進行的篩選方法較氯霉素篩選法更快速，更高效，更直觀，適合大容量的tRNA突變文庫的篩選。

發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是構建一種雙復制子調控的重組質粒。所述的重組質粒，包括載體及基因片段，所述的載體含有兩個復制起始點，分別為F因子復制起始點和噬菌體Pl裂解復制起始點。所述的F因子復制起始點包括嚴謹型低拷貝復制起始點oriS和DNA解旋酶R印E 基因，RepE基因的登錄號為1263M7。所述的Pl裂解復制起始點oriL為高拷貝復制起始點，其復制起始嚴格受控制于一種復制起始蛋白質R印L，RepL基因的登錄號為2777395。所述的復制起始蛋白質R印L由大腸桿菌乳糖啟動子控制。所述的基因片段為反密碼子為琥珀突變(TAG)，非保守區為隨機突突變的tRNA基因。所述tRNA基因來源于詹氏甲烷球菌屬或酵母屬。所述的tRNA基因的啟動子和終止子為大腸桿菌脯氨酸轉運RNA的啟動子和終止子。所述的重組質粒的構建方法，包括以下工序LpF質粒構建全基因合成法合成一段基因，其序列包括DNA解旋酶R印E基因和oriS基因，插入用雙酶切的質粒PET28a中，轉化大腸桿菌，用卡那霉素篩選單克隆，即可；2.pFPl質粒構建全基因合成法合成一段基因，其序列包括大腸桿菌乳糖啟動子基因，復制起始蛋白質R印L基因和oriL基因，插入用雙酶切的質粒pF中，轉化大腸桿菌，用卡那霉素篩選單克隆，即可；3. pFPl-tRNA 質粒構建根據tRNA序列設計引物，重疊PCR(overlapping PCR)法擴增，回收450bp的PCR 產物，插入用雙酶切的質粒PFPl中，轉化大腸桿菌，即可。本發明所要解決的第二個技術問題是提供使用上述重組質粒篩選正交tRNA的方法。在引入非天然氨基酸的正交氨酰tRNA合成酶和tRNA系統中，需要通過分別對氨酰tRNA合成酶和tRNA進行篩選，以獲得高度正交的氨酰tRNA合成酶和tRNA分子對。本發明提出的篩選tRNA的方法原理為高水平轉錄的異源tRNA如果被內源性氨酰tRNA合成酶識別，將導致宿主菌的死亡。將本發明的重組質粒轉化大腸桿菌，在IPTG存在的條件下， 重組質粒的拷貝數將從原來< 10增加至> 100，由此異源tRNA的豐度將大大提高如果該 tRNA被內源性氨酰tRNA合成酶識別，則宿主菌死亡，表現為轉化無菌落生長；如果該tRNA 不被內源性氨酰tRNA合成酶識別，則宿主菌存活，表現為轉化生長出單菌落。本發明所要解決的第三個技術問題是對篩選得到的正交tRNA進行效率檢測。篩選得到的正交tRNA的效率通過β -半乳糖苷酶活性進行檢測。構建一個檢測質粒ρΤ 該載體含正交氨酰tRNA合成酶基因和在活性位點進行了琥珀突變的β -半乳糖苷酶基因。將重組質粒PFPl-tRNA和檢測質粒ρΤ共轉化大腸桿菌。加入特定非天然氨基酸的條件下，β-半乳糖苷酶活性越高，則正交tRNA效率越高，反之則越低。不加入特定非天然氨基酸的條件下，β -半乳糖苷酶活性越低，則tRNA正交性越高，反之則越低。


圖1為重組質粒pFPl-tRNA示意圖。圖2為雙酶切鑒定重組質粒pF。圖3為雙酶切鑒定重組質粒pFPl。圖4為雙酶切鑒定重組質粒pFPl-tRNA。圖5為正交tRNA的篩選。圖6為正交tRNA效率檢測。在圖1中1為卡那霉素基因片段；2為大腸桿菌脯氨酸轉運RNA的啟動子；3 為tRNA基因片段；4為大腸桿菌脯氨酸轉運RNA的終止子；5為大腸桿菌乳糖啟動子；6 為R印L基因片段和oriL基因片段；7為R印E基因片段；8為oriS基因；9為重組質粒 pFPl-tRNA。在圖2中M1為MarkerlKb ；1為重組質粒pF ；2為重組質粒pF用Eco57和BglI 雙酶切后的酶切產物。在圖3中Ml為MarkerlKb ；4為重組質粒pFPl ；3為重組質粒pFPl用XbaI和 BglII雙酶切后的酶切產物。在圖4中M2為Marker2 ；Ml為MarkerlKb ；6為重組質粒pFPl-tRNA ；5為重組質粒pFPl-tRNA用DraIII和HindIII雙酶切后的酶切產物。在圖5中1為沒有添加ImM IPTG的培養皿內菌落生長情況；2為添加ImM IPTG 的培養皿內菌落生長情況。在圖6中1-6為篩選出的重組質粒pFPl-tRNAl-6號分別與檢測質粒pT雙轉化的單菌落在含有ONPG和ImM特定非天然氨基酸的LB瓊脂培養基上的生長情況。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作詳細的說明。說明書及實施例中采用的菌株、質粒、化學試劑等，如未特殊說明均按常規實驗條件進行操作，或按供應商提供的說明進行操作。實施例1 雙復制子調控的重組質粒的構建LpF質粒構建全基因合成法合成一段基因，其序列包括DNA解旋酶R印E基因和oriS基因，用 Eco57和BglI雙酶切該基因片段，與Eco57和BglI雙酶切的質粒pET28a連接，轉化大腸桿菌DH5a，Kan篩選單克隆，進行酶切鑒定，獲得pF。如圖2所示，pF質粒大小約為4. 7kb,由于F因子復制起始點是用Eco57和BglI 雙酶切后插入PET28a的，故用Eco57和BglI雙酶切pF后，可以看見兩條條帶，大小約為 3. 7kb的載體片段和11Λ的基因片段。2. pFPl質粒構建全基因合成法合成一段基因，其序列包括Iac啟動子基因，復制起始蛋白質R印L 基因和oriL基因，用)(bal和BglII雙酶切該基因片段，與)(bal和BglII雙酶切的質粒pF連接，轉化大腸桿菌Dffia，Kan篩選單克隆，進行酶切鑒定，獲得pFPl。如圖3所示，pFPl質粒大小約為5. 81Λ，用)(baI和BglII雙酶切后有兩條帶，大小約為4. 7kb的載體片段和1. Ikb的基因片段。3. pFPl-tRNA 質粒構建設計兩對引物，重疊PCR(overlapping PCR)法擴增，回收450bp的PCR產物，用 DraIII和HindIII雙酶切PCR產物，插入用DraIII和HindIII雙酶切的質粒pFPl中，轉化大腸桿菌DH5a，Kan篩選單克隆，進行酶切鑒定，獲得pFPl-tRNA。如圖4所示，pFPl-tRNA質粒大小約為61Λ，用DraIII和HindIII雙酶切后有兩條帶，大小約為5. 5kb的載體片段和450bp的tRNA片段。實施例2 篩選正交性琥珀抑制tRNA將實施例1中所制備的重組質粒pFPl-tRNA轉化大腸桿菌，進行平板涂布時，涂布兩種Kan LB瓊脂培養基，一種含有終濃度為ImM的IPTG，一種不含有IPTG，37°C培養20小時。如圖5所示，添加了 ImM IPTG的培養皿內生長的單菌落較稀疏，而不添加IPTG的培養皿內生長密集。表明在IPTG的誘導下，重組質粒pFPl-tRNA的拷貝數增加，從而tRNA 的豐度大大增加，其中正交性差的tRNA因被內源性氨酰tRNA合成酶識別而菌落死亡；存活的單菌落內含的tRNA因未被內源性氨酰tRNA合成酶識別得以存活。由此篩選除去正交性差的tRNA，而保留較高正交性的tRNA。實施例3 正交tRNA效率檢測第一步構建一個檢測質粒pT 該載體含正交氨酰tRNA合成酶基因和在活性位點進行了琥珀突變的半乳糖苷酶基因。第二步將實施例2中篩選出的存活的單菌落，挑取6個單菌落接種于LB培養基中，37°C培養20小時，提取重組質粒pFPl-tRNAl-6號，將pFPl_tRNAl_6號分別與檢測質粒 PT共轉化大腸桿菌DH5a，涂布，37°C培養20小時。第三步從6塊轉化板上分別挑取一個單菌落，接種于含有ONPG和ImM特定非天然氨基酸的LB瓊脂培養基，37°C培養20小時。如圖6所示，在含有ONPG和ImM特定非天然氨基酸的LB瓊脂培養基上，菌體表現為藍色的單菌落，表明其中的相對應的正交tRNA效率較高，能夠將非天然氨基酸引入到 β-半乳糖苷酶基因的琥珀突變位點上，從而表達出全長半乳糖苷酶。菌體菌體表現為白色的單菌落，表明其中的相對應的正交tRNA效率較低，不能將非天然氨基酸引入到β -半乳糖苷酶基因的琥珀突變位點上，未能表達出全長半乳糖苷酶。
權利要求
1.一種重組質粒，包括載體和tRNA基因轉錄單元，其特征在于所述的載體含有兩個復制起始點，分別為F因子復制起始點和噬菌體Pl裂解復制起始點。
2.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于所述的F因子復制起始點包括嚴謹型復制起始點oriS和DNA解旋酶R印E基因，RepE基因的登錄號為1263M7。
3.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于所述的噬菌體Pl裂解復制起始點 oriL嚴格受控制于一種復制起始蛋白質R印L，RepL基因的登錄號為2777395。
4.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于所述的復制起始蛋白質R印L的啟動子為大腸桿菌乳糖啟動子。
5.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于所述tRNA基因轉錄單元包括啟動子、終止子和tRNA基因片段。
6.根據權利要求5所述的重組質粒，其特征在于所述啟動子和終止子為大腸桿菌脯氨酸轉運RNA的啟動子和終止子。
7.根據權利要求5所述的重組質粒，其特征在于所述tRNA基因片段來源于詹氏甲烷球菌屬或酵母屬。
8.根據權利要求7所述的重組質粒，其特征在于所述tRNA基因片段為琥珀抑制性 tRNA突變體，即反密碼子為琥珀突變(TAG)，非保守區為隨機突變的tRNA基因。
9.權利要求1所述的重組質粒的構建方法，包括以下工序(1)PF質粒構建全基因合成法合成一段基因，其序列包括DNA解旋酶R印E基因和 oriS基因，插入用雙酶切的質粒PET28a中，轉化大腸桿菌，用卡那霉素篩選單克隆，即可；(2)pFPl質粒構建全基因合成法合成一段基因，其序列包括大腸桿菌乳糖啟動子基因，復制起始蛋白質R印L基因和oriL基因，插入用雙酶切的質粒pF中，轉化大腸桿菌，用卡那霉素篩選單克隆，即可。
10.權利要求1所述的重組質粒PF質粒用于篩選正交性琥珀抑制tRNA，包括以下步驟(1)pFPl-tRNA質粒構建根據tRNA序列設計引物，采用重疊PCR(overlappingPCR)法擴增，回收PCR產物，插入用雙酶切的質粒pFPl中，轉化大腸桿菌，既得pFPl-tRNA質粒；(2)將pFPl-tRNA轉化大腸桿菌，涂布于含有終濃度為ImMIPTG的LB瓊脂培養基， 37 °C培養20小時；(3)挑取存活的單菌落，提取質粒，內含的tRNA因未被內源性氨酰tRNA合成酶識別得以存活，為正交性tRNA。
全文摘要
本發明涉及一種通過誘導增加拷貝數的質粒載體及其構建方法，該重組質粒，包括載體及基因片段，所述的載體含有兩個復制起始點，分別為F因子復制起始點和噬菌體P1裂解復制起始點；所述的基因片段包括含有啟動子和終止子的反密碼子為琥珀突變(TAG)，非保守區為隨機突變，來源為詹氏甲烷球菌屬或酵母屬的tRNA。本發明中所述的重組質粒可應用于篩選正交性琥珀抑制性tRNA分子，該方法與現有技術相比，更快速，更高效，更直觀，更適合大容量的tRNA突變文庫篩選。
文檔編號C12N15/10GK102443599SQ20111034190
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者劉靜嫻, 姚文兵, 田浤, 高向東 申請人:中國藥科大學