專利名稱：一種金黃色葡萄球菌菌株pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌菌株PCR檢測試劑
品.O
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，簡稱金葡)是醫學上重要的致病菌，其分布廣泛，感染類型多樣，耐藥率高，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(meticillin resistant staphylococcus aureus,MRSA)的感染呈多重耐藥，病死率較高，已成為臨床抗感染治療的難點。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至嚴重到敗血癥、膿毒癥等全身感染。目前臨床應用的金黃色葡萄球菌的檢測方法有常規涂片鏡檢法、培養法、免疫學測定、儀器自動化分析鑒定系統等方法，但是這些方法都存在一定的缺陷常規涂片鏡檢是是最基本的細菌學檢查方法，但是敏感性低，特異性差；培養法是目前臨床上發現傳染源的主要途徑和手段，是金黃色葡萄球菌診斷和治療方案的重要依據，目前仍然以培養法為“金標準”，但是非常耗時，不能實現快速的目的；免疫學測定方法對培養基的含鹽量有很高的要求，若含鹽量比較高，那么蛋白的合成會受到抑制，而出現假陰性；另外，粗糙型的葡萄球菌和酵母菌偶爾也可引起非特異反應，同時某些含有血漿蛋白結合因子的鏈球菌和其它個別菌類(例如腸桿菌屬的部分菌群)可以非特異地使乳膠顆粒凝集，而出現假陽性。儀器自動化分析鑒定系統，近年來，相關的革蘭氏陽性球菌快速鑒定系統不斷面市，如Biolog微生物自動分析系統、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系統等， 但這些快速鑒定系統大多數是應用于臨床革蘭氏陽性球菌的鑒定。常規PCR法雖然有簡便、快速、靈敏，的優勢，但是又不能精確定量和PCR后處理產生污染導致的假陽性等問題。

發明內容
本發明目的是采用聚合酶鏈式反應及分子信標熒光探針技術對金黃色葡萄球菌基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷金黃色葡萄球菌的存在，對金黃色葡萄球菌感染的輔助診斷。本發明的技術方案為提供一種金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒，包括PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括引物和熒光探針，所述引物分為上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2所示，所述熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。優選的，所述試劑盒還包括tap酶、UNG酶、陽性對照、陰性對照。
優選的，所述試劑盒引入了一個人工構建的neo內參照系統用于避免檢測結果假陰性，所述內參照系統包括上游引物核苷酸序列SEQ ID NO. 4;下游引物核苷酸序列SEQ ID NO. 5 ；探針核苷酸序列:SEQ ID NO. 6。優選的，所述熒光探針的5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ淬滅基團。本發明的有益效果為利用金黃色葡萄球菌基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷金黃色葡萄球菌的存在。本試劑盒具有靈敏度和特異性高、穩定、及時、操作方便等優點。使用了大腸桿菌新霉素基因作為內參照基因，它在金黃色葡萄球菌基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內參照以檢測每次PCR反應中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。


圖1 金黃色葡萄球菌nuc基因靈敏度檢測結果圖；圖2 金黃色葡萄球菌nuc基因特異性結果圖。
具體實施例方式本發明采用聚合酶鏈式反應(PCR)及分子信標熒光探針(MoleculA. r beacon)技術對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus, SA，簡稱金葡)基因中高保守特異性核酸序列(nuc基因)進行擴增檢測，從而判斷金黃色葡萄球菌的存在。從而指導臨床醫生對金黃色葡萄球菌感染的病人用藥，幫助預后判斷。 目的基因nuc的檢測因為nuc基因是金黃色葡萄球菌特有的耐熱核酸酶基因，所以對nuc基因的檢測可以區分金黃色葡萄球菌(SA)和凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)的。所述nuc基因序列如SEQ ID N0. 7所示。內參照原理試劑盒設置了內參照neo基因，即大腸桿菌新霉素基因。它在金葡基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內參照以檢測每次PCR反應中是否有PCR 抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。當內參照結果為陽時，表示PCR反應體系以及操作正常；因此當目的基因nuc結果為陰時，內參照結果為陽就顯得十分重要了。但當目的基因nuc結果為陽時，內參照的擴增曲線較目的基因陰性時內參照的擴增曲線要推遲，或是內參照結果為陰都是正常的。但是目的基因nuc和內參照基因neo結果都為陰時，該試驗視為無效，需再重復。陽性對照原理每次試驗都需同時做陽性對照。陽性對照結果為陽，表明對靶基因的檢測系統是正常的；而當結果為陰時，表明該次實驗無效，需重復。陰性對照原理為證明有否污染存在，每次試驗也需同時做陰性對照。陰性對照結果為陰，表明本次試驗無污染；如結果為陽，則表明該次實驗無效，需重復。實施例1本發明試劑盒的組成主要原材料來源及制備方法Tris 分析純，有合格資質的供應廠商的產品，含量99.7%，紅外合格，pH(5% 水)10. 3-10. 9，水份0. 3%，熔點167-171°c，吸收系統合格，雜質最高含量合格。MgCl2 分析純，有合格資質的供應廠商的產品，含量不少于99%，水溶液反應合格，雜質最高含量合格。(MgC12極易吸潮，啟用新瓶后放于干燥器下保存)。
EDTA 分析純，有合格資質的供應廠商的產品，為白色結晶狀粉末，溶于水，溶液呈酸性，難溶于醇，含量不少于99. 5 %，水溶液反應合格，絡合力試驗合格，雜質最高含量合格。HCl 分析純，北京化學試劑廠產品或有合格資質的供應廠商的產品。純化水購買樂百氏桶裝純凈水，然后經Mi 11 ipore公司的Mi 1 Ii-QBiocel型純水機處理，電阻率16-18ΜΩ。引物和探針本發明所應用的引物、探針均委托Sigma和Biosearch公司合成，并經Sigma質檢合格(含質譜鑒定)；其中nuc基因最優引物、探針序列組合如下上游引物A(SEQ ID NO. 1) :5，-AAAACACCCCTATCAAATGATAATC-3，；下游引物A(SEQ ID NO. 2) :5，-GAAGAACTCCGCGACGCA-3，；熒光探針A (SEQ ID NO. 3)5， -FAM-CATTATCAATGGATAGGGGCTATTTTAATAAAATTCG-BHQ-3，。其中neo內參照系統的引物、探針序列組合如下上游引物(SEQID NO. 4) :5，-GACTAAACTGGCTGACGG-3，；下游引物B (SEQ ID N0. 5) :5，-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3，；熒光探針B (SEQ ID N0. 6)5， -TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-S' 用于PCR反應的引物，紫外檢測結果A260nm:A280nm彡1.5可視為合格引物。_20°C保存。nuc探針在寡核苷酸5’端標記FAM，3，端標記BHQ，紫外檢測結果A260nm A280nm彡1. 5，在FAM熒光素的激發波長494nm處有吸收峰，-20°C保存。neo探針在寡核苷酸5，端標記TE)(rd，3，端標記BHQ，紫外檢測結果A260nm A280nm彡1. 5，在TEXrd熒光素的激發波長610nm處有吸收峰。_20°C保存。dNTPs :dATP、dCTP、dGTP、dUTP購自上海宏誼公司，或其他有合格資質的供應商， 并經出廠檢測合格；按照本公司相應的質量標準進行檢測合格后使用。根據供應商質量標準為HPLC純，無DNase和RNase污染。_20°C保存。Taq酶本產品在研制開發及生產過程中，所應用的Taq酶購自大連TaKaRa公司， 或其他有合格資質的供應商。濃度5U/y 1，含10XPCRBuffer、25mmOl/LMgC12，根據供應商質量標準本品具有DNA聚合酶活性，無3’ 一5’核酸外切酶活性及核酸內切酶活性；具熱穩定性，94V保溫1小時后仍保持50 %活性。-20 V保存。UNG酶本產品在研制開發及生產過程中，所應用的UNG酶購自Promega公司或其他有合格資質的供應商，按照本公司相應的質量標準進行檢測合格后使用。濃度> lU/μ 1， 根據供應商質量標準本品具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性， IUUNG在50°C 2min能降解至少IO3Copies含dU的模板，使其不能產生擴增產物。_20°C保存。基礎試劑配制10X濃縮清洗液A 配制0. 2N NaOH, 5mL/管分裝；10 X濃縮清洗液B 配制10 X TE緩沖液(ρΗ8· 0)，IOmL/管分裝；
提取固形物取直徑為0. 5mm和1. Omm兩種玻璃珠，按質量配比約為 0. 5mm 1.0mm = 9 1比例配制出提取固形物，每管約0. 15g分裝。IOmmol/L iTris-HCl溶液的配制稱取0. 12114g的Tris，加入已含60mL蒸餾水的 IOOmL燒杯中，振搖使之充分溶解，移入IOOmL的容量瓶中，用IOmL蒸餾水洗滌燒杯3次并移入容量瓶中，用HCl調pH值為8. 0，最后用蒸餾水定容到IOOmL,翻轉容量瓶使之充分混勻。移入試劑瓶并標記名稱、濃度、配置時間。dNTPs的配制如表1 表 權利要求
1.一種金黃色葡萄球菌PCR檢測試劑盒，包括PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括IOXbuffer緩沖液、dNTP、Mg離子、引物和熒光探針，所述引物分為上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.按權利要求1所述的金黃色葡萄球菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，還包括tap酶、 UNG酶、陽性對照、陰性對照。
3.按權利要求1所述的金黃色葡萄球菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，引入了一個人工構建的neo內參照系統用于避免檢測結果假陰性，所述內參照系統包括上游引物核苷酸序列=SEQ ID NO. 4 ；下游引物核苷酸序列=SEQ ID NO. 5 ；探針核苷酸序列=SEQ ID NO. 6。
4.按權利要求1所述的金黃色葡萄球菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光探針的 5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ淬滅基團。
全文摘要
本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌菌株PCR檢測試劑盒。本發明的技術方案為提供一種金黃色葡萄球菌PCR檢測試劑盒，包括PCR反應液，所述PCR反應液包括引物和熒光探針，所述引物分為上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本試劑盒具有靈敏度和特異性高、穩定、及時、操作方便等優點。
文檔編號C12Q1/14GK102399876SQ201110353530
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月9日 優先權日2011年11月9日
發明者何華東, 姚雪 申請人:泰普生物科學(中國)有限公司