專利名稱：一種漢坦病毒群的簡并rt-pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及漢坦病毒的檢測技術，具體涉及涉及一種漢坦病毒群的簡并RT-PCR 檢測方法。
背景技術：
漢坦病毒屬(Hantavirus)僅有一個病毒群，即漢坦病毒群(簡稱漢坦病毒)，屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)。根據漢坦病毒基因分子結構和抗原性的不同，將漢坦病毒至少分為34個血清型/基因型，包括漢灘型病毒(Hantaan Virus)，漢城型病毒(Seoul Virus)，普馬拉型病毒(Puumala Virus)，多不拉伐型病毒(Dobrava Virus)，圖拉型病毒 (Tula virus)，索托帕拉雅型病毒(Thottapalayam virus)和安第斯型病毒(Andes virus) 等。漢坦病毒能感染野生嚙齒動物和人類，引發人類的腎綜合征出血熱(HFRS)和漢坦病毒性肺綜合癥(HPS)。這些病遍及亞洲、歐洲、非洲、美洲、大洋洲等70多個國家，其流行之廣， 危害之重，已成為全球性的公共衛生問題。我國漢坦病毒的感染情況更為嚴重，世界漢坦病毒感染每年報告的病例數大約在150,000 200，000之間，而我國發病人數則占世界報道病例數的90%以上，是受漢坦病毒危害最為嚴重的國家。我國流行的主要是腎綜合征出血熱，近十年來我國年報告發病人數一直穩定在4 6萬人，而且新疫區不斷出現，并時有爆發。漢坦病毒的檢測方法主要有病毒分離、血清學檢測方法和基因檢測方法。基因檢測方法主要是反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，與血清學抗體檢測相比在靈敏性和特異性上的都大幅度提高。目前漢坦病毒的RT-PCR檢測方法中均只針對漢坦病毒中的漢灘病毒型和/或漢城病毒型使用特異性型引物進行RT-PCR檢測，如授權公告號為CN101294226的發明專利，就公開了以漢灘型病毒和漢城型病毒的各基因型為目的片斷設計了二對引物的試劑盒，用于檢測漢灘型病毒和/或漢城型病毒；該試劑盒無法檢測出漢坦病毒屬內的其它病毒。雖然目前國內疫區大多數為漢灘型病毒和漢城型病毒感染，但隨著進出口貿易量的增大，國外流行株(普馬拉型病毒、多不拉伐型病毒、圖拉型病毒、安第斯型病毒和索托帕拉雅型病毒等)傳入不可避免，因些防止國外流行株傳入以及未知型別病毒的發生的檢測顯得尤為重要，目前還未有對漢坦病毒屬全病毒通用的PCR檢測方法的公開報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種漢坦病毒群的簡并RT-PCR檢測方法，該簡并RT-PCR檢測方法不僅可以用于檢測國內流行的漢灘型和漢城型病毒，還可以用于檢測國外其它流行株，防止國外流行株傳入國內。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種漢坦病毒群的簡并RT-PCR 檢測方法，包括下述步驟
a、RNA提取用RNA提取試劑盒(購自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說明書進行；
3b、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒(購于Promega公司)對上述RNA進行RNA逆轉錄， 得到PCR模板，具體逆轉錄方法依說明書進行在0.2mL印pendorf管中加入oligo d(T)15 primers(50mM/ L)lyL，上述 RNA 50ng(約 10 μ L)，72°C 10. min，加入 5XRT buffer4 μ L, dNTP 液(IOmM / L) 1 μ L、AMV 反轉錄酶液(IOU/ μ L) 1 μ L、RNA 酶抑制劑(20U/ μ L)0. 5 μ L、 無RNA酶水1.5μ ，42τ lh，72°C IOmin ；反應產物即為后續的PCR模板；
c、PCR反應在 0. anL 印pendorf 管中加入 10 XPCR 緩沖液(PCR buffer) 2. 5 μ L、濃度為25mM/ L的MgCl2溶液1. 5 μ L、濃度為IOmM/ L的dNTP液0. 5 μ L、濃度為5U/μ L 的Taq酶液0. 5 μ L、上游引物溶液1 μ L、下游引物溶液1 μ L，上述PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L，組成PCR反應體系；反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火 30s, 720C延伸lmin，35個循環，72°C延伸7min，得到PCR產物，4°C保存；所述上游引物溶液含有濃度為25mM/ L的引物G1，所述引物Gl的核苷酸序列為GCAACACCAA CATGGTTTca rtaytayac，所述下游引物溶液含有濃度為25mM/L的引物G2，所述引物G2的核苷酸序列為 CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc ；其中r為嘌呤，可以是g或a，y為嘧啶，可以是 c或t/u，η是任何堿基，可以是g或a或c或t/u或其它；
d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產物用1-1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結果用凝膠成像系統分析，若結果出現478bp大小片段的條帶，則為漢坦病毒群。(以上PCRbuffer、MgCl2, dNTP液、Taq酶液等反應試劑均購自大連寶生生物，引物由上海生工合成。上述引物Gl、G2是根據Genbank已公布12個基因型病毒株L片段全片段基因設計弓I物對，包括 Dobrava-Belarade viru strain D0BV/Ano-Poroia/Af 19/1999, Hantaan virus strain 76-118,Seoul virus 80-39, Hantavirus zlO,Sin Nombre virus(NM H10) ,Tula virus strain Tula/Moravia/5302v,Andes virus strain Chile-9717869,Puumala virus strain Samara-49/CG/2005,Thottapalayam virus virus strain VRC 66412,Amur virus Khekhtsir/AP209/2005 ,Prospect Hill virus PH-l,Rio Mamore virus HTN—007。 將蛋白序列以FASTA格式保存，將下載的FASTA格式的氨基酸序列信息輸入http:// blocks, fhcrc. org/codehop. html進行Block比對，得到高度保守的連續氨基酸區域。使用 CodeHop引物搜索，常規方法篩選合適上下游引物。要求簡并度低，上下游引物位置間距在 500bp左右。利用primer和oligo軟件進行引物分析，得到上述1對簡并雜合寡核苷酸引物(引物Gl和引物G2)，通過Megalian與Genbank中現有L全片段毒株共52株比對，理論上均可得到478bp的擴增產物，國內外尚無對于漢坦病毒屬通用引物的研究報道。與現有技術相比，本發明的優點在于一種漢坦病毒群的簡并RT-PCR檢測方法，通過RNA提取、RNA逆轉錄、PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，PCR反應中上游引物溶液含有序列為GCAACAGCAA CATGGTTTca rtaytayac的引物Gl，下游引物溶液含有序列為CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc的引物G2，引物Gl和引物G2是由5 ‘端非兼并共有序列夾和根據保守氨基酸設計的很短的3 ‘端的核心簡并區(cartaytayac或arnccyttytc)組成， 擴增產物序列長度為478bp ；引物中5丨端非兼并共有序列在不增加引物簡并度的情況下能穩定3 ‘兼并核心區與模板結合作用，允許在較高退火溫度下進行，提高了兼并PCR反應的特異性，可以擴增檢測漢坦病毒屬內各類病毒，如漢灘型病毒、漢城型病毒、普馬拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯病毒型和索托帕拉雅型病等，防止國外流行株傳入國內，也能對與擴展基因同源的未知病毒進行檢測，并可以對擴增的目標片段進行測序，所獲得的生物信息學數據可以用于漢坦病毒的分子流行病學調查研究。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例1、RT-PCR檢測漢灘型病毒
1、總RNA提取Vero細胞用5%滅活小牛血清DMEM37°C培養，常規消化傳代培養成單層后，接種漢坦病毒76-118株病毒(漢灘型，浙江省疾病控制預防中心惠贈)，吸附2小時后用0. 5%小牛血清DMEM (購自Hyclone)維持液放置于37°C CO2培養箱內培養。7_10天中 IFA檢測出現陽性后收獲細胞，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA作為陽性RNA (具體提取方法依說明書)。用微量分光光度計測量RNA濃度和純度，0D260/280 ^ 1.9，表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質污染，取50ng進行RT-PCR反應；
2、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒對上述陽性RNA進行RNA逆轉錄，具體方法為 在 0.2mL 印 pendorf■管中加入 oligo d (T)15 primers (50mM/ L)lyL，上述 RNA 50ng (約 10μ L),72°C lO.min，加入 5 X RT buffer4 μ L、dNTP 液(IOmM / L) 1 μ L、AMV 反轉錄酶液(10U/yL) IyL, RNA 酶抑制劑(20U/y L) 0.5yL、無 RNA 酶水 1. 5 μ L, 42 °C lh, 72 °C IOmin ；反應產物即為后續的PCR模板；
3、PCR反應在 0. anL 印pendorf 管中加入 10XPCR buffer2. 5 μ L、MgCl2 溶液(25mM/ L) 1· 5 μ L、dNTP 液(10mM/L) 0· 5 μ L、Taq 酶液(5U/ μ L) 0· 5 μ L、上游引物溶液(引物 Gl 濃度為25mM/L) 1 μ L、下游引物溶液(引物G2濃度為25mM/L) 1 μ L，PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L，組成PCR反應體系；反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火 30s, 720C延伸lmin，;35個循環，72°C延伸7min，4°C保存PCR產物；
4、瓊脂糖凝膠電泳將PCR產物用1-1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結果用凝膠成像系統分析。結果漢坦病毒76_118株Vero細胞培養物出現478bp大小片段的條帶，測序結果序列如SEQ ID NO :3所示。RT-PCR方法靈敏性試驗用分光光度計檢測提取漢坦病毒76-118株感染的Vero 細胞RNA濃度為85. 6ng，將RNA用foiase-free Water 10倍梯度稀釋，按照實施例1的步驟 1-4的方法用G1/G2引物對擴增進行檢測。結果顯示本檢測方法可以檢測出的最高稀釋度為10_3，相當于85. 6pg核酸的病毒RNA。RT-PCR方法特異性試驗用漢坦病毒76-118株RNA、甲型Hmi流感病毒RNA、，柯薩奇病毒RNA、流行性乙型腦炎RNA，正常Vero細胞RNA，作為檢測對象，按照實施例1的步驟1-4的方法用G1/G2引物對擴增進行檢測，結果只有漢坦病毒76-118株核酸擴增產物在 478bp出現一條特異性條帶外，甲型Hmi流感病毒、柯薩奇病毒、流行性乙型腦炎病毒及正常Vero細胞RNA擴增產物均未見特異性核酸條帶。實施例2、RT-PCR檢測小鼠的漢坦病毒
對2008年-2009年大榭港區收集253只小鼠，用乙醚麻醉后頸椎脫白處死，取肺組織 10-25mg，勻漿后用RNA提取試劑盒進行肺組織總RNA提取(具體提取方法依說明書)，用微量分光光度計測量RNA濃度和純度，0D260/280彡1.9，表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質污染，取50ng進行RT-PCR反應；然后按實施例1的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行 PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果表明在檢測253份鼠肺樣本，其中2份擴增得到478bp大小片段的條帶。檢測結果與使用衛生部公布的《全國腎綜合征出血熱檢測方案 (試行)》結果一致。一份條帶送上海英俊測序，測序結果序列如SEQ ID NO :4所示，序列比對后鑒定為漢灘型病毒。實施例3、RT-PCR檢測漢城型病毒
與實施例1步驟1-4基本相同，所不同的只是接種的是漢坦病毒80-39株病毒(漢城型，浙江省疾病控制預防中心惠贈)，檢測后漢坦病毒80-39株Vero細胞培養物出現478bp 大小片段的條帶，測序結果的序列如SEQ ID N0:5所示。實施例4、RT-PCR檢測普馬拉型病毒陽性質粒
人工合成Puumala virus strain Sotkamo核酸(如SEQ ID NO:6所示序列)片段(大連寶生生物合成)，連接至PMD18-T載體(購自上海生工)，轉化至DH5ci大腸桿菌(購自上海生工)，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養，使用質粒提取試劑盒(購自上海生工)提取質粒作為陽性RNA和陰性RNA(若病毒用RNA提取試劑盒提取RNA)，然后按實施例1的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果陽性RNA出現478bp大小片段的條帶，陰性RNA無條帶出現。實施例5、RT-PCR檢測多不拉伐型病毒陽性質粒
人工合成 Dobrava-Belgrade virus strain Ano-Poroia/Af 19/1999 核酸(如 SEQ ID N0:7所示序列)片段(大連寶生生物合成)，連接至pMD18-T載體，轉化至DH5a大腸桿菌， 挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養，使用質粒提取試劑盒(購自上海生工)提取質粒作為陽性RNA和陰性RNA(若病毒用RNA提取試劑盒提取RNA)，然后按實施例 1的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果陽性 RNA出現478bp大小片段的條帶，陰性RNA無條帶出現。實施例6、RT-PCR檢測安第斯型病毒陽性質粒
人工合成 Andes virus strain Chile-9717869 核酸(如 SEQ ID N0:8 所示序列)片段 (大連寶生生物合成)，連接至PMD18-T載體，轉化至DH5ci大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養，使用質粒提取試劑盒(購自上海生工)提取質粒作為陽性 RNA和陰性RNA (若病毒用RNA提取試劑盒提取RNA)，然后按實施例1的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果陽性RNA出現478bp大小片段的條帶，陰性RNA無條帶出現。實施例7、RT-PCR檢測索托帕拉雅型病毒陽性質粒
人工合成 Thottapalayam virus strain VRC-66412 核酸(如 SEQ ID N0:9 所示序列) 片段(大連寶生生物合成)，連接至PMD18-T載體，轉化至DH5ci大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養，使用質粒提取試劑盒(購自上海生工)提取質粒作為陽性RNA和陰性RNA (若病毒用RNA提取試劑盒提取RNA)，然后按實施例1的步驟2進行 RNA逆轉錄，步驟3進行PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果陽性RNA出現478bp大小片段的條帶，陰性RNA無條帶出現。從上述實施例說明本發明的RT-PCR檢測方法對漢坦病毒群的漢灘型病毒、漢城型病毒、普馬拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯型病毒和索托帕拉雅型病毒有效，同理也對該漢坦病毒群的圖拉型病毒等有效，是一種通用的漢坦病毒屬種類的檢測方法。在此不一一列舉其它病毒型的檢測結果。
權利要求
1. 一種漢坦病毒群的簡并RT-PCR檢測方法，其特征在于包括下述步驟a、RNA提取用RNA提取試劑盒提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說明書進行；b、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒對上述RNA進行RNA逆轉錄，得到PCR模板，具體逆轉錄方法依說明書進行；c,PCR反應PCR反應體系為10XPCR緩沖液2. 5 μ L、濃度為25mM/ L的MgCl2溶液 1. 5 μ L、濃度為IOmM/ L的dNTP液0. 5 μ L、濃度為5U/ μ L的Taq酶液0. 5 μ L、上游引物溶液1 μ L、下游引物溶液1 μ L，上述PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L ；反應條件為94°C預變性5min, 94°C變性30s, 52°C退火30s, 72°C延伸lmin, 35個循環，72°C延伸7min,得到的 PCR產物4°C保存，所述上游引物溶液含有濃度為25mM/L的引物G1，所述引物Gl的核苷酸序列為GCAACACCAA CATGGTTTca rtaytayac，所述下游引物溶液含有濃度為25mM/L的引物 G2，所述引物 G2 的核苷酸序列為 CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc ；d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產物用1-1. 5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結果用凝膠成像系統分析，若結果出現478bp大小片段的條帶，則為漢坦病毒群。
全文摘要
本發明公開了一種漢坦病毒群的簡并RT-PCR檢測方法，通過RNA提取、RNA逆轉錄、PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，PCR反應中上游引物溶液含有序列為GCAACAGCAACATGGTTTcartaytayac的引物G1，下游引物溶液含有序列為CTTCTTCATTCATATTTCCATGCarnccyttytc的引物G2，引物中5＇端非兼并共有序列在不增加引物簡并度的情況下能穩定3＇兼并核心區與模板結合作用，提高了兼并PCR反應的特異性，可以擴增檢測漢坦病毒屬內各類病毒，如漢灘型病毒、漢城型病毒、普馬拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯病毒型和索托帕拉雅型病等，防止國外流行株傳入國內，也能對與擴展基因同源的未知病毒進行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102382906SQ20111035416
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者胡群, 謝東華, 郭利平, 韓輝, 馬思杰 申請人:中華人民共和國大榭出入境檢驗檢疫局