專利名稱：一種硝化菌保藏方法
技術領域：
本發明涉及一種菌體保存方法，具體涉及一種簡單有效的低溫冷凍保藏硝化菌種的方法。
背景技術：
菌種是主要的生物資源之一，一個優良的菌種被選育出來以后，必須保持其優良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低菌體性能，能長期在生產中應用。菌種保藏方法有很多，冰凍保存是解決種質退化和防止自然積累性突變的一種有效途徑，但傳統的低溫保存需要昂貴的程序降溫儀器，步驟繁瑣。完全玻璃化是低溫保存的一種新方法，即在高濃度保護劑下，細胞連同保護劑于快速降溫中都進入玻璃化狀態，避免胞內冰晶形成，使器官和組織各部分都進入相同的狀態，比其它低溫保存方法具有設備簡單、程序簡單和凍存效果好等優點，在保存器官和組織的結構完整性方面有獨到之處。
微生物菌種保藏的基本原理主要是根據微生物生理生化特點，人工創造條件，使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態，即采取低溫、干燥、缺氧等條件，使菌種暫時處于休眠狀態。一種好的保藏方法首先應能長期保持菌種原有的優良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經濟，以便生產上能推廣使用。
為了有效地保藏微生物菌種，首先需要有良好的培養基。因此，研究選用適宜的培養基是微生物菌種保藏最基本的工作。
人們在長時間的工作實踐中，根據微生物的不同要求，在菌種保藏工作中不斷摸索出各種方法。CN01810856.3采用高溫冷凍法低溫保藏生物活性物質，通過制備要冷凍的可存活的生物材料、將其浸入裝有冷卻液的容器中、并以基本上恒定的預定速率和溫度使冷卻液環流通過該生物材料，使其冷凍，從而將存活的生物材料進行低溫保藏(低溫保存)。該方法以足夠快的速率冷凍生物材料，以避免在細胞結構內形成冰晶，冷卻液的溫度較佳為一 20°C到一 30°C，這個溫度范圍足夠使細胞膜中由于熱變化而導致的應力破壞的形成減少到最小程度。采用該方法冷凍的細胞只具有約80%的存活率。
CN200810124325.5提供了一種菌種保藏方法，采用半固體、低溫密封培養的方法:將菌種接種于無菌的半固體培養基中，倒入無菌液體石臘后豎直存放入6 8°C的環境溫度中保存。所述菌種 為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色鏈珠菌。具體過程為:制備半固體培養基，分裝、滅菌，然后培養2 — 3天，確定無菌后將菌種穿刺接種于半固體培養基中，平行于培養基平面穿刺接種不少于3點。倒入I 2cm高的無菌液體石蠟，用封口膜密封，豎直存放入6 8°C的電冰箱中保存。采用此發明可延長菌種的保存時間，同時菌種的濃度保持相對穩定，為生產、試驗節約了大量的成本，減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放，減少了對環境的危害。但是工序復雜繁瑣，不適合大量菌體的保存。
CN00107965.4公開了一種制作纖維素酶粉劑用于保藏的方法，它包括選取菌種，在試管、三角瓶中培養、種子罐中攪拌培養，將2%木糖洛、0.5%。營養鹽、0.05%。微量兀素、種子罐中培養的菌種放入5M3發酵罐中攪拌發酵培養，將攪拌發酵后的發酵液進行壓濾，將壓濾后的物料進一步超濾濃縮，超濾濃縮后添加5%的甘油保護劑制成液體纖維素酶制劑，噴霧干燥后制成粉劑；該生產工藝簡單，操作實施方便，原料來源廣泛，生產成本低，無污染；但是不適用于硝化菌的大量保存。
CN101003791公開了一種用毛細玻璃管玻璃化冷凍保存胚胎和卵母細胞的方法，屬胚胎生物技術領域。該方法使用高硼硅毛細玻璃管，具體操作步驟包括:(一)冷凍液體的配置；(二)冷凍；(三)解凍液體的配置；(四)解凍。該方法不適合應用于類似于硝化菌等需要大量保藏的菌體。
CN201010299763.2提供了一種冷凍保存紅細胞的方法，向紅細胞中加入還原劑和甘油以及作為金屬離子螯合劑的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽；還原劑為抗壞血酸或抗壞血酸鹽、半胱氨酸鹽酸鹽或N-乙酰半胱氨酸、硼氫化鈉、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉、還原型谷胱甘肽中的任意一種或者兩種或兩種以上的混合物，還原劑終濃度各為0.5 300mM ;甘油的量以終體積比計為5% 10% ;乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽的終濃度為0.1 IOmM;充分混勻并調節酸度值至6.5 8.0，將容器封口，靜置I小時后在-40°C以下冷凍保存。以該方法冷凍保存的紅細胞，一年后解凍，紅細胞破碎率大于95%，血紅蛋白無變性，未被氧化為高鐵血紅蛋白。此種方法適合細胞保藏法，不適合菌種活性的保藏。發明內容
針對現有技術的不足，本發明提供一種硝化菌保藏方法，適宜于大量保存硫化菌，具有方法簡單和存活率等優點。
本發明硝化菌保藏方法，包括如下步驟: (1)將硝化菌體培養至生長穩定期，并收集硝化菌； (2)配制硝化菌保藏營養液； (3 )步驟(I)收集的硝化菌與步驟(2 )配制的硝化菌保藏營養液混合，含水率為40% 80%，含水率指硝化菌保藏體系中水的重量含量； (4)添加保藏劑； (5)冷凍保藏。
本發明步驟(I)的硝化菌體培養采用本領域常規的方法，如采用間歇式活性污泥法等?？梢圆捎萌斯づ渲玫呐囵B液，也可以采用廢水對硝化菌進行培養，培養液所含成分主要為銨鹽，氨氮濃度為200 1500mg/L，還有少量Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+等金屬離子以及磷酸根離子等。硝化菌體培養的硝化菌初始來源可以是任意的需要保藏的硝化菌。硝化菌體培養至生長穩定期，此時是指菌體適宜保藏的生長期，通過沉降、過濾、離心等方法收集獲得的硝化菌。
本發明步驟(2)中，所述的營養液中含有的銨鹽為(NH4)2S04,含有微量物質FeS04、KH2P04、MgCl2和CaCl2。各種物質的用量按步驟(3)中所需有濃度確定。
本發明步驟(3)中，硝化菌與營養液混合物中，NH4+-N濃度為0.1 1.5g/L，Fe2+濃度為 0.01 0.06g/L, K.濃度為 0.05 0.5g/L, Ca2+ 濃度為 0.01 0.1 g/L, Mg2+ 濃度為 0.05 0.5g/L。
本發明步驟(4)中，所述的保藏劑可以是本領域應用的所有常規的保藏劑，優選二甲亞砜，使用量為硝化菌加入營養液后混合物體積的29Γ5%。
本發明步驟(5)中，冷凍保藏溫度為-20°C _70°C之間。可以采用本領域常規的冷凍設備。
本發明方法通過從菌體培養、含水率、營養液、保護劑等方面進行優化考察，得到了最適宜的硝化菌低溫冷凍保藏方法。本發明方法可以延長菌種的保存時間，同時使菌種的活性保持相對的穩定，菌體保藏后優良性狀好，菌體活性恢復迅速，對于大量菌體保藏經濟方便的特性，為生產、試驗節約成本。本發明方法簡單，不需特殊設備，保藏方法方便快捷，適合大量菌種保藏，存活率到可以達到90%以上。
具體實施方式
本發明的一種具體實施過程如下: Cl)利用適宜的培養液，在溫度15-40°C，pH為7.0-8.5，溶解氧DO為l_5mg/L的條件下將硝化菌培養10-20天至生長穩定期，然后進行菌體分離。
(2)菌懸液的含水率對于胞內外冰晶的形成有影響，進而影響保藏效果，因此需要適宜的含水率。菌體培養液的初始含水量較高，因此需要降低菌體含水率。
(3)營養 物質是菌體生存的必備條件，可使菌體在低溫冰箱中保藏若干年，而不影響其活性，需要按照適宜的營養物質濃度加入保藏所需的營養液。
(4)保藏劑可以是本領域應用的所有保藏劑，優選二甲亞砜C2H6SO作冷凍保護齊IJ。二甲亞砜是一種滲透性保護劑，對細胞無毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入細胞，降低冰點，提高細胞膜對水的通透性，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結之前透出細胞夕卜，在胞外形成冰晶，提高細胞內的電解質濃度，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞凍傷。加入一定配比的冷凍保護劑，使用量為加入營養液后待保藏菌體體積的29Γ5%。
(5)低溫冰箱凍存:低溫冷凍是在_20°C至_70°C之間。保藏3_5年能力后，考察菌體存活率和恢復能力時間。菌體生長速率在一個星期內恢復至保藏前。
實施例1 配制進水氨氮濃度為300mg/L的培養液，在100L生物曝氣反應池中采用間歇式活性污泥法對硝化菌進行培養，溫度27°C，pH為7.8，溶解氧DO為2.5-3.5mg/L。當菌體進入穩定生產期后停止培養，沉降或離心后進行多次洗滌，降低硝化產物濃度。按照50%的含水率，菌體與配制的營養液混合，搖勻后加入3%的保護劑二甲基亞砜，于_50°C低溫冰箱保藏。2年后取出考察菌體的活性和存活率，經過3d的恢復，菌體的活性可完全恢復，存活率可達95%。
營養物質在最終混合物中的濃度為:0.3g/L的NH/-N，0.02g/L的Fe2+，0.1 g/L的Mg2+，0.1 g/L 的 K+，微量 Ca2+ 等。
實施例2 配制進水氨氮濃度為600mg/L的培養液，在100L生物曝氣反應池中采用間歇式活性污泥法對硝化菌進行培養，溫度30°C，pH為8.0，溶解氧DO為1.5-3.0mg/L。當菌體進入穩定生長期后停止培養，沉降或離心后進行多次洗滌，降低硝化產物濃度。按照60%的含水率，菌體與營養液(營養物質濃度與實施例1相同)混合，搖勻后加入5%的保護劑二甲基亞砜，于_60°C低溫冰箱保藏。4年后取出考察菌體的活性和存活率，經過5d的恢復，菌體的活性可完全恢復，存活率可達90%。
實施例3 配制進水氨氮濃度為400mg/L的培養液，在100L生物曝氣反應池中采用間歇式活性污泥法對硝化菌進行培養，溫度37°C，pH為7.8，溶解氧DO為0.5-1.5mg/L。當菌體進入穩定生長期后停止培養，沉降或離心后進行多次洗滌，降低硝化產物濃度。按照70%的含水率，菌體與營養液(營養物質濃度與實施例1相同)混合，搖勻后加入5%的保護劑二甲基亞砜，于_70°C低溫冰箱保藏。5年后取出考察菌體的活性和存活率，經過7d的恢復，菌體的活性可完全恢復，存活 率可達90%。
權利要求
1.一種硝化菌保藏方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將硝化菌體培養至生長穩定期，并收集硝化菌； (2)配制硝化菌保藏營養液； (3 )步驟(I)收集的硝化菌與步驟(2 )配制的硝化菌保藏營養液混合，含水率為40% 80%，含水率指菌體濕重和培養液體積比； (4)添加保藏劑； (5)冷凍保藏。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)的硝化菌體培養采用間歇式活性污泥法。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)的硝化菌體培養溫度為15 400C，pH 值為 7.0-8.5，溶解氧 DO 為 l_5mg/L，培養 10-20 天。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(I)硝化菌體培養至生長穩定期后，通過沉降、過濾或離心方法收集獲得硝化菌。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的營養液中含有(NH4)2SO4,同時含有微量物質 FeSO4, KH2PO4, MgCl2 和 CaCl20
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，硝化菌與營養液混合物中，NH:-N 濃度為 0.1 1.5g/L, Fe2+ 濃度為 0.01 0.06g/L, K.濃度為 0.05 0.5g/L, Ca2+濃度為 0.01 0.1 g/L, Mg2 + 濃度為 0.05 0.5g/L。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，保藏劑是本領域應用的常規的保藏劑。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，保藏劑是二甲亞砜。
9.根據權利要求1、7或8所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，保藏劑用量為硝化菌加入營養液后混合物體積的2°/Γ5%。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(5)中，冷凍保藏溫度為-20°C -70°C之間。
全文摘要
本發明涉及一種硝化菌保藏方法，包括(1)將硝化菌體培養至生長穩定期，并收集硝化菌；(2)配制硝化菌保藏營養液；(3)步驟(1)收集的硝化菌與步驟(2)配制的硝化菌保藏營養液混合，含水率為40%～80%，含水率指菌體濕重和培養液體積比；(4)添加保藏劑；(5)冷凍保藏。與現有技術相比本發明方法適宜于大量保存硝化菌，具有方法簡單和存活率高等優點。
文檔編號C12N1/20GK103103143SQ20111035374
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者孫丹鳳, 高會杰, 李志瑞, 張鵬, 李寶忠 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院