專利名稱：含有熱休克蛋白hsp70c的用于促進漢坦病毒融合蛋白g2s0.7提呈的重組腺病毒表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及分子生物學(xué)、免疫學(xué)及免疫應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及腺病毒重組轉(zhuǎn)移載體的改建及其對腎綜合征出血熱(HFRS)致病原的ー種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體G2S0. 7-pCAG。
背景技術(shù)：
腎綜合征出血熱及其基因工程疫苗研究現(xiàn)狀腎綜合征出血熱(hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS)是由漢坦病毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠類等傳播的ー種急性病毒性傳染病，臨床上以發(fā)熱、出血和急性腎功能損害為主要特征。中國是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國家，具有流行范圍廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率高等特點，到目前為止臨床上尚缺乏特異有效的治療藥物。為易感人群接種疫苗是預(yù)防傳染性疾病大規(guī)模擴散最有效的防控措施。因此，針對HFRS疫苗的研究一直是該領(lǐng)域的熱點。國內(nèi)外近年來雖已研制出HFRS的滅活疫苗，但從部分人群試用的情況來看，該類疫苗還存在明顯不足，主要是其誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的能力較弱，也不能有效地刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前在HFRS基因工程疫苗基礎(chǔ)研究中主要使用的是病毒囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相對較弱，刺激機體產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)較晚，滴度亦不高。本發(fā)明人多年對HV中免疫原性最強的核蛋白(NucleocapsidProtein, NP)的結(jié)構(gòu)及功能，NP與GP不同片段嵌合基因(G1S0. 7、G2S0. 7)的構(gòu)建及其表達，以及不同融合基因(蛋白)刺激機體免疫應(yīng)答的能力及其影響因素等進行了較為深入的研究。一系列體內(nèi)、外實驗結(jié)果表明，上述嵌合基因在腺病毒表達系統(tǒng)中能有效地刺激機體的體液免疫(包括中和抗體)應(yīng)答以及細(xì)胞免疫應(yīng)答，且其效果均高于非嵌合組。
然而在研究中我們也發(fā)現(xiàn)了ー些問題，如盡管利用各種系統(tǒng)均能表達出完整的融合蛋白，但總的來說蛋白表達量還是偏低。此外，用融合蛋白免疫動物后雖然各表達系統(tǒng)均能刺激機體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，且腺病毒表達系統(tǒng)的效果要優(yōu)于其他系統(tǒng)，但是整體的免疫水平還不十分理想。因此，進ー步選擇合適的表達載體、優(yōu)化表達系統(tǒng)對目前HFRS基因工程疫苗的研究有著重要的意義。本申請人前期對含嵌合基因G2S0. 7的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pShuttle進行改建，將其CMV啟動子替換為CAG啟動子/增強子，得到含CAG啟動子/增強子的漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體，命名為G2S0. 7-pCAG，整合入腺病毒載體DNA中，得到重組腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG。通過比較表達融合蛋白G2S0. 7，結(jié)果顯示該重組腺病毒與未替換啟動子的原重組腺病毒rAd-G2S0. 7相比，能有效提高融合蛋白G2S0. 7的表達。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將HSP70抗原遞呈分子基因C末端(HSP70 359_610aa)連接到該重組轉(zhuǎn)移載體上，通過雙酶切，進而將重組片段整合入腺病毒載體DNA中，得到能夠促進漢坦病韋融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病韋聞表達載體。
優(yōu)化腺病毒表達載體，促進機體對抗原的提呈促進疫苗組份在體內(nèi)的有效提呈是提高HFRS基因工程疫苗的效率的途徑之一。HSP70因其在抗原提呈和分子伴侶方面的突出優(yōu)勢引起了研究者的重視。熱休克蛋白(heatshock protein, HSP)是ー組生物體內(nèi)普遍存在、進化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白質(zhì)家族，是生物在應(yīng)激條件下產(chǎn)生的ー種非特異性、能增強機體對高低溫、創(chuàng)傷、細(xì)菌和病毒感染等適應(yīng)能力的防御性產(chǎn)物。HSP的主要生理功能是促進與維持新生多肽鏈的正確折疊，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分裂、分化、死亡。由于HSP參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、折疊和裝配，所以HSP又被稱為“分子伴侶”。根據(jù)分子量的大小和同源程度將HSP分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP等幾個家族。HSP70家族廣泛存在于各個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。HSP70家族的結(jié)構(gòu)分為3部分N端(44kDa)由4個α螺旋形成一個裂縫，比C端具有更高的保守性，它具有ATP酶活性，類似肌動蛋白ATP酶結(jié)構(gòu)域；18kDa部分，由4個反向平行的β折疊和ー個α螺旋構(gòu)成，是多肽的結(jié)合部位；C端(IOkDa)主要由α螺旋構(gòu)成，是多肽和蛋白質(zhì)·結(jié)合的部位，不同HSP70分子該部分的同源性較低。研究表明，HSP70家族蛋白基因與MHC分子基因類似，HSP70的蛋白結(jié)合基序與MHC-I類分子的構(gòu)槽樣結(jié)構(gòu)非常相似，是ー種重要的分子伴侶，參與蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，可作為抗原提呈分子發(fā)揮作用。此外，HSP70本身也具有很強的免疫原性，可以作為一種佐劑，強烈地刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對抗原的免疫反應(yīng)，而不再需要其他的免疫佐劑。有研究認(rèn)為HSP融合蛋白疫苗可能通過HSP的的分子伴侶作用將融合蛋白轉(zhuǎn)移進入APC細(xì)胞內(nèi)，進入MHC-I類分子遞呈途徑，從而將抗原表位遞呈到APC表面，在HIV-lp24與HSP70的融合蛋白的研究中，HSP70能夠增強HIV_lp24的免疫原性，激活機體的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，同時截短的HSP70完全可以替代HSP70獨立行使其佐劑功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體G2S0. 7-pCAG，能有效提高融合蛋白G2S0. 7在實驗動物體內(nèi)的提呈效率，進而提高機體的體液免疫應(yīng)答水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。將本申請人前期構(gòu)建的含漢坦病毒76-118株的G2S0. 7嵌合基因及CAG啟動子/增強子的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pCAG進行改建，將HSP70抗原遞呈分子基因C末端連接到該載體上，并整合入腺病毒載體DNA，以獲得一種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體。本發(fā)明的技術(shù)方案是設(shè)計ー種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體G2S0. 7-pCAG，其制備方法是對含嵌合基因G2S0. 7的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pCAG進行改建，將HSP70抗原遞呈分子基因C末端HSP70 359_610aa連接到該載體上，命名為G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列為SEQ ID N0:1所示。本發(fā)明目的是通過以下方式實現(xiàn)的對含嵌合基因G2S0. 7的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體pCAG-G2S0. 7進行改建，將HSP70抗原遞呈分子基因C末端(HSP70359_610aa)連接到該載體上，得到改建的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體，命名為G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列為SEQ ID NO: I所示。對重組轉(zhuǎn)移載體和腺病毒載體雙酶切，將G2S0. 7-pCAG-HSP70C整合入腺病毒載體DNA，得到重組腺病毒載體rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C。
本發(fā)明利用基因重組技術(shù)，將本申請人前期構(gòu)建的含漢坦病毒76-118株的G2S0. 7的嵌合基因及CAG啟動子/增強子的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體PCAG-G2S0. 7進行改建，并將重組片段整合入腺病毒載體DNA中，以期獲得一種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體。將本發(fā)明rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C及前期未整合HSP70抗原遞呈分子基因C末端的重組腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG和未替換啟動子的重組腺病毒rAd-G2S0. 7分別免疫實驗小鼠后進行免疫學(xué)特性的研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明能有效提高融合蛋白G2S0. 7在實驗動物體內(nèi)的提呈效率，進而提高機體的體液免疫應(yīng)答水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。


下面結(jié)合實施例附圖對本發(fā)明做進ー步說明圖 I. HSP70C 基因的 PCR 擴增結(jié)果；其中L HSP70C ；M =DNAwide range maker ；
圖2. G2S0. 7-pCAG-HSP70C KpnI 單酶切鑒定結(jié)果；其中L2 :G2S0. 7-pCAG-HSP70C ；M DL2000maker ；圖3.重組腺病毒 DNA 的 PCR 鑒定；其中L2 G2S0. 7-pCAG_HSP70C ；M 200bpmaker。圖4.重組腺病毒的 PCR 鑒定；其中L G2S0. 7-pCAG_HSP70C ；M 200bp maker。圖5· HEK293細(xì)胞的CPE現(xiàn)象；其中A :正常對照；B :轉(zhuǎn)染6天后。圖6. G2S0. 7-pCAG-HSP70C表達產(chǎn)物的免疫熒光檢測結(jié)果；其中A :檢測NP的表達；B :檢測HSP70C的表達；C HEK 293陰性對照；圖7.各組免疫小鼠細(xì)胞因子IFN-Y的檢測結(jié)果；圖8.各組免疫小鼠細(xì)胞因子IL-2的檢測結(jié)果。圖9.含G2S0. 7嵌合基因的重組腺病毒免疫小鼠CTL檢測結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明所用的腺病毒表達系統(tǒng)購自CL0NTECH公司的Adeno-X 系統(tǒng)(貨號K1650-1)，其轉(zhuǎn)移載體為pShuttle。本發(fā)明中所采用的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pCAG由本申請人前期構(gòu)建(見原專利申請?zhí)?200910254563. 2)。本發(fā)明中所采用的重組腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG、rAd_G2S0. 7由本申請人前期包
裝、純化。本發(fā)明中所采用的雙價HFRS滅活疫苗購自浙江天元公司。本發(fā)明中所插入HSP70C 基因序列是以 HSP70C up primer、HSP70C down primer為引物，以結(jié)核分枝桿菌基因組為模板，進行PCR擴增，如附圖I所示。PCR產(chǎn)物與T-easy載體14°C連接過夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化E. coli JM109后涂布含Amp抗性的瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12hr,挑選單菌落增菌,提質(zhì)粒后以HSP70C up primer、HSP70C down primer為引物進行PCR鑒定，獲得陽性克隆，命名為Teasy-HSP70C，送金斯瑞生物科技公司進行測序。本發(fā)明中重組腺病毒載體構(gòu)建方法及重組腺病毒免疫學(xué)特性的研究內(nèi)容具體如下
I.重組轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pCAG-HSP70C的構(gòu)建采用Not I單酶切G2S0. 7-pCAG和T easy-HSP70C質(zhì)粒，分別膠回收目的片段和載體。將載體與片段14°C連接過夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化E. coli JM109后涂布含Kana+抗性的2XYT瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12hr，挑取單菌落增菌，提質(zhì)粒后用Kpn I單酶切鑒定，獲得陽性克隆，命名為G2S0. 7-pCAG_HSP70C(HSP70C基因位于G2S0. 7嵌合基因的下游)。附圖2為G2S0. 7-pCAG_HSP70C陽性克隆Kpn I單酶切鑒定結(jié)果。2.重組腺病毒DNArAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C的構(gòu)建、鑒定、包裝及單斑純化將上述構(gòu)建成功的重組轉(zhuǎn)移載體和重組腺病毒載體分別用PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切，膠回收目的片段和載體，T4連接酶14°C連接過 夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(JM109感受態(tài))后涂布含AMP+的2XYT固體培養(yǎng)基，37°C孵箱培養(yǎng)12 14hr，挑選單菌落搖菌提質(zhì)粒后酶切鑒定，獲得陽性克隆。附圖3為rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C重組腺病毒DNA的PCR鑒定結(jié)果。將重組腺病毒DNA用Pac I酶單切以線性化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，待出現(xiàn)明顯CPE(CytopathicEffect，細(xì)胞病變)后回收細(xì)胞，如附圖5所示。離心后將沉淀重懸于高壓滅菌的PBS。反復(fù)凍融該沉淀3次后離心收集上清，即獲得重組腺病毒。附圖4為rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C的PCR鑒定結(jié)果。采用空斑法純化重組腺病毒，_80°C保存。3. rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C融合蛋白G2S0. 7表達的檢測測定重組腺病毒滴度(具體方法參見 CLONTECH Adeno-Xw Rapid Titer Kit，Cat. No. 631028)。以 100pfu/cell的MOI (multiplicity of infection,感染復(fù)數(shù))感染293細(xì)胞，同時感染本申請人前期包裝的rAd-G2S0. 7重組腺病毒作為對照，48hr后免疫熒光檢測目的蛋白的表達。3. INP表達的檢測感染前24hr以I X IO5細(xì)胞/孔的密度將HEK293細(xì)胞鋪于24孔板，第二天以100pfu/cell的MOI感染HEK293細(xì)胞，4hr后更換新鮮的10% S-DMEM培養(yǎng)液，每孔500 μし將細(xì)胞置于CO2孵箱中培養(yǎng)48hr，使細(xì)胞密度達到75%，之后用冷甲醇_20°C固定細(xì)胞20min，PBS輕柔沖洗3次。加入I : 1000稀釋的mAb 1A8 (由本申請人制備并保存，可識別漢坦病毒特異抗原位點，具有較高的結(jié)合活性)，37°C孵育2hr，PBS輕柔洗3次，加入用O. 2%。伊文氏蘭液I : 100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠ニ抗，于37°C孵育lhr，PBS輕柔洗3次。避光保存，在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。3. 2HSP70C表達的檢測于24孔板中培養(yǎng)細(xì)胞及感染病毒步驟如前，以I : 250稀釋商品化特異性抗HSP70C抗體，37°C孵育lhr，PBS輕柔沖洗3次后加入用0. 2%。伊文氏蘭液I : 100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠ニ抗，于37°C孵育lh，PBS輕柔洗3次，避光保存，在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。附圖6分別為rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C中融合蛋白G2S0. 7及HSP70C的免疫熒光檢測結(jié)果。其中A為S0. 7免疫熒光檢測結(jié)果，B為HSP70C免疫熒光檢測結(jié)果，C為HEK293細(xì)胞陰性對照。4.重組腺病毒免疫C57BL/6小鼠將各組重組腺病毒經(jīng)過増殖、純化和滴度測定后，以108pfu/0. 5ml/只經(jīng)腹腔注射入小鼠體內(nèi)(4周齡C57BL/6小鼠雌鼠，每組5只，購自本校動物實驗中心)，間隔2周免疫一次，共三次；正常小鼠組(4周齡C57BL/6小鼠雌鼠，姆組5只,購自本校動物實驗中心)腹腔注射生理鹽水0. 5ml/只,Adenovirus組(4周齡C57BL/6小鼠雌鼠，每組5只，購自本校動物實驗中心；Adenovirus購自Clotech公司，含IacZ基因，通過檢測β_半乳糖苷酶的表達，可作為腺病毒陰性對照)腹腔注射腺病毒108pfu/ml/只，滅活疫苗組腹腔注射疫苗10 μ I/只，間隔2周注射一次，共三次。5.重組腺病毒免疫小鼠血清特異性抗體的檢測結(jié)果在第三次免疫后10天對各組免疫小鼠摘眼球取血并分離血清。包被HTNV NP lOyg/mlJt過夜；將各組免疫小鼠血清做I : 10 I : 640倍比稀釋，疫苗對照組稀釋至I : 640，37°C孵育Ihr ;洗滌后各孔加入I : 20000稀釋的HRP-抗鼠ニ抗，37°C孵育Ihr ;洗滌后加入OPD底物液顯色，室溫下避光放置15min后加入終止液，測定各孔的A49tl值。附表I為各組免疫小鼠血清特異性抗體檢測結(jié)果。

6.重組腺病毒免疫小鼠血清中和抗體的檢測結(jié)果在第三次免疫后10天對各組免疫小鼠摘眼球取血并分離血清。感染前一天接種Vero-E6細(xì)胞于96孔板，使其長成單層。O. 22μπι濾器提前過濾各組免疫小鼠的血清，然后用高壓過的IXPBS做I : 5 I 160倍比稀釋，陽性對照mAb 3G1 (可識別NP/G2上特異抗原位點，具有較高中和活性和血凝抑制活性)從I : 1000開始做倍比稀釋，陰性對照Sp2/0腹水做I : 1000稀釋。將iootcid50htnv分別與各實驗組血清及對照樣品充分混勻，37°c 5% co2孵育lhr。將96孔板各孔細(xì)胞上清吸盡，分別加入各組病毒與血清(或腹水)混和液100μ I/孔，做4個復(fù)孔，同時設(shè)立病毒對照組和正常細(xì)胞對照組。37°c 5% CO2孵育90min后，吸盡各孔上清，加入200μ I/孔含2%小牛血清的完全RPM-1640培養(yǎng)液，37°C 5% CO2孵育9天，每隔3天換ー次培養(yǎng)液。將96孔板放入_80°C反復(fù)凍融3次，用ELISA夾心法檢測凍融液中的病毒抗原，具體步驟如下I 1000稀釋mAb 1A8及腹水Sp2/0，4°C包被過夜I加入100 μ I/孔細(xì)胞凍融上清，37°C孵育IhI加入I : 2000稀釋的HRP-1A8抗體，37°C孵育IhI加入100 μ I/孔OPD底物液顯色，靜置15minI加入50 μ I/孔2Μ H2SO4終止液I測定各孔A49tl值結(jié)果判定Ρ值為各免疫組Α·值，N為陰性對照組A49tl值，以Ρ/Ν值彡2. I者為陽性，能抑制50%細(xì)胞感染的血清最大稀釋度為中和抗體效價。附表2為各組免疫小鼠血清中和抗體效價檢測結(jié)果。7.重組腺病毒免疫小鼠分泌細(xì)胞因子的ELISPOT檢測結(jié)果7. I免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞制備在第三次免疫后10天摘眼球處死各組小鼠，無菌分離脾臟獲取脾細(xì)胞懸液。加入Gey’ s溶液裂解其中的紅細(xì)胞，離心收集脾淋巴細(xì)胞，加入不完全RPM-1640洗滌2次，離心后重懸于含2%小牛血清完全RPM-1640培養(yǎng)液中，計數(shù)備用。7. 2ELISP0T檢測免疫小鼠細(xì)胞因子IFN- Y、IL-2
處死小鼠前一天，包被IL-2檢測板(IFN- Y為預(yù)包被檢測板)，具體程序如下 無菌條件下每孔加入50 μ I/孔70%こ醇，靜置2min后棄盡，加入200 μ I/孔無菌去離子水洗滌5次，100 μ I/孔加入特異性稀釋抗體，4°C包被過夜。用無菌I XPBS洗滌5次后，200 μ I/孔加入含10% -小牛血清的完全RPM-1640培養(yǎng)液室溫封閉30min，用無菌IXPBS洗滌5次后，包被完成備用。上述各組實驗小鼠脾細(xì)胞稀釋成I X IO7細(xì)胞/ml濃度，100 μ I/孔加入個細(xì)胞因子檢測板，并加入10mg/ml HTNVNP作為刺激物，每個樣品作3個復(fù)孔。陽性對照孔中加入PHA (phytohemagglutinin,植物血凝素，終濃度為4 μ g/ml),陰性對照孔不加刺激物，背景對照孔只加培養(yǎng)基。37°C 5% CO2孵育18hr，無菌I X PBS洗滌5次后加入生物素化抗鼠細(xì)胞因子的mAb，室溫孵育2hr，無菌I XPBS洗滌5次后加入I : 1000稀釋的HR標(biāo)記鏈霉親和素，室溫孵育lhr，高壓I XPBS洗滌5次后加入TMB底物顯色液，避光靜置，待斑點出現(xiàn)后，自來水沖洗，避光明干，用ELISPOT讀數(shù)儀測定斑點數(shù)。附圖7為重組腺病毒細(xì)胞因子IFN- Y的檢測結(jié)果ΓΡ < O. 01)。附圖8為重組腺病毒 細(xì)胞因子IL-2的檢測結(jié)果(*P < O. 05，**P < O. 01)。8.重組腺病毒免疫小鼠CTL細(xì)胞殺傷實驗檢測結(jié)果8. I效應(yīng)細(xì)胞的制備在第3次免疫后10天摘眼球處死各組小鼠，無菌分離脾臟獲取脾細(xì)胞懸液(同上)，將其置于含5%小牛血清完全RIPM-1640培養(yǎng)液中，加入終濃度為10 μ g/ml的HTNVGP，25U/ml的IL_2，37°C 5% CO2，作為CTL細(xì)胞殺傷實驗效應(yīng)細(xì)胞。8. 2靶細(xì)胞的制備提前兩天用重組腺病毒rAd_G2S0. 7感染B16細(xì)胞作為CTL細(xì)胞殺傷實驗靶細(xì)胞。8. 3CTL細(xì)胞殺傷實驗計數(shù)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，按照20 1,50 UlOO I的效靶比將50 μ I (2X IO6/孔、I X IO6/孔、4X IO5/孔)效應(yīng)細(xì)胞和50 μ I (2X IO4/孔)革巴細(xì)胞加入96孔板中，設(shè)置3個復(fù)孔，并以正常鼠脾細(xì)胞作為陰性對照。布板設(shè)各項對照孔(附表3顯示各對照孔配制方案)，之后按如下步驟檢測37°C 5% CO2孵育細(xì)胞4h后，250 Xg室溫離心5min，離心前40min靶細(xì)胞最大釋放孔加入10 μ I/孔裂解液，離心后每孔吸出50 μ I細(xì)胞上清至新96孔板，加入50 μ I/孔底物液，室溫避光靜置30min，加入50 μ I/孔終止液，測定A49tl值，計算殺傷活性。附圖9為重組腺病毒免疫小鼠CTL檢測結(jié)果，在效靶比為100 I時，rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C組小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性要高于其他試驗組及對照組(P< O. 05) ο在效靶比為50 I時，rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C組小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性要高于其他試驗組及對照組(P < O. 01)。表I.各組免疫小鼠血清特異性抗體檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.含有熱休克蛋白HSP70C的用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7提呈的重組腺病毒表達載體，其制備方法是對含嵌合基因G2S0. 7的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pCAG進行改建，將HSP70抗原遞呈分子基因C末端HSP70359-610aa連接到該載體上，命名為G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列為 SEQ ID NO 1 所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有熱休克蛋白HSP70C的用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0.7提呈的重組腺病毒表達載體,主要是對含CAG啟動子/增強子及漢坦病毒76-118株的G2S0.7的嵌合基因的G2S0.7-pCAG轉(zhuǎn)移載體進行改建，用于促進機體對高表達的漢坦病毒融合蛋白G2S0.7有效提呈。能有效提高實驗動物機體的體液免疫應(yīng)答水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。
文檔編號C12N15/861GK102676582SQ20121007088
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者于瀾, 吳興安, 張亮, 張芳琳, 徐志凱, 李凱, 李璞媛, 白文濤, 程林峰 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)