專利名稱：油棕猝倒病菌熒光定量pcr檢測試劑及檢測試劑盒和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及病原真菌的檢測技術，具體涉及涉及油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑及檢測試劑盒和應用。
背景技術：
油棕猝倒病菌G0FiAi^B印^^論/^)，又稱華麗腐霉，是油棕上的一種重要病害，該病菌寄主范圍很廣，除侵染油棕(^/aeis^/i/^e/^is)以外，還能夠侵染玉米^徹 ^^)、向日胃(JIe 1 ianthusanriuuS、、大轟(Mordeumvulgare.)、黃 /R (Cucumissativus)> 番薯(Ipomoeaba ta tas )、zj、麥(Tri ticumaes ti vum )、香豆(Viciafaba )、豆工豆(Vignasinensis )、
(.Capsicum spp. )> {Nautilocalyxlynchei)>^K^MM {Pelargonium spp.)、秋海棠屬(Begviiia spp.)等250余種植物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫及根部、莖基部、切口變褐腐爛與皮層脫落等癥狀。目前，該病菌主要分布在比利時、法國、德國、意大利、荷蘭、日本、坦桑尼亞、剛果和美國的夏威夷、弗羅里達、賓夕法尼亞州，國內臺灣、海南曾有報道，但其他地區未見發生報道，為我國進境植物檢疫性有害生物。油棕猝倒病菌的檢測方法主要包括傳統的形態學特征結合生理生化性狀的生物學鑒定和特異性引物PCR、核糖體DNA序列分析、RFLP等。生物學鑒定方法耗工費時，而且某些形態特征不穩定，可能退化或消失，并且油棕猝倒病菌為異宗配合型，單性培養不能產生有性器官，更增加了其鑒定難度；Wang等研制的特異性引物PCR靈敏度不是很高，無法檢測較低含量的DNA樣品；核糖體DNA序列分析，雖然獲得生物信息量大，但是實驗操作繁瑣，檢測周期長；RFLP可省去序列分析中許多繁瑣工序，但是需要進行多種酶切也費時費工，并且以上的分子檢測方法都要進行電泳等PCR后處理，接觸有毒試劑溴化乙錠，還易發生交叉污染而造成假陽性結果。熒光定量PCR (Real-time fluorescent PCR)是近幾年發展起來的PCR技術與熒光檢測相結合的方法，其原理是使用能特異標記核苷酸序列的熒光物質，利用熒光信號的積累實時監測整個PCR過程，具有檢測周期短、特異性與靈敏度高以及無需PCR后處理等優點。以TaqMan水解探針為例，探針一端標記熒光基團，另一端標記淬滅基團，通常狀態下，熒光基團與淬滅基團發生熒光共振能量轉移現象，熒光基團的熒光被淬滅基團吸收。當PCR進入退火階段時，熒光探針特異的結合在兩條引物之間，在延伸階段被聚合酶的5'端外切酶活性切開。熒光基團與淬滅基團分離，儀器檢測出熒光。由于熒光信號伴隨著PCR模板的擴增而增長，因此可以根據熒光信號是否增長來確定模板是否擴增。熒光PCR儀在反應過程中連續的檢測熒光信號的變化，當熒光信號增強到某一閾值時，此時的循環次數(Ct)就被記錄下來。該Ct值與反應體系中起始模板量的對數值有嚴格的線性關系。因此，除了可定性確定反應體系中是否含有目標DNA之外，還可以對反應體系中的模板DNA進行相對定量。因此，研究建立特異、敏感、可對低含量A 論直接進行檢測的方法，在檢疫、診斷、分子流行病學研究等方面具有重要的實際應用價值。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種對油棕猝倒病菌具有特異性高、敏感性強，定量和快速檢測的熒光定量PCR檢測試劑。本發明還提供了含有該檢測試劑的檢測試劑盒和應用。本發明系選擇油棕猝倒病菌ITS區保守片段為靶目標，應用primer Express 5. 0軟件，設計合成引物和探針。將設計的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗，得到最合適的引物和探針。本發明所述的油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標片段長度為94bp，一對特異性引物序列pyspF :5’ -ttaaatggacagggtctttc tat-3，禾口 pyspR :5，-tgccgaagtc gccaaaag-3，，特異性探針序列 pyspT 5' -FAM-cgagcaccac acttcacaca g_TAMRA_3，0本發明所述的油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑的引物和探針制備
一、選擇油棕猝倒病菌ITS區保守片段為靶目標，該保守片段的擴增目標核苷酸序列如 SEQ ID NO 4 所示；
二、應用primerExpress 5. 0軟件，設計合成引物和探針；
三、引物和探針的合成采用β—乙腈磷酸胺化學合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；引物和探針由上海生工合成；
四、探針合成同時進行兩端熒光標記，探針5’端標記的熒光報告基團為FAM，3’端標記的熒光基團為TAMRA ；熒光報告基團FAM也可以用ΤΕΤ、VIC、JOE等發光基團代替；
五、將設計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探
針；
六、經過大量的反應條件優選、對比試驗和驗證試驗，并經過大量實際樣品的檢測應用評估，得到擴增效率和特異性好的所述的引物和所述的探針。由本發明的油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑組成的檢測試劑盒，由下述組份組成CTAB提取液(溶液1)30 mLX 2瓶，該CTAB提取液為含有終濃度為0. 7mol/L的NaCl、終濃度為100mmol/L、pH8. 0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(1Tris-HCl )、終濃度為20mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、終濃度為10g/L的聚乙烯吡咯烷酮360 (PVP-360)，終濃度為20g/L的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和體積終濃度為洲(V:V)的β-巰基乙醇的水溶液，含有濃度都為1 μ mol/L的所述引物和濃度為0. 4 μ mol/L的所述探針的2 X —步熒光定量PCR緩沖液(溶液II )1.25 mL,濃度為5U/yL的Taq DNA聚合酶(溶液III) 50 μ L，滅菌去離子水(溶液IV) 1. 25 mLX2支，含有油棕猝倒病菌、P. splendent)陽性DNA的陽性對照液(溶液V)50 μ L，不含有A splendens陽性DNA的陰性對照液(滅菌去離子水，溶液VI)50 μ L，含有濃度為IOOng/ μ L的P. splendens陽性DNA的定量標準液(溶液VII) 25 μ L。一步熒光定量PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶均購于TAKARA公司。陽性對照液和定量標準液是根據CTAB法提取的油棕猝倒病菌DNA配制的。用本發明的油棕猝倒病菌熒光定量檢測試劑盒檢測油棕猝倒病菌的方法，其步驟為
1)總DNA提取取經干燥的菌絲0. 5g，放入1. 5mL浸在液氮里的離心管中，用塑料杵碾碎；再加入600yL CTAB提取液，65°C水浴30min，不時顛倒混勻，10000 r/min離心5min ；取上清，加入該上清等體積的氯仿和異戊醇混合液，顛倒離心管至形成乳濁狀，4°C IOOOOrpm離心5min，所述氯仿和異戊醇混合液中氯仿與異戊醇體積比為1 ；取上清于新的1. 5mL離心管，加入冰冷乙醇和濃度為3 mol/L、PH為6. 0的醋酸鈉(NaAc)溶液，所述醋酸鈉溶液的體積為該上清體積的1/10，所述冰冷乙醇的體積為該上清體積的2. 5倍，顛倒混勻后，置于-20°C保存30 min,4°C 10000 rpm離心lOmin，棄上清，用質量濃度為70%的乙醇漂洗沉淀二次，晾干后，加入100 μ L滅菌去離子水溶解沉淀，得到樣品DNA，4°C保存備用；
2)PCR反應反應體系25 μ L 含有濃度都為1 μ mol/L的所述引物和濃度為0. 4 μ mol/L的所述探針的2 X —步熒光定量PCR緩沖液12.5 μ L，濃度為5U/μ L的Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，樣品DNA 0. 5 μ L，滅菌去離子水補足余量；反應參數50°C預熱2 min ；95°C預變性10 min ；95°C 15s,60°C 1 min，40個循環；PCR反應中若樣品DNA有熒光信號則為油棕猝倒病菌；同時用陽性對照液或陰性對照液替代樣品DNA進行PCR反應，可以進一步定性比較分析，用定量標準液替代樣品DNA進行PCR反應，可以進行樣品DNA的回歸曲線與根據定量標準液10 一 1 10 一7倍稀釋的回歸曲線比對，作出樣品DNA定量分析。本發明的油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑是將PCR技術與熒光檢測相結合，構建并篩選出上述擴增效率和特異性好的一對引物和一條探針，克服了常規PCR費時、易污染以及擴增后需電泳檢測等缺點，可對樣品中的油棕猝倒病菌進行快速準確的定性與定量檢測，具有簡單、易操作、結果直觀、敏感性高、重復性好等優點。具體優點如下
1、本發明與常規PCR的檢測試劑相比，具有特異、敏感的優點；可對樣品中低含量(可以8倍稀釋)的代論/74隱癥或帶菌寄主進行準確檢測，是一種非常適合八splendens檢測的方法；
2、本發明與常規PCR的檢測試劑相比，具有適用范圍廣，使用安全的優點；可對植株中的八577^/76/^進行快速檢測，適用范圍廣；本發明克服了常規PCR的產物須電泳檢測、接觸有毒試劑的缺點，降低了生物安全隱患，提高了使用安全性；
3、本發明與常規PCR的檢測試劑相比，具有檢測量大和快速檢測的優點；可同時進行大量樣品檢測，具有高通量性，可減少DNA或PCR產物污染的風險；常規PCR的檢測時間一般6小時以上，本發明無需擴增后的電泳分析，樣品檢測時間在4小時之內；
4、與常規PCR相比，熒光定量PCR作出一個定量的、客觀的估計，判斷出陽性、陰性和可疑結果，Ct值為40.0可確定為陽性和陰性的臨界值。更重要的是熒光定量PCR特別適用于帶菌量少，難以分離培養的樣品中病菌的快速檢測；
5、本試劑所組成的試劑盒可在收到樣品后4小時之內作出定性、定量檢測結果。用該熒光定量PCR試劑盒檢測P. splendens是一種的特異、敏感和穩定的檢測方法。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。1、設計引物和探針
本發明選擇油棕猝倒病菌ITS區保守片段為靶目標，通過GenBank中報道的八splendens及近似種ITS序列進行同源性分析比較，選定油棕猝倒病菌ITS區保守片段(94bp)，應用primer ExpreSS5. 0軟件，設計引物和探針。引物和探針的合成采用β —乙腈亞磷酸胺化學合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成探針，合成同時進行兩端熒光標記，探針5'端標記的熒光報告基團是FAM，3'端標記的是不發熒光的淬滅基團TAMRA。將設計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，確定擴增效率和特異性最好的一對引物和一條探針，引物序列分別如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示，探針序列如SEQ ID NO 3所示，擴增目標片段長度為94bp，其序列如SEQ ID NO 4所示。
2、標準化試劑盒組份(25 μ L反應X 100次)。
溶液I30mLX2 瓶溶液II1. 25mL溶液III50 μ L溶液IV1. 25mLX2 支溶液V50 μ L溶液VI50 μ L溶液VII25 μ L3、CTAB 法 DNA 提取
取油棕猝倒病菌菌絲0. 5g放入1.5mL浸在液氮里的離心管中，用塑料杵碾碎，加入600 μ L CTAB提取液，65°C水浴30 min，10000 r/min離心5min，取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液(ν v=24 1 )，顛倒混勻，40C 10000 rpm離心5min,取上清于新的離心管，加入該上清1/10體積的NaAc溶液(3 mol/L, pH 6.0)和該上清2. 5倍體積的冰冷乙醇(飽和)，置于-20°C保存30min ;4°C 10000 rpm離心lOmin，棄上清，用質量濃度為70 %乙醇漂洗沉淀二次，晾干后，加入100 μ L滅菌去離子水溶解沉淀，得到樣品DNA或陽性對照及配成濃度為lOOng/μ L定量標準液，4°C保存備用；該CTAB提取液中NaCl的終濃度為0. 7mol/L、Tris-HCl (pH8. 0)的終濃度為 100mmol/L、EDTA 的終濃度為 20mmol/L、PVP-360 的終濃度為10g/L，CTAB的終濃度為20g/L和β -巰基乙醇的體積終濃度為m (ViV)04、尸.spIendens熒光定量PCR擴增
P. spIendens熒光定量PCR采用25 μ L體積反應體系，在ΑΒΙ7900型熒光定量PCR儀中，反應體系為溶液1112. 5 μ L，溶液II10. 5 μ L，溶液V或溶液VI或溶液VII或DNA樣品0. 5μ L，滅菌去離子水補足余量，按下列反應參數進行PCR反應50°C預熱2 min ；95°C預變性IOmin ;95°C 15s,60°C 1 min，40個循環；用溶液V和溶液VI，按上述反應體系和反應參數對設計的多對引物和探針最佳配對篩選實驗，對篩選的引物和探針的濃度進行精確篩選，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強度增加值(△ to)。每次檢測時，每個樣品檢測做3管平行試驗。在陰性對照為陰性、陽性對照為陽性時，整個試驗有效，結果本發明的一對特異性引物和一條特異性熒光探針為Ct值低、靈敏度高，為合適的引物和探針。每個樣品須作多個備份，以進行穩定性、重復性試驗。5、P.印^^論/^熒光定量PCR的特異性和敏感性試驗采用近似種的刺腐霉Aspinosum、 寬雄腐霉A dissotocum、異宗腐霉P. heterothal 1 ium、鐘器腐霉P. vexans、畸雌腐霉A irregulare、終敬腐霉R WiifiK 、側雄腐霉A paroecandram、HU霉P.aphani derma turn ^P. sylvaticum^P. takayamanum、P. a t tran theridium 以及疫霉屬煙草、良霉Phytophthora nicotianaePhytophthora palmivora 和一些常見的根鏈格椒 Alternaria radicina > ^ ! Bo trytis cinerea > ttipt^ifelf lif Bacillus subtil is的DNA樣品與代印^^論/^菌株的DNA樣品進行特異性比較檢測。并將A splendensi株的DNA樣品進行10倍系列稀釋，對上述菌株的DNA樣品進行常規PCR檢測(常規方法)和按上述步驟4反應體系及相同條件下進行熒光定量PCR檢測，比較它們的敏感性，常規PCR采用的引物與熒光定量PCR的引物一致；結果本發明的一對特異性引物和一條特異性熒光探針只有A 論flS菌株產生熒光信號，可以對8倍稀釋反應有效，因此特異性強、靈敏度尚。6.Λ splendens熒光定量PCR的穩定性和重復性試驗在評估熒光定量PCR檢測油棕猝倒病菌方法的重現性、穩定性時，用陽性樣品和陰性樣品，在按上述步驟4反應體系及相同條件下，反復進行熒光定量PCR檢測，每次試驗的每個樣品做6個平行的反應管，重復12次；因此本發明的一對特異性引物和一條特異性熒光探針穩定性和重復性好。7、油棕猝倒病菌定量標準液的制備、標準曲線的建立以及樣品中油棕猝倒病菌含量的計算用CTAB法提取油棕猝倒病菌的DNA，用分光光度計測定其OD26tl值來進行DNA模板定量，OD260值為1相當于50 μ g/mL雙鏈DNA。采用滅菌去離子水，把提取得到的DNA稀釋定量到100 ng/yL。對該標準品進行10倍系列稀釋，得到10 — 1 10 — 7倍稀釋的DNA模板用于熒光定量PCR擴增(按上述步驟4反應體系及反應條件)，以模板濃度的對數值為X軸，Ct值為Y軸作回歸曲線并得出回歸方程。根據結果換算，可從未知樣品的Ct值得出其含有油棕猝倒病菌的DNA含量。8、引物和探針及其濃度的篩選選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得熒光定量PCR反應的最低Ct值和最高Afo1，提高擴增效率和敏感性。將引物濃度從0. lymol/L lymol/L以0. 1 μ mol/L遞增，確定引物最佳終濃度。探針濃度從0. 2 μ mol/L 1 μ mol/L以0. 1 μ mol/L遞增，確定探針最佳終濃度。結果是25 μ L反應體系中引物終濃度為0. 5 μ mol/L,探針終濃度為0. 2 μ mol/L較好。9、對樣品的檢測
對供試樣品進行熒光定量PCR檢測，結果表明，陽性樣品均具有典型的擴增曲線，Ct值小于35. 0，陰性對照及陰性樣品均無典型擴增曲線，也無Ct值。三個平行試驗的結果穩定一致。證明熒光定量PCR檢測P. splendens的特異性強、敏感度高和重復性好。9. 1 總 DNA 提取
(1)取經干燥的菌絲0.5g，放入1.5 mL浸在液氮里的離心管中，用塑料杵碾碎；
(2)加入600yL溶液I，65°C水浴30min，不時顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min ；
(3)取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(V:V=24:1)，顛倒離心管至形成乳濁狀不很快分層，4°C 10 000 rpm 離心 5 min ；
(4)取上清于新的1.5 mL離心管，加入該上清體積1/10的NaAc (3 mol/L,pH 6. 0)和2. 5倍的冰冷乙醇，顛倒混勻后，置于-20°C保存30 min。4°C 10000 rpm離心10 min，棄上清；
(5)用70%乙醇漂洗沉淀二次，晾干后，加入100 μ L滅菌去離子水溶解沉淀，4°C保存9. 2PCR 反應
(1)25μ L反應體系溶液II12. 5 μ L，溶液II10. 5 μ L，樣品DNA0. 5 μ L，滅菌去離子水補足余量；同時設陽性對照和陰性對照25 μ L反應體系2管；
(2)定量也用標準品進行稀釋后進行PCR反應制作標準曲線，標準品至少7個稀釋度。9.3擴增在ΑΒΙ7900型熒光定量PCR儀中，按下列反應參數進行50°C預熱2min ;95°C預變性 10 min ；95°C 15s，60°C 1 min，40 個循環。
9. 4結果分析和判定
(1)結果分析條件設定
閾值線設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準；
(2)質控標準
陰性對照無Ct值，并且無典型擴增曲線。陽性對照的Ct值應小于35. 0，并出現典型的擴增曲線，2個陽性對照擴增曲線基本重合，特別是在熒光臨界值(Ct值)附近。否則，此次實驗視為無效。定量用的標準品擴增曲線出現典型的擴增曲線，指數區較明顯，7個點具良好的線性范圍，平臺區匯于一起，相關系數在0. 99以上；
(3)結果描述及判定
陰性無Ct值或無擴增曲線，表示樣品中無油棕猝倒病菌；
陽性Ct值應小于等于35. 0，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中存在油棕猝倒病菌；有效原則Ct值在35. (Γ40. 0的樣本建議重做。重做結果無Ct值或無典型擴增曲線判為陰性，否則判為陽性；
定量樣品DNA的回歸曲線與根據標準品的回歸曲線比對，作出樣品DNA定量。
權利要求
1.油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑，包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標片段長度為94bp，其特征在于該一對特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO :2所示，該特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，該特異性探針的5'端標記有熒光報告基團FAM，3'端標記有不發熒光的淬滅基團TAMRA，擴增目標片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
2.由權利要求1所述的油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑組成的試劑盒，其特征在于由下述組份組成CTAB提取液30mLX2瓶，含有濃度都為1 μ mol/L的所述引物和濃度為0. 4 μ mol/L的所述探針的2 X —步熒光定量PCR緩沖液1. 25mL,濃度為5U/ μ L的TaqDNA聚合酶50 μ L，滅菌去離子水1. 25 mLX 2支，含有油棕猝倒病菌陽性DNA的陽性對照液50μ L，不含有油棕猝倒病菌陽性DNA的陰性對照液50μ L，含有濃度為lOOng/μ L的油棕猝倒病菌陽性DNA的定量標準液25 μ L，所述CTAB提取液為含有終濃度為0. 7mol/L的NaCl、終濃度為lOOmmol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、終濃度為20mmol/L的乙二胺四乙酸、終濃度為10g/L的聚乙烯吡咯烷酮360，終濃度為20g/L的十六烷基三甲基溴化銨和體積終濃度為21的β -巰基乙醇的水溶。
3.利用權利要求2所述的油棕猝倒病菌熒光定量檢測試劑盒檢測油棕猝倒病菌的方法，其特征在于步驟為1)總DNA提取取經干燥的菌絲0.5g，放入1. 5mL浸在液氮里的離心管中，用塑料杵碾碎；再加入600 μ L CTAB提取液，65°C水浴30min，不時顛倒混勻，10000 r/min離心·5min;取上清，加入該上清等體積的氯仿和異戊醇混合液，顛倒離心管至形成乳濁狀，4°C、IOOOOrpm離心5min，所述氯仿與異戊醇混合液中氯仿和異戊醇體積比為Μ: 1 ；取上清于新的1. 5mL離心管，加入冰冷乙醇和濃度為3 mol/L、I3h為6. 0的醋酸鈉溶液，所述醋酸鈉溶液的體積為該上清體積的1/10，所述冰冷乙醇的體積為該上清體積的2. 5倍，顛倒混勻后，置于-20°C保存30 min，4°C、IOOOOrpm離心lOmin，棄上清，用質量濃度為70%的乙醇漂洗沉淀二次，晾干后，加入100 μ L滅菌去離子水溶解沉淀，得到樣品DNA，4°C保存備用；2)PCR反應反應體系25 μ L 含濃度都為1 μ mol/L的所述引物和濃度為0. 4 μ mol/L的所述探針的2 X —步熒光定量PCR緩沖液12.5 μ L，濃度為5U/μ L的Taq DNA聚合酶·0. 5 μ L，樣品DNA 0. 5 μ L，滅菌去離子水補足余量；反應參數50°C預熱2 min ；95°C預變性·10 min ；95°C 15s,60°C 1 min，40個循環；PCR反應中若樣品DNA有熒光信號則為油棕猝倒病菌。
全文摘要
本發明公開了油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑及檢測試劑盒和應用，檢測試劑含有序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的一對特異性引物和序列如SEQ ID NO3所示一條特異性熒光探針，擴增目標片段長度為94bp，擴增目標片段的核苷酸序列如SEQ ID NO4所示；檢測試劑盒由CTAB提取液、含引物和探針的PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、陽性對照液、陰性對照液和定量標準液等組份，檢測方法包括總RNA的提取和熒光PCR反應，該油棕猝倒病菌熒光定量PCR檢測試劑檢測時，克服了常規PCR費時、易污染以及擴增后需電泳檢測等缺點，可對樣品中的油棕猝倒病菌進行快速準確的定性與定量檢測，具有簡單、易操作、結果直觀、敏感性高、重復性好等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102382890SQ20111035609
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者張慧麗, 徐瑛, 王建峰, 聞偉剛 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術研究院