專利名稱：一種嗜熱棲熱菌utm802及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及環境微生物領域，具體地，涉及嗜熱棲熱菌UTM802及其應用。
背景技術：
嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)是ー類在40°C以下不能生長,最適生長溫度為65-70 V，最高生長溫度80°C，好氧、革蘭氏陰性、非芽孢桿菌，具有特殊的細胞壁結構。棲熱菌是高溫菌的典型代表，是高溫生物學基礎研究和應用研究的重點菌群，與水熱環境關系密切，廣泛存在于各地地熱溫泉，海底火山ロ及人工水熱環境(如熱水管道和高溫好氧堆肥)。
傳統堆肥一般是利用堆肥物料中的土著微生物，往往存在發酵時間長，臭氣污染嚴重且腐熟度低等問題，通過在堆肥初期接種微生物制劑的辦法可以提高堆肥效率和成品質量。接種微生物促進堆肥腐熟的機理有1)提高堆肥初期微生物的群體，增強微生物的降解活性；2)縮短達到高溫期的時間；3)接種分解有機物質能力強的微生物。ー些從堆肥中分離出來的高溫菌、中溫菌、放線菌和真菌常作為堆肥接種劑加速細胞壁和木質素、纖維素水解，促進腐殖化過程。目前，高溫堆肥采用的微生物接種劑主要是中溫好氧菌。沈根祥等(1999)在蘑菇培養料上篩選出能促進冷性牛糞高溫發酵的微生物菌群(Hsp菌劑)；顧希賢(1995)從22個垃圾堆肥、畜糞、土壤等樣品中分離獲得198株纖維分解菌，從中篩選出2株繁殖速度快、粗纖維分解能力強的制成菌劑，并以O. 05%-0. 1%的比例接種到垃圾堆肥的二次發酵中；李季等(2000)篩選出近10個具有不同功能作用、繁殖速度快的細菌、真菌、酵母均等，按照不同比例組合，篩選出能廣泛用于畜禽糞便、市政污泥等有機廢物堆肥的VT菌劑；席北斗(2003)利用從環境中分離的微生物，通過誘變培育出活性較高的纖維素分解菌株，并將康氏木霉、白腐菌、變色栓菌與EM菌、固氮菌、解磷菌、解鉀菌按一定比例組合成高效復合微生物菌劑。申請號為201010514582. 7的中國專利介紹了ー種將銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌、短小芽孢桿菌和珊瑚色諾卡氏菌以及將綠色木霉、脫氮副球菌、黃曲霉、黃孢原毛平革菌和圓褐固氮菌制備成兩種堆肥接種劑，用于堆肥發酵的不同階段。專利號為CN 101486969A、CN101186879A、CN101696391A 等中國專利也公布了將多種芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、光合菌、固氮菌、霉菌等組合制備的堆肥復合菌劑。這些微生物接種劑中的活性成分在50°C -80°C的堆肥高溫期環境中常常受到抑制甚至失活，大大降低了接種劑的功效。嗜熱棲熱菌較常溫菌相比，具有更高的微生物代謝活性和有機物降解速率，在固體有機廢物處理領域具有廣闊的應用前景和科學價值。棲熱菌還具有熱穩定性的降解酶，可以將堆肥溫度維持在70°C -80°C或更高的溫度，可以更加有效的殺死病原微生物，達到無害化的要求，同時棲熱菌酶不僅耐熱，而且對不良化學環境也具有高度的耐受性，能抵抗ー些有毒害作用的污染物或代謝產物的抑制作用，提高處理效率，縮短生產周期。棲熱菌的應用，可為有機固體廢物更好實現減量化、無害化、穩定化和資源化利用的エ業化生產創造有利條件。
將嗜熱棲熱菌作為接種劑應用于堆肥，可提高有機物質的降解速率，縮短エ藝運行時間，在有機廢物資源化利用領域中具有潛在的應用價值。但目前還未見到關于嗜熱棲熱菌作為接種劑應用于高溫堆肥的報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種嗜熱棲熱菌及其在高溫堆肥中的應用。本發明從高溫期污泥堆肥中，經高溫富集、分離純化得到嗜熱棲熱菌Thermusthermophilus UTM802菌株。UTM802于2012年6月4日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJii :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號=CGMCC No. 6186。所述嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus UTM802的鑒定特征是(I)為革蘭氏陰性、無鞭毛、菌體呈短桿狀、無芽孢、專性好氧、菌落光滑、邊緣平整；最適生長溫度65-70°C，最高80°C，最低40°C ;最適pH值7. 5-7. 8，最高9. 5，最低6. O。(2)利用引物(27f):5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和(1492r):5' -GGTTAC CTT GTT ACG ACT T-3/經PCR擴增該菌株的16S rRNA基因，基因序列如SEQ ID NOI所示，獲得序列提交到EzTaxon數據庫進行比對,結果顯示與Thermus thermophilus HB8(T)的相似性最高，為98. 9%。(3)65_70°C下，在復合培養基(O. 8%蛋白胨，O. 4%酵母膏，O. 2%NaCl,0. 05%微量元素，用NaOH調pH到7. 2，固體培養基加I. 5%瓊脂。微量元素營養液組成為(25g MgCl2 ·6Η20，5g CaCl2, 2g MgSO4 · 6Η20，0· 5g ZnSO4 · 7Η20，0· 5g H3BO3, 5g FeCl3 · 6H20,15mg CuSO4, 25mgNaMoO4 *2H20,20mg NiNO3 *6H20, 50mgCoN03 *6H20,80mg 鹽酸吡哆醇，IOmg 葉酸，0. 5mL 硫酸，IOOmg鹽酸硫胺素,40mg核黃素，80mg煙酰胺，80mg對氨基苯甲酸甲酷，IOmg生物素,O. 4mg氰鈷胺，80mg泛酸，20mg硫辛酸，200mg肌醇，50mg氯化膽堿，50mg乳清酸，IOOmg亞精胺，IOOOmL蒸餾水)上生長良好。本發明還提供ー種含有所述嗜熱棲熱菌UTM802的高溫菌劑。所述高溫菌劑含有嗜熱棲熱菌UTM802的有效活菌個數I X IO4^l X IO6個/克。其中，所述高溫菌劑還含有載體，所述載體為腐熟堆肥，所述腐熟堆肥含水率30%以下。所述高溫菌劑的制備方法包括以下步驟I)菌種發酵將UTM802斜面菌種接種改良YTPG固態斜面上培養；將活化的菌種接種于改良YTPG液態培養基中培養,制備發酵種子液；將發酵種子液接種至發酵罐培養基中發酵培養，得發酵菌液；2)制備高溫菌劑發酵液與腐熟堆肥混勻，干燥、粉碎、篩分得到。其中，步驟(I)中所述菌種活化的方法是取4°C保存的UTM802斜面菌種轉接至改良YTPG固態斜面上，在65°C 70°C下培養至豐厚。所述改良YTPG固態斜面的配方是酵母提取物I. 5^2. 5g/L，蛋白胨I. 5^2. 5g/L，葡萄糖 I. 5 2. 5g/L，PIPES 4. 5 7. 5g/L，浸提液 IOOOmL, pH 7. 2 7· 4 (用固態 NaOH 調節)，植物凝膠8 12g/L，瓊脂15 20g/L ；所述浸提液制備方法稱取50g 100g —次發酵后腐熟堆肥(含水率小于30%)，カロ入250mL蒸餾水，在室溫下，15(T200rpm振蕩8 16小時；取振蕩液在300(T4000rpm下離心5 20min，收集上清液，得浸提液母液，在4°C保存備用；使用吋，用蒸餾水稀釋廣3倍即為培
養基浸提液。所述發酵種子液制備的方法是取步驟(I)中活化培養至豐厚的斜面I個，用無菌水沖洗菌落至IOOOmL改良YTPG液態培養基中，在恒溫搖床上振蕩培養，得發酵種子液。所述改良YTPG液態培養基與上述步驟(I)改良YTPG固態斜面配方的區別是不含 有植物凝膠和瓊脂。所述發酵種子液的培養條件是溫度65 70°C，轉速12(T200rpm，恒溫搖床上振蕩培養廣3天。所述發酵菌液制備的方法是按5% 15%的接種量將發酵種子液接種至發酵罐中，在罐溫28 35°C、罐壓O. 02 O. 06MPa、通氣量I: I. O I. 5v/v/min、攪拌速度200 300轉/分鐘、發酵時間3 8天，得到發酵液；發酵罐中所用的培養液組成為按200_400g/L的濃度將腐熟堆肥(含水率小于30%)溶解在水中，在室溫下，15(T200rpm攪拌4 8小吋，然后靜置過濾，收集上清液，得發酵母液；使用時，在發酵母液中加入1°/Γ3%的糖蜜或紅糖，1°/Γ3%的碳銨、尿素、蛋白胨中的一種或多種制備成發酵罐培養基。其中，步驟(2)中所述高溫菌劑的制備方法是將所得到的發酵菌液均勻噴灑在含水率30%以下的腐熟堆肥上，接種量約為5%-10%，然后經烘干、粉碎、過篩，制備成高溫菌劑成品，高溫菌劑中有效活菌個數I X IO4^l X IO6個/克。所述腐熟堆肥為利用有機固體廢棄物經過高溫好氧發酵制備的物料，有機固體廢棄物包括農作物秸桿、畜禽糞便、食品エ業下腳料、城市污泥、生活垃圾、枯枝落葉、菇渣等，所述腐熟堆肥的標準為物料經過高溫發酵后(55°C以上高溫持續一周以上)溫度下降到環境溫度，含水率30%以下，種子發芽指數大于60%。高溫菌劑在有機固廢堆肥化中的應用方法是按重量比19Γ5%與待發酵物料混合即可。所述有機固廢堆肥初始含水率45% 55%、C/N 20 30、ρΗ 7 8。本發明的有益效果是本發明所提供的嗜熱棲熱菌UTM802在堆肥達到60-80°C的高溫環境中均生長良好，具有穩定的降解性能，能快速降解有機物質，加快堆肥進程。本發明菌株以有機廢物為載體，制備固態微生物堆肥接種劑，成本低，應用于堆肥時不會對物料水分產生影響。利用本發明固態微生物堆肥接種劑進行高溫堆肥，可避免接種劑中的活性微生物在高溫發酵期失活，具有性能穩定、使用方便的特點。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I嗜熱棲熱菌UTM802的篩選稱取5g高溫期污泥堆肥樣品于裝有15個玻璃珠與50mL無菌水的150mL三角瓶中，置于搖床上160rpm振蕩I小時，使樣品充分散開，然后放置70°C下，靜置3小吋。
取無菌平皿，吸取ImL高溫富集液和低倍稀釋液，接入已作好標記的平皿中；將已融化并冷卻至55°C左右的改良YTPG培養基倒入無菌培養皿中，每皿約30mL，前后左右輕輕搖動培養皿，與富集液充分混勻，待凝固。將凝固后的平板倒置于密閉容器中，同吋，每密閉容器中放置一個裝有蒸餾水的培養皿，置于培養箱中70°C培養。每天觀察，待長出菌落后，仔細觀察菌落特征，確定不同類型菌株，繼續采用改良YTPG培養基平板上進行劃線分離純化，從平板上菌落形態特征和簡單染色后顯微鏡下多視野確認菌體形態一致后得到純菌，并繼續在70°C下傳代培養5代，淘汰生長不穩定的菌株，得到嗜熱棲熱菌UTM802。將UTM802轉接轉至改良YTPG培養基斜面，培養至豐厚，在4°C保藏備用。其中，改良YTPG培養基的配制方法是(I)浸提液制備先稱取50g —次發酵后的腐熟污泥堆肥，加入250mL蒸懼水,在室溫下，180rpm振蕩過夜；取振蕩液在4000rpm下離心lOmin，收集上清液，在4°C保存備用；使用吋，用蒸餾水稀釋2倍即為培養基浸提液。 (2)按培養基配方(酵母提取物2. Og，蛋白胨2. 0g，葡萄糖2. 0g，PIPES 6. 0g，培養基浸提液IOOOmL, pH 8. O (用固態NaOH調節)，植物凝膠10g，瓊脂15g)配制，在121°C下滅菌25分鐘。實施例2嗜熱棲熱菌UTM802的鑒定將實施例I所得到的嗜熱棲熱菌UTM802在改良YTPG培養基平板上，70°C下培養24小時，觀察其特征，結果它是革蘭氏陰性、好氧菌且不形成孢子，菌體呈短桿狀。以本發明菌株UTM802的DNA為模板，PCR擴增其16S rRNA序列，引物為(27f)5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3/ 和(1492r):5' -GGT TAC CTT GTTACG ACT T-3/ 。PCR反應程序為95°C預變性5min，95°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸90s，30個循環，72°C延伸lOmin。擴增產物經電泳檢測其純度后測序，測序結果見序列表SEQ ID NO. I所示。獲得的16S rDNA基因序列通過EzTaxon數據庫(http://www.eztaxon.org/)進行比對，同源性在97%以上的菌株只有Thermus thermophilus HB8 (T)(相似度98. 95%)，故將UTM 802 鑒定為 Ther mus thermophilus HB8(T)。配制復合培養基(O. 8%蛋白胨，O. 4%酵母膏，O. 2%NaCl，0. 05%微量元素，用NaOH調pH到7. 2，固體培養基加I. 5%瓊脂。微量元素營養液組成為(25g MgCl2 · 6H20，5gCaCl2, 2g MgSO4 · 6H20，0. 5g ZnSO4 · 7H20，0. 5g H3B03，5g FeCl3 · 6H20，15mg CuSO4, 25mgNaMoO4 · 2H20, 20mg NiNO3 · 6H20, 50mg CoNO3 · 6H20,80mg 鹽酸吡哆醇，IOmg 葉酸，O. 5mL 硫酸，IOOmg鹽酸硫胺素,40mg核黃素，80mg煙酰胺，80mg對氨基苯甲酸甲酷，IOmg生物素，O. 4mg氰鈷胺，80mg泛酸，20mg硫辛酸，200mg肌醇，50mg氯化膽堿，50mg乳清酸，IOOmg亞精胺，IOOOmL蒸餾水)，接種UTM802，發現在50°C _80°C下均能生長。結合文獻報道，將該菌株鑒定為Thermus thermophilus HB8 (T),命名為Thermusthermophilus UTM 802，并于2012年6月4日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJii :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏,分類命名為嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus,保藏號為CGMCCNo.6186。實施例3嗜熱棲熱菌UTM802生長的溫度范圍將UTM 802菌株接種于改良YTPG培養基平板上在70°C下活化培養24小吋。然后接種于改良YTPG培養基上，在培養溫度40 V、50°C、60 V、70°C、80 V下培養。根據溫度標記，分別放入不同的恒溫箱中培養，在24小時后觀察菌株長勢，辨別菌株的生長情況。將觀察結果填入下表I。“一”表示不生長；“ + ”表示微生長；“++”表示中度生長；“+++”表示生長良好。表I不同溫度對微生物生長的影響
權利要求
1.嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus) UTM802，其保藏號為CGMCC No. 6186。
2.含有權利要求I所述嗜熱棲熱菌UTM802的高溫菌劑。
3.根據權利要求2所述的高溫菌劑，其特征在于，含有嗜熱棲熱菌UTM802的有效活菌個數I X IO4 IO6個/克。
4.根據權利要求2或3所述的高溫菌劑，其特征在于，還含有載體，所述載體為腐熟堆肥。
5.根據權利要求4所述的高溫菌劑，其特征在于，所述腐熟堆肥含水率30%以下。
6.權利要求2-5任一項所述高溫菌劑的制備方法，包括以下步驟 1)菌種發酵將嗜熱棲熱菌UTM802活化，制備發酵種子液，之后進行發酵培養，得發酵菌液； 2)制備高溫菌劑將發酵菌液與腐熟堆肥混勻，干燥、粉碎、篩分得到。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述菌液與腐熟堆肥的質量百分比為5% 10%。
8.權利要求I所述端嗜熱菌UTM802菌株或權利要求2-5任一項所述高溫菌劑在有機固廢堆肥化中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在干，所述高溫菌劑與有機固廢混合的重量百分比為1% 5%。
全文摘要
本發明涉及嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)UTM802，其保藏號為CGMCC No.6186。本發明菌株以有機廢物為載體，制備固態微生物堆肥高溫菌劑，成本低，應用于堆肥時不會對物料水分產生影響。利用本發明固態微生物堆肥高溫菌劑進行高溫堆肥，可避免接種劑中的活性微生物在高溫發酵期失活，具有性能穩定、使用方便的特點。
文檔編號C12N1/20GK102851246SQ201210343220
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者劉永躍, 周順桂, 許宜北, 汪涌 申請人:大地綠源環保科技(北京)有限公司