專利名稱：類胡蘿卜素合成相關(guān)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及類胡蘿卜素合成相關(guān)基因及其應(yīng)用，具體地涉及CYP97A4基因，該基因參與植物在強(qiáng)光脅迫條件下的光保護(hù)、捕光復(fù)合物II的三聚體裝配及穩(wěn)定等作用。本發(fā)明還公開(kāi)了所述基因及其所編碼的蛋白酶的用途，尤其是在植物品種改良和雜交育種中用于改變植物的光保護(hù)性質(zhì)。
背景技術(shù)：
類胡蘿卜素屬于四萜化合物，在自然界中廣泛存在于光能自養(yǎng)生物。類胡蘿卜素包括胡蘿卜素和葉黃素兩大類，前者是只含有碳和氫原子的多烯烴，后者是前者的含氧衍生物。根據(jù)含量的高低，植物葉片中主要的類胡蘿卜素成分是葉黃質(zhì)(lutein)，β-胡蘿卜素(β-carotene)、紫黃素(violaxanthin)與新黃素(neoxanthin)。其中，葉黃質(zhì)(Lutein)作為葉片器官中含量最高的類胡蘿卜素，對(duì)于光合系統(tǒng)捕光復(fù)合體亞基的裝配、穩(wěn)定型維持以及光保護(hù)起到非常重要的作用。由于類胡蘿卜素種類的多樣性與復(fù)雜性，多種多樣的蛋白酶參與到合成代謝與分解代謝中。因此，為了有效地、有針對(duì)性地改變植物品種，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)與類胡蘿卜素合成有關(guān)的編碼基因、蛋白及其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因及其應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供所述基因編碼的多肽及其用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種改變植物中類胡蘿卜素組成成分的比例或含量、或提高植物抗強(qiáng)光脅迫的能力的方 法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的CYP97A4多肽或其編碼基因的用途，所述用途任選自下組:(I)所述CYP97A4多肽或基因用于催化β，ε -類胡蘿卜素的β _環(huán)的羥化反應(yīng)；和/或(2)所述CYP97A4多肽或基因用于改變植物中類胡蘿卜素組成成分的比例或含量；和/或(3)所述CYP97A4多肽或基因用于提高植物抗強(qiáng)光脅迫的能力。 在另一優(yōu)選例中，所述的CYP97A4多肽選自下組:⑴具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；(ii)將SEQ ID NO:2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)(如1_10個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有催化類胡蘿卜素β_環(huán)的羥化反應(yīng)功能的由(i)衍生的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的CYP97A4多肽的編碼序列選自下組:(I)編碼如SEQ ID NO:2所述多肽的多核苷酸序列；
(2)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；(3)與(I)或(2)所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種提高植物抗高光脅迫能力，或提高植物捕光色素復(fù)合體II三聚體的裝配及穩(wěn)定能力的方法，所述方法包括:提高所述植物中CYP97A4多肽的表達(dá)或活性。在另一優(yōu)選例中，所述的抗高光脅迫能力為抗光氧化脅迫的能力。 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括:(I)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有CYP97A4多肽的編碼序列；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(I)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使表達(dá)CYP97A4多肽的DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇已轉(zhuǎn)入CYP97A4多肽編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。在另一優(yōu)選例中，所述植物選自下組:水稻、大麥、玉米、楊樹(shù)、大豆，或葡萄。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種提高植物中β，ε -類胡蘿卜素與β，β-類胡蘿卜素比例和含量的方法，所述方法包括:降低植物CYP97A4多肽的表達(dá)或活性。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種提高植物中α -胡蘿卜素或α -隱黃質(zhì)的含量的方法，所述方法包括:降低植物中CYP97A4多肽的表達(dá)或活性。在另一優(yōu)選例中，所述方法為:特異性敲除或干擾CYP97A4多肽的編碼基因的表達(dá)；或特異性的抑制CYP97A4多肽的活性。在另一優(yōu)選例中，特異性敲除或干擾CYP97A4多肽編碼基因的表達(dá)方式選自下組:RNA干擾法，MiRNA調(diào)控法，siRNA調(diào)控法，或其組合。 在另一優(yōu)選例中，特異性抑制CYP97A4多肽的活性方法包括:表達(dá)CYP97A4的抗體或配體。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖1顯示水稻CYP97A4-YFP蛋白熒光(圖1A左圖)與葉綠體自發(fā)熒光(圖1B左圖)完全重疊(圖1B右圖)，表明CYP97A4特異性定位在葉綠體內(nèi)，圖1A是35S::CYP97A4-YFP融合蛋白構(gòu)建，圖1C是對(duì)照35S::YFP空載體。圖2顯示水稻cyp97a4突變體由于β -環(huán)羥化功能缺失導(dǎo)致底物α -隱黃質(zhì)(a -cry, a -cryptoxanthin)與 α -胡蘿卜素(α -car, a -carotene)的積累；圖 2A 為背景品種Nippon的葉片類胡蘿卜素成分結(jié)果；圖28為野生對(duì)照TosWT_97a4-l的葉片類胡蘿
卜素成分結(jié)果；圖2C為cyp97a4-l的葉片類胡蘿卜素成分結(jié)果。

圖3顯示互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為室外種植并取葉片抽提色素的HPLC圖譜，結(jié)果顯示，cyp97a4_l突變體苗(圖3A)中出現(xiàn)的兩個(gè)新的成分a-cry和a-car,在互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因單株的葉片里消失(圖3B)，HPLC圖譜恢復(fù)為與野生型(圖3C) —致；圖3A為cyp97a4_l的葉片類胡蘿卜素成分分析結(jié)果；圖38為轉(zhuǎn)入互補(bǔ)載體的cyp97a4轉(zhuǎn)基因苗類胡蘿卜素成分結(jié)果；圖3C為背景品種Nippon的葉片類胡蘿卜素成分結(jié)果。圖4顯示藍(lán)綠溫和凝膠電泳分離各基因型類囊體膜中色素-蛋白復(fù)合體分析結(jié)果，突變體的捕光復(fù)合體II三聚體(LHCII trimer)減少，單體(LHCII monomer)增多(cyp97a4-l、4-2為突變體；TosWT_a4-l、4_2為野生型對(duì)照；Nippon背景品種)。圖5顯示強(qiáng)光脅迫條件下，cyp97a4突變體比對(duì)照組更敏感(左半圖為CK，右半圖為強(qiáng)光處理)(cyp97a4-l、4-2，4-3為突變體；TosWT_a4-l、4-2、4_3為野生型對(duì)照；Nippon背景品種)。突變體葉片出現(xiàn)光破壞現(xiàn)象，葉片損傷嚴(yán)重(圖5B、圖5D、圖5F)，而對(duì)照(圖5A、圖5C、圖5E)沒(méi)有明顯變化。各基因型水稻離體的葉片在強(qiáng)光照射一段時(shí)間后煮沸脫色，突變體(圖5H、圖5J、圖5L)的染色結(jié)果更深。圖6顯示在正常光照條件和強(qiáng)光照脅迫下，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)過(guò)量表達(dá)CYP97A4的四個(gè)轉(zhuǎn)基因系0E_1 0E_4體內(nèi)積累的ROS都明顯少于空載體對(duì)照(vector)，提高強(qiáng)光脅迫的耐受能力，圖6A為正常生長(zhǎng)條件，圖6B為強(qiáng)光處理?xiàng)l件。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過(guò) 廣泛而深入的研究，獲得一種與類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因CYP97A4，生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述基因編碼的蛋白參與β，ε -類胡蘿卜素的β-環(huán)羥化反應(yīng)，維持捕光復(fù)合體II的三聚體裝配及穩(wěn)定，參與植物在強(qiáng)光脅迫條件下的光保護(hù)等生理過(guò)程。本發(fā)明還提供了所述基因及其編碼的多肽的用途，及其在植物品種改良中的作用。具體地，本發(fā)明人通過(guò)反向遺傳學(xué)方法，找到一個(gè)類胡蘿卜素β_環(huán)羥化酶，并得到了全長(zhǎng)cDNA序列。該基因?qū)儆诩?xì)胞色素Ρ450家族的單加氧酶類。該基因含有Ρ450蛋白共有的兩個(gè)保守結(jié)構(gòu):結(jié)合血紅素的保守結(jié)構(gòu)域以及含有蘇氨酸并結(jié)合氧分子的基序。高效液相色譜(HPLC)分析結(jié)果顯示此基因被敲除之后，與野生型相比，突變體體內(nèi)存在的類胡蘿卜素，包括葉黃質(zhì)、新黃素、紫黃素與β_胡蘿卜素的含量都顯著減少，葉黃質(zhì)的底物
胡蘿卜素含量顯著提高，葉綠素a與葉綠素b的比值沒(méi)有變化。非變性蛋白電泳表明突變體光合系統(tǒng)中捕光復(fù)合體II三聚體形式含量降低，而單體形式相應(yīng)增加。在強(qiáng)光下突變體的葉片更容易發(fā)生光破壞，而對(duì)照葉片并沒(méi)有發(fā)生明顯改變。化學(xué)染色結(jié)果顯示突變體葉片在光脅迫時(shí)會(huì)積累更多的活性氧物質(zhì)(ROS)，從而導(dǎo)致了突變體敏感表型。由此可見(jiàn)，所述基因在水稻以及其他經(jīng)濟(jì)作物中參與強(qiáng)光脅迫下光保護(hù)過(guò)程，具有廣泛的應(yīng)用潛力。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“CYP97A4蛋白”、“CYP97A4多肽”等可互換使用，指具有CYP97A4蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。在未特別指出時(shí)，術(shù)語(yǔ)“CYP97A4蛋白”包括野生型和突變型CYP97A4蛋白。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。如本文所用，“分離的CYP97A4蛋白或多肽”是指CYP97A4蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化水稻CYP97A4蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括CYP97A4蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然CYP97A4蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是:(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的；(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽；(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“CYP97A4蛋白”或“CYP97A4多肽”指具有類胡蘿卜素β _環(huán)羥化酶活性的多肽，其中一個(gè)序列如SEQ ID Ν0:2所示。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與CYP97A4蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1 -30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括CYP97A4蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度的條件下能與CYP97A4蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含CYP97A4蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽夕卜，本發(fā)明還包括了 CYP97A4蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有CYP97A4蛋白序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸,最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“CYP97A4保守性變異多肽”指與SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表I
權(quán)利要求
1.一種分離的CYP97A4多肽或其編碼基因的用途，其特征在于，所述用途任選自下組: (1)所述CYP97A4多肽或基因用于催化β，類胡蘿卜素的β_環(huán)的羥化反應(yīng)；和/或 (2)所述CYP97A4多肽或基因用于改變植物中類胡蘿卜素組成成分的比例或含量；和/或 (3)所述CYP97A4多肽或基因用于提高植物抗強(qiáng)光脅迫的能力。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CYP97A4多肽選自下組: (i)具有SEQID NO:2氨基酸序列的多肽； (ii)將SEQID NO:2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有催化類胡蘿卜素β_環(huán)的羥化反應(yīng)功能的由(i)衍生的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CYP97A4多肽的編碼序列選自下組: (1)編碼如SEQID NO:2所述多肽的多核苷酸序列； (2)如SEQID NO:1所示的多核苷酸序列； (3)與(I)或(2)所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸。
4.一種提高植物抗高`光脅迫能力，或提高植物捕光色素復(fù)合體II三聚體的裝配及穩(wěn)定能力的方法，其特征在于，提高所述植物中CYP97A4多肽的表達(dá)或活性。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗高光脅迫能力為抗光氧化脅迫的能力。
6.如權(quán)利要求4-5任一所述的方法,其特征在于,該方法包括: (1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有CYP97A4多肽的編碼序列； (2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(I)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使表達(dá)CYP97A4多肽的DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上； (3)選擇已轉(zhuǎn)入CYP97A4多肽編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官； (4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物選自下組: 水稻、大麥、玉米、楊樹(shù)、大豆，或葡萄。
8.一種提高植物中β，ε -類胡蘿卜素與β，β-類胡蘿卜素比例和含量的方法，其特征在于，降低所述植物中CYP97A4多肽的表達(dá)或活性。
9.一種提高植物中α-胡蘿卜素或α-隱黃質(zhì)的含量的方法，其特征在于，降低所述植物中CYP97A4多肽的表達(dá)或活性。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，特異性敲除或干擾CYP97A4多肽的編碼基因的表達(dá)；或特異性的抑制CYP97A4多肽的活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了類胡蘿卜素合成相關(guān)基因及其應(yīng)用，具體地，所述的基因?yàn)镃YP97A4，該基因參與植物在強(qiáng)光脅迫條件下的光保護(hù)、捕光復(fù)合物II三聚體裝配及穩(wěn)定等作用。本發(fā)明還公開(kāi)了該基因及其所編碼的多肽的用途，尤其是在植物品種改良和雜交育種中改變植物的光保護(hù)性質(zhì)和類胡蘿卜素組成成分中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P23/00GK103114120SQ20111036399
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者林鴻宣, 呂明珠, 晁代印, 高繼平, 單軍祥, 朱美珍, 施敏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院