專利名稱：一種真核蛋白表達載體及其構建和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種表達載體，具體涉及一種真核蛋白表達載體及其構建和應用。
背景技術：
蛋白表達是實驗室應用非常廣泛的技術，目前主要有原核表達系統和真核表達系統兩種。原核表達系統能夠在較短時間內獲得大量目的蛋白，成本也比較低廉。但無法對表達時間及表達水平進行調控；細菌產生的致熱原致使表達產物難以應用于臨床；目的蛋白常以包涵體形式表達，致產物純化困難；原核表達系統的翻譯后加工修飾體系不完善；表達產物的生物活性較低。
真核表達系統能夠彌補原核表達系統的不足，能誘導基因高效表達，嚴格調控基因表達，即不僅可控制基因表達的“開關”，還可人為地調控基因表達量；表達后修飾，使蛋白更接近體內型。但是成本相對高，并且表達量比原核要低。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。能使目的基因進入宿主細胞表達的克隆載體叫表達載體，可以是質粒、曬菌體或病毒等。典型的表達載體帶有能使基因表達的調控序列，并在適當位置有可插入外源基因的限制性內切酶位點，常用細菌質粒進行構建，構建過程中運用限制性核酸內切酶將目的基因與載體基因連接，導入生物體實現表達。標記基因可幫助識別質粒并檢測是否成功整合到染色體DNA中。Invitrogen公司的pcDNA3. I系列表達載體在大多數哺乳動物細胞里均能夠高水平、穩定表達，其CMV啟動子能夠保證在廣泛的哺乳動物細胞中進行高水平表達，多克隆位點是插入外源基因的部位，有很多種限制性內切酶的位點，可產生粘性末端，便于插入外源基因。Neomycin用于篩選穩定表達細胞系,Ampicillin用來篩選目的質粒。其中pcDNA3. I帶有his,myc標簽基因,his可以用于表達蛋白的純化及鑒定,但購買pcDNA3. I帶有his標簽的真核表達載體，就要購買相應配套的蛋白純化體系及鑒定體系的相關試劑，價格昂貴。而pcDNA3. 3 TOPO表達載體是在pcDNA3. I的基礎上對啟動子進行了修飾，所以表達水平高于pcDNA3. 1，能獲得極高的蛋白質表達水平，適于大規模蛋白制備。但pcDNA3. 3T0P0表達載體不帶有任何標簽基因，表達的蛋白無法進行富集純化和鑒定。因此，要獲得既能高效表達，又能易于富集純化、鑒定目的蛋白的真核蛋白表達載體，還需要進一步的研究和創新。發明目的為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種新型真核蛋白表達載體，該表達載體不僅能高水平表達蛋白、執行翻譯后修飾、維護蛋白天然結構，并可同時表達用于表達蛋白鑒定和純化的標簽蛋白，而且鑒定及純化蛋白所用的試劑不依賴于生物試劑公司，價格低廉。本發明的另一目的是提供所述表達載體的構建方法。本發明的第三個目的是提供所述表達載體在表達目的蛋白中的應用。
本發明提供的一種真核蛋白表達載體，所述表達載體為在PCDNA3. 3T0P0表達載體的TOPO位點上插有Human IgGl-Fc基因，得到結構如下的所述真核蛋白表達載體pcDNA3. 3-IgG-Fc 質粒
權利要求
1.一種真核蛋白表達載體，其特征在于所述表達載體為在pcdna3. 3T0P0表達載體的TOPO位點上插入Human IgGl-Fc基因，得到蛋白表達載體pcDNA3. 3_I gG_Fc質粒。
2.按照權利要求I所述的真核蛋白表達載體的構建方法，其特征在于包括步驟(I) human IgGl-Fc基因擴增引物設計，⑵以逆轉錄得到的cDNA為模板，PCR擴增humanIgGl-Fc基因，(3)將human IgGl-Fc PCR擴增產物與pcDNA3. 3T0P0載體連接，從中選擇CMV forward引物測序human IgGl-Fc為正向的pcDNA3. 3_IgG_Fc質粒,得到所述真核蛋白表達載體。
3.按照權利要求I所述的真核蛋白表達載體在表達目的蛋白中的應用，其特征在于其步驟包括(I)目的蛋白基因的特異引物設計，(2)以逆轉錄得到的cDNA為模板，以所設計引物進行PCR擴增，(3)目的蛋白基因的PCR擴增產物及pcDNA3. 3-IgG-Fc用HindII I、BgLII及BamHI同時來酶切，連接具有相同粘性末端的pcDNA3. 3-IgG-Fc部分和目的基因部分(4)目的蛋白富集用所述目的蛋白基因插入pcDNA3. 3-IgG-Fc構建的真核蛋白表達質粒通過Lipofectin轉染cos-7細胞,培養上清中加入蛋白A瓊脂糖懸液,雜交爐中低溫緩慢搖動混勻2. 5-3. 5小時，離心棄去上清，沉淀為蛋白A-目的蛋白復合物，加入上樣緩沖液煮沸3-6分鐘，取上清獲得含目的蛋白和標簽蛋白的融合蛋白。
4.按照權利要求I所述的真核蛋白表達載體在表達目的蛋白中的應用，其特征在于其步驟包括(I)目的蛋白基因的特異引物設計，(2)以逆轉錄得到的cDNA為模板，以所設計引物進行PCR擴增，(3)目的蛋白基因的PCR擴增產物連接于T-easy載體，(4)用BamHI、HindIII及BgLII同時來酶切所述pcDNA3. 3-IgG-Fc和帶目的蛋白基因的T_easy兩種質粒，連接具有相同粘性末端的pcDNA3. 3-IgG-Fc部分和目的基因部分，(5)目的蛋白富集用所述的pcDNA3. 3-IgG-Fc-4-lBB表達質粒通過Lipofectin轉染cos_7細胞，培養上清中加入蛋白A瓊脂糖懸液，雜交爐中低溫緩慢搖動混勻2. 5-3. 5小吋，離心棄去上清，沉淀為蛋白A-目的蛋白復合物，加入上樣緩沖液煮沸3-6分鐘，取上清獲得含目的蛋白和標簽蛋白的融合蛋白。
5.按照權利要求3或4所述的真核蛋白表達載體在表達目的蛋白中的應用，其特征在于還包括步驟(6)目的蛋白鑒定以獲得的目的融合蛋白進行western blot實驗,用辣根酶標記的抗人IgG抗體與融合蛋白中的IgG-Fc部分結合顯色表明目的蛋白的存在。
全文摘要
本發明涉及真核蛋白表達載體，所述表達載體為在pcDNA3.3TOPO表達載體的TOPO位點上插入Human IgG1-Fc基因，得到真核蛋白表達載體pcDNA3.3-IgG-Fc質粒。本發明構建的真核蛋白表達載體，不僅能引入外源基因進行蛋白表達，執行翻譯后修飾，維護蛋白天然結構；獲得極高的蛋白質表達水平，適合用于大規模蛋白制備；并可同時表達標簽蛋白IgG-Fc，利用其可以對表達蛋白進行鑒定和純化，且純化及鑒定蛋白所用試劑為實驗室常備試劑，價格低廉，擺脫了對生物公司配套產品的依賴及配套產品價格昂貴的困擾。
文檔編號C12N15/66GK102676571SQ20111036628
公開日2012年9月19日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者張洪濤, 易玲, 許紹發, 趙雁林 申請人:北京市結核病胸部腫瘤研究所