專利名稱：一種基因工程口服dna疫苗及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體涉及一種基因工程口服DNA疫苗，同時還涉及一種基因工程口服DNA疫苗的制備方法，還涉及一種基因工程口服DNA疫苗的用途，具體涉及構(gòu)建對蝦抗菌肽Penaeidin-2信號肽與鯉魚生長激素基因的融合基因sgh，并將融合基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1-中，質(zhì)粒pcDNA3. 1 (-)—signal-GH通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入到減毒的鼠傷寒沙門氏菌Mlmonella typhimurium W0420中，制備促進(jìn)克氏螯蝦生長的口服DNA疫苗。
背景技術(shù)：
生長激素(Growth Hormone, GH)是動物腺垂體細(xì)胞合成并分泌的一種具有種屬特異性的單鏈蛋白質(zhì)類激素，一般由186 191個氨基酸組成，分子量約為2. 1 2. 2KDa。 一般情況下，生長激素呈脈沖式分泌，其分泌受下丘腦產(chǎn)生的生長激素釋放素(GHRH)的調(diào)節(jié)。生長激素作用機(jī)理較為復(fù)雜，生長激素的主要生理功能是促進(jìn)神經(jīng)組織以外的所有其他組織生長，能促進(jìn)骨骼生長，蛋白質(zhì)合成，對胰島素有拮抗作用，并影響葡萄糖和脂類的代謝，與動物生長發(fā)育和繁殖等密切相關(guān)。魚類生長激素(fish growth hormone, fGH)是由魚腦垂體合成并分泌的一種蛋白多肽。魚類生長激素參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，脂類的代謝和降解等生理功能，能夠顯著提高魚的生長速率，在水產(chǎn)領(lǐng)域里有較高的應(yīng)用價值和市場前景。上世紀(jì)70年代中期研究學(xué)者首次分離到魚類生長激素。1976年farmer等從羅非魚腦垂體中分離得到生長激素。最初魚類生長激素分離主要通過柱層析，再經(jīng)過沉淀分級，從垂體的堿性提取物中獲得生長激素。目前研究學(xué)者對魚類生長激素的組成、結(jié)構(gòu)、功能、基因調(diào)控等方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并取得了一定的研究成果。通過基因工程技術(shù)將魚類生長激素在大腸桿菌或酵母中高效表達(dá)。進(jìn)一步的研究證實，在大腸桿菌或酵母中表達(dá)的魚類生長激素通過喂食、肌肉注射、高滲浸泡等方法對魚體具有顯著促進(jìn)生長作用。即通過基因工程技術(shù)表達(dá)重組魚類生長激素與天然魚類生長激素具有相似的生物活性和功能，目前重組魚類生長激素已經(jīng)應(yīng)用于促進(jìn)魚，蝦和貝類的生長。魚類生長激素主要是通過激活靶細(xì)胞膜上的受體來實現(xiàn)其生物學(xué)活性，魚類生長激素受體主要分布在肝臟細(xì)胞膜上，近年來研究發(fā)現(xiàn)魚類生長激素也可以直接作用于其它組織細(xì)胞，如腎臟、心臟和肌肉等組織的細(xì)胞膜上。魚類生長激素是新陳代謝的調(diào)節(jié)子元件，能促進(jìn)魚生長和發(fā)育，提高餌料中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，對糖類代謝的影響主要表現(xiàn)在可以促進(jìn)肝糖原的消耗和增強(qiáng)對碳水化合物的利用能力。近年來有研究學(xué)者表明，魚類生長激素能刺激卵巢細(xì)胞產(chǎn)生類固醇激素調(diào)節(jié)其性腺發(fā)育，魚血清中生長激素水平與季節(jié)變化也存在一定的關(guān)系。研究學(xué)者闡明魚生長激素對蛙科魚類滲透壓調(diào)節(jié)起到了重要作用。生長激素能夠提高Na+-K+ATP酶的活性，同時抑制魷科魚類從淡水到海水遷移時引起的血漿滲透性和離子濃度提高。魚類生長激素還能參與魚類各種應(yīng)激反應(yīng)。
1995年HJ Tsai和KLLin利用原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)黃鰭鯛生長激素， 并將表達(dá)的黃鰭鯛生長激素經(jīng)復(fù)性純化后注射到黃鰭鯛體內(nèi)，12周后注射生長激素的實驗組黃鰭鯛體長和體重與對照組比較分別提高了 22%和65% (HJTsai.，KLLinJ.，C Kuo. Highly efficient expression of fish growth hormone by Escherichiacoli cells[J]. App 1. Envir. Microbiol, 1995,61 :4116-411.)。研究學(xué)者表明喂食外源生長激素能夠增加魚類蛋白質(zhì)的合成，還可以增強(qiáng)魚類對餌料中某些必需氨基酸的吸收。Sieridan等研究學(xué)者證實生長激素能提高魚肝臟中脂肪酶活性，促進(jìn)脂肪分解，以作為能量促進(jìn)魚類生長。生長激素作用途徑有以下兩種，一種是誘導(dǎo)肝細(xì)胞、肌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素樣生長因子家族(insulin-like growth factor, IGFs)等生長介導(dǎo)素，再經(jīng)胰島素樣生長因子間接起作用，IGF-I由70個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為7.6kDa，與胰島素原約有50%的序列相似性。IGF-I通過與受體結(jié)合而發(fā)揮作用，其受體主要為IGFl受體(IGFlR)和IGF/ 胰島素雜合受體。另一種是生長激素激活JAK2(JanUsKinase)，JAK2和生長激素受體(GHR) 磷酸化，并同磷酸化的受體一起將生長激素信號向下游傳遞。無論上述哪一種生長激素作用途徑，生長激素都必須首先與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，通過受體的介導(dǎo)，激發(fā)一系列生化反應(yīng)最終發(fā)揮其生物效應(yīng)。生長激素還能通過JAK2介導(dǎo)胰島素受體底物(IRS-1或 IRS-3)的磷酸化來激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3-K/Akt)信號通路。2008年Arenal A等研究學(xué)者，將羅非魚生長激素基因構(gòu)建在真核表達(dá)載體中，通過胚胎電穿孔方法，將質(zhì)粒導(dǎo)入到南方濱對蝦胚胎受精卵中，PCR和Southern雜交分析有36%的幼蝦中檢測到羅非魚生長激素基因，后續(xù)研究證實與對照組比較，南方濱對蟲下幼蟲下的體重有32%的增力口 (Arenal A.，Pimentel R. Growthenhancement of shrimp(Litopenaeus schmitti)after transfer of tilapia growth hormone gene[J]. Biotechnol Lett, 2008, 30 (5) :845-851)。2007 年 Guti6rrez A 等將幼蝦蛻皮階段注射重組人活牛胰島素，測定蝦體血淋巴(肌肉，肝胰臟，鰓)中葡萄糖/糖原水平發(fā)現(xiàn)，注射后Ih 后血淋巴中血糖水平增加，并注射證后血糖水平開始下降。研究表明胰島素很可能是在甲殼類動物中參與調(diào)節(jié)了糖代謝(Gutierrez Α.，Nieto J.，Pozo F.，Stern S.，Schoofs L. Effect of insulin/IGF-I like peptides on glucose metabolism in thewhite shrimp Penaeus vannamei [J]. Gen Comp Endocrinol. 2007,153 :170-175.)。孫孝文等用顯微注射法將生長激素基因?qū)胫袊鴮ξr受精卵中，基因轉(zhuǎn)移比例可以到達(dá)3%以上(孫孝文，劉萍等.顯微注射生長激素基因?qū)胫袊鴮ξr受精卵的研究.中國水產(chǎn)科學(xué)，1996， 3(4) :35-38)。DNA疫苗是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動物體內(nèi)， 使外源基因在機(jī)體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。DNA疫苗具有減毒疫苗的優(yōu)點，又無逆轉(zhuǎn)的危險，因此越來越受到研究學(xué)者的重視，被看作是繼傳統(tǒng)疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗。DNA疫苗具有以下優(yōu)點構(gòu)建載體結(jié)構(gòu)簡單，提純質(zhì)粒DNA的工藝簡便，適于大批量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本較低；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA克隆比較容易，使得DNA疫苗能根據(jù)實際需求隨時進(jìn)行更新；質(zhì)粒DNA分子較為穩(wěn)定，可制成DNA疫苗凍干苗便于保存； 與傳統(tǒng)疫苗比較，DNA疫苗安全性更高，其具有與減毒疫苗等同的免疫原性，能夠激活T淋巴細(xì)胞而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，由于DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒有毒性逆
4轉(zhuǎn)的可能性，因而不存在減毒疫苗毒力回升的問題；質(zhì)粒DNA疫苗抗原表位比較穩(wěn)定，DNA 疫苗不像減毒疫苗或亞單位疫苗那樣，會出現(xiàn)表位丟失；目前將多種DNA混合，組成多價疫苗，從而使一種DNA疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對多個抗原表位的免疫保護(hù)作用，使DNA疫苗生產(chǎn)的靈活性顯著提高。目前有研究學(xué)者對質(zhì)粒DNA疫苗的安全性問題存在疑慮，擔(dān)心質(zhì)粒DNA可能會整合到宿主細(xì)胞的染色體上造成插入突變，但現(xiàn)階段研究表明并未發(fā)現(xiàn)有插入突變產(chǎn)生。質(zhì)粒DNA在動物體內(nèi)會緩慢降解，不會造成動物的自體免疫。質(zhì)粒DNA疫苗主要免疫方法是將質(zhì)粒溶入陽性脂質(zhì)體，使用基因槍皮內(nèi)或肌內(nèi)注射。DNA疫苗還可以通過靜脈、鼻內(nèi)、口服等接種方法。1892年科學(xué)家首次從小鼠體內(nèi)分離出鼠傷寒沙門氏菌，1893年證實該菌可引起人食物中毒，明確該菌是人、鼠共同致病菌。后續(xù)研究表明沙門氏菌屬于腸道病原菌，是一種侵襲性胞內(nèi)菌，與宿主通過III型分泌機(jī)制介導(dǎo)，這種機(jī)制使該菌的效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞。沙門氏菌侵入機(jī)體的途徑可分為兩種以M細(xì)胞為代表的上皮細(xì)胞途徑和以樹突狀細(xì)胞為代表的細(xì)胞途徑。沙門氏菌可選擇性地入侵派伊爾結(jié)Grayer’ s pathch, PP)的 M細(xì)胞，隨后破壞M細(xì)胞，然后被位于上皮下穹隆區(qū)的APCs捕獲。M細(xì)胞自身可對許多外源物質(zhì)進(jìn)行吞飲，將抗原物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，從介導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生初級免疫應(yīng)答。寒沙門氏菌也可通過非M細(xì)胞途徑進(jìn)入機(jī)體。目前有報道表明，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)在攝取腸腔中的物質(zhì)方面起到了重要作用。樹突狀細(xì)胞廣泛分布于脾臟、派伊爾結(jié)、淋巴結(jié)等組織中。腸道內(nèi)樹突狀細(xì)胞主要定位于腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes, MLN)和腸道上皮黏膜固有層(lamia propria, LP) 0沙門氏菌侵入腸上皮組織后進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，通過血液循環(huán)，定居在肝臟和脾臟等器官。研究學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)的減毒沙門氏菌是鏈霉素依賴型菌株，需要宿主體內(nèi)保持一定濃度水平的鏈霉素才能穩(wěn)定增殖。上世紀(jì)70年代Germarier等采用化學(xué)誘變劑對沙門氏菌進(jìn)行化學(xué)誘變，從大量的誘變菌株中篩選得到一株減毒沙門氏菌菌株。目前研究學(xué)者已對沙門氏菌致病機(jī)理有了較深入的研究，基本能夠判定沙門氏菌病原體在宿主體內(nèi)寄生的必需基因，能確定沙門氏菌減毒的部分基因。通過基因定點突變，獲得減毒沙門氏菌安全菌株。通過化轉(zhuǎn)和電轉(zhuǎn)的方法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到減毒沙門氏菌菌株后，帶有質(zhì)粒DNA減毒沙門氏菌通過自然感染的途徑，高效地將質(zhì)粒DNA直接運(yùn)送到體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞(APCs)和巨噬細(xì)胞，淋巴組織誘發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫。沙門氏菌主要減毒突變株asd突變株；aro 突變株:aro 基因系列(aroA、aroC、aroD) ；dam 突變株；cya、crp/cdt 突變株禾口 phoP/phoQ 突變株等。將沙門氏菌染色體中編碼天門冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因(asd)突變，該基因編碼合成二氨基庚二酸(DAP)途徑中的一種酶，DAP是合成革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖的重要組成部分。哺乳動物組織中不含DAP，因此該突變菌在動物體內(nèi)或不含DAP的培養(yǎng)基中均被裂解。將構(gòu)建含asd質(zhì)粒轉(zhuǎn)化突變菌后可形成互補(bǔ)，菌體能穩(wěn)定生長和繁殖。aroA基因編碼EPSP (5_烯醇丙酮酰莽草酸_3_磷酸)合成酶，該酶催化對氨基苯甲酸和2，4-二羥基苯甲酸鹽分支酸途徑的中間反應(yīng)，產(chǎn)生芳香族氨基酸。當(dāng)aroA基因缺失時，該減毒菌株在無法在哺乳動物體獲得這些化合物，生長受到限制而被減毒。研究學(xué)者在后續(xù)研究中構(gòu)建了 aroC和aroD等基因突變減毒株。
dam基因編碼DNA腺苷酸甲基化酶，該酶編碼的甲基化酶能將甲基轉(zhuǎn)移到GATC序列中的腺嘌呤N6位點上，這些位點的甲基化可以控制RNA聚合酶和調(diào)節(jié)蛋白的相互作用。 當(dāng)dam基因缺失后，細(xì)菌基因組突變率會明顯增高，從而達(dá)到減毒目的。cAMP受體蛋白(crp)基因和腺苷酸環(huán)化酶(cya)基因在轉(zhuǎn)錄水平上可以調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，在運(yùn)輸氨基酸和表達(dá)表面蛋白中發(fā)揮著重要作用。由于crp和cya基因的缺失，消除了細(xì)菌在哺乳動物中攝取cAMP的唯一途徑，因此該突變型菌株在宿主細(xì)胞內(nèi)不能轉(zhuǎn)化成野生型菌株。phoP基因編碼轉(zhuǎn)錄激活因子，PhoQ基因編碼傳感器激酶，PhoP毒力調(diào)節(jié)子是鼠沙門氏菌致病和在巨噬細(xì)胞存活的必需因子。它由WioP蛋白、WioQ蛋白和受它們調(diào)節(jié)的系列基因組成。PhoP/WioQ蛋白能對脂多糖(LPQ成分中的類脂A進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，改變LPS刺激宿主細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的水平，而減少內(nèi)毒素作用。phoP/phoQ基因編碼高度保守的雙因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)酸性磷酸酶的合成，促使細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存，與鼠傷寒菌的毒力、侵襲力密切相關(guān)。因此PhoP/phoQ基因缺失突變的沙門氏菌是減毒株，并為接受宿主提供了安全保證。1997年Destoumieux等研究學(xué)者首次從凡納濱對蝦的血淋巴中分離得到對蝦抗菌肽penaeidins家族，隨后對其結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行了深入的研究 (Destoumieux D,Bulet P,Loew D. Penaeidins,a new family of antimicrobialpeptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei(Decapoda). J. Biol. Chem. 1997,272 (28) 398-406)。penaeidins家族是一種新型的天然抗菌肽，并具有與DNA或幾丁質(zhì)結(jié)合功能，現(xiàn)已在不同對蝦中發(fā)現(xiàn)了超過40種penaeidin存在。Penaeidins分子大小為5. 48-6. 62kDa, 是陽離子抗菌肽。Penaeidins具有兩個活性結(jié)構(gòu)域，N末端的區(qū)域有一個富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域，C末端區(qū)域含有4-6個半胱氨酸，可以形成2-3對二硫鍵，這兩個結(jié)構(gòu)域在penaeidins 各個亞家族中都高度保守，但各個penaeidins亞家族之間也具有一定差異性。研究學(xué)者由 cDNA合成的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)，Penaeidins的合成要經(jīng)過信號肽的前體合成過程。該信號肽位于Penaeidins的前端，且該信號肽氨基酸序列高度保守，由19-21個氨基酸殘基組成。 研究表明penaeidins初始翻譯產(chǎn)物均含有信號肽，該信號肽主要負(fù)責(zé)Pen的加工和翻譯后運(yùn)輸。本發(fā)明將一種對蝦抗菌肽Penaeidin-2的信號肽與鯉魚生長激素基因融合，并將融合基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1-中，質(zhì)粒pcDNA3. 1㈠一signal-GH通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入到減毒的鼠傷寒沙門氏菌&ilm0nella typhimurium W0420中，制備促進(jìn)克氏螯蝦生長的口服DNA疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種口服DNA疫苗基因工程菌株，該菌株是減毒鼠傷寒沙門氏菌，具有較好的安全性。將對蝦抗菌肽Penaeidin-2信號肽與鯉魚生長激素基因融合，并將融合基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1-中，質(zhì)粒pcDNA3. 1 (-)-signal-GH通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入到減毒的鼠傷寒沙門氏菌Mlmonella typhimurium W0420中，制備促進(jìn)克氏螯蝦生長的口服DNA疫苗。通過口服應(yīng)用于克氏螯蝦養(yǎng)殖試驗，結(jié)果證明該口服DNA 疫苗具有促進(jìn)對蝦生長發(fā)育，減毒鼠傷寒沙門氏菌Mlmonella typhimurium W0420能夠?qū)①|(zhì)粒DNA運(yùn)送到克氏螯蝦幼蝦體內(nèi)，生長激素口服DNA疫苗促進(jìn)克氏螯蝦幼蝦生長。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種口服DNA疫苗基因工程菌株的制備方法， 易于工業(yè)化生產(chǎn)，操作簡單，成本低，安全性好。該口服DNA疫苗具有轉(zhuǎn)運(yùn)促生長的DNA疫苗到克氏螯蝦體內(nèi)的能力，并且該DNA疫苗能夠明顯促進(jìn)克氏螯蝦幼蝦生長；具有水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用前景。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯蝦幼蝦養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)要點之一是基因工程菌株的構(gòu)建。本實驗所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等主編。一種基因工程口服DNA疫苗的制備方法，其步驟如下1.鯉魚生長激素(carp mature growth hormone)成熟肽基因的制備用兩條鯉魚腦垂體，按照RNA提取試劑盒的方法提取其總mRNA后，通過RT-PCR 得到總cDNA，根據(jù)GenBank鯉魚生長激素的cDNA序列，設(shè)計并合成引物，以上述得到的總 cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到鯉魚生長激素GH基因，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收 PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體(在promega公司購置)中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 (在 INVITR0GEN公司購置)，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法小量(15-20 μ g)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含gh基因的大腸桿菌，命名為pGEM-T-GH。2.融合基因Sgh的制備PCR擴(kuò)增sgh基因通過PCR重疊延伸技術(shù)分3次PCR合成sgh。以實驗室保存的 pGEM-T-GH 質(zhì)粒為模板，上游引物 Pl :5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3 劃線處為 XhoI 位點，退火溫度為56°C，PCR擴(kuò)增目的片段，電泳并作回收；以上一步回收產(chǎn)物為模板，以上游引物P2 :5_GT CTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_,下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTT GGAATCCAGGGATCT3_，退火溫度56°C做PCR，電泳并作回收；以上一步回收產(chǎn)物為模板，以上游引物 P3 5 GCGGCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3 (劃線處為 NheI 位點)，下游引物 P4 5 GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA3，退火溫度 56°C 做 PCR，PCR 擴(kuò)增目的基因sgh。PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM_T載體(在 promega公司購置)中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 (在INVITR0GEN公司購置)，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含sgh 基因的大腸桿菌，命名為pGEM-T-SGH。3.融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NheI，XhoI 雙酶切 pGEM-T-SGH和 pcDNA3· 1 (-)(購置 hvitrogen 公司)，膠回收開環(huán)質(zhì)粒pcDNA3. 1㈠和SGH基因的片段，4°C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)JM109 中，所得到的陽性克隆子命名為JM109/pcDNA3. l(-)—signal-GH。4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌將質(zhì)粒pcDNA3. 1(-)-signal-GH (5 μ 1)轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌 Salmonellatyphimurium W0420感受態(tài)細(xì)胞中。PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的口服DNA疫苗Salmonella typhimuriumff0420/ pcDNA3. l(-)—signal-GH。一種基因工程口服DNA疫苗菌株，其特征在于，該疫苗為基因工程菌株， Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1(-)—signal-GH, CCTCC NO :M2011233。戶;f白勺■ @ 工禾呈胃 tt Salmonella typhimurium W0420/ pcDNA3. 1(-) —signal-GH,重組質(zhì)粒 /pcDNA3. 1 (-)—signal_GH 為本發(fā)明所構(gòu)建。所述的基因工程菌株 Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1 (-)—signal-GH，重組質(zhì)粒 pcDNA3. l(-)--signal-GH為本發(fā)明所構(gòu)建，保藏編號保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2011年7月4日，分類命名CCTCC NO M2011233, Salmonella typhimuriu W0420/pcDNA3. 1 (-)—signal-GH。所述的一種分離的蛋白質(zhì)(pcDNA3. 1(-)-signal-GH編碼基因)，其序列為SEQUENCEN0. 1所示的核苷酸序列。 所述的一種分離的蛋白質(zhì)，蛋白SGH是具有SEQUENCE NO. 2的氨基酸序列的蛋白。其序列為SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序列。通過上述的制備，獲得了因工程菌株Salmonella typhimuriumff0420/ pcDNA3. 1 (-)—signal-GH, 一種口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯蝦幼蝦養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，其應(yīng)用基本步驟是本發(fā)明與現(xiàn)有報道DNA疫苗相比，其優(yōu)勢在于(1)本研究以減毒鼠傷寒沙門氏菌&ilmonella typhimurium W0420作為質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到克氏螯蝦幼蝦體內(nèi)。( 本研究首次通過PCR重疊延伸技術(shù)將對蝦抗菌肽Penaeidin-2的信號肽與鯉魚生長激素基因融合，并將融合基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1-中。分別將質(zhì)粒PCDNA3. 1㈠一signal-GH通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入到減毒的鼠傷寒沙門氏菌 Salmonella typhimurium W0420 巾。(3) M Μ. M Salmonellatyphimurium W0420/ pcDNA3. 1 (_)—signal-GH包被飼料喂食克氏螯蝦幼蝦，與對照組&ilmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1-克氏螯蝦幼蝦相比，前者生長速率顯著提高。(4)本發(fā)明所涉及的口服 DNA疫苗便于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉，操作工藝簡單。


圖1為一種真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1㈠一signal-GH的構(gòu)建過程示意圖。圖2為一種真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (-)-signal-GH的酶切和PCR鑒定示意圖。M. DL2000 1. sgh PCR 產(chǎn)物 2· ρcDNA3· 1 (-)--s i gna 1-GH 質(zhì)粒 3. pcDNA3. 1 (-) —signal-GH 質(zhì)粒單酶切 /XhoI 4. pcDNA3. 1 (-) -signal-GH 質(zhì)粒雙酶切 / NheI,XhoI 5.DL10000。圖 3 為一種重組菌 Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1 (-) -signal-GH 的 PCR鑒定示意圖。M Marker D2000 ； 1陰性對照；2沙門氏菌特異引物；3GH特異弓|物
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及具體實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。在實施例中涉及的所有培養(yǎng)基和分子生物學(xué)操作方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本實驗所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等主編。實施例1 鯉魚生長激素成熟肽基因(GH)的制備。(1)鯉魚生長激素RNA的提取取兩條鯉魚腦垂體，按照RNeaSyK Kit的操作說明書提取其總RNA，提取得到的總 RNA放置-80°C備用。(2)合成GH cDNA的第一條鏈按照Reverse Transcription System 試劑盒說明書，以 Oligo (dT) 2(1 為引物合成 cDNA 第一鏈。反應(yīng)體系如下,依次將 12 μ 1 25mM MgCl2 ；6 μ 1 ReverseTranscription IOXBuffer ；6 μ 1 dNTP Mixture IOmM ；2 μ 1 Recombinant RNasinRibonuclease Inhibitor ；4 μ 1 AMV Reverse Transcriptase ；6μ 1 Oligo (dT) 20 Primer ； 15 μ 1 Total RNA加入經(jīng)DEPC水處理并滅菌過的PCR管中。反應(yīng)程序為42°C反應(yīng)1小時，95°C反應(yīng)5分鐘，4°C反應(yīng)5分鐘。將上述反應(yīng)后的產(chǎn)物放置于-20°C以作為目的基因克隆的模板。(3)鯉魚生長激素GH的制備 依據(jù)GenBank中已發(fā)表的鯉魚生長激素GH cDNA序列，綜合分析后設(shè)計合成一對 PCR 引物。上游引物 P1 ATGTCAGACAACCAGCGG，下游引物 P2 CTACAGGGTGCAGTTGG。引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA第一鏈為模板，按照以下反應(yīng)體系2μ1 cDNA第一鏈； 4μ 1 25mM MgCl2 ；2 μ IReverse Transcription IOXBuffer ；4 μ 1 dNTP Mixture IOmM ； 2 μ 1 Upstream primer(20 μ M/L) ；2 μ 1 Downstream primer(20 μ M/L) ；0.5 μ 1 Taq DNA Polymerase ；3. 5 μ IDEPC處理的去離子水。應(yīng)用降落式PCR的形式進(jìn)行反應(yīng)，其反應(yīng)參數(shù)為95°C預(yù)變性 4min，94°C變性 30sec，60-50°C退火 30min，72°C延伸 lmin，20 個循環(huán)；94°C 變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸lmin，10個循環(huán)，72°C再延伸lOmin。將上述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化。具體步驟如下將上述PCR產(chǎn)物在(質(zhì)量體積比) 瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下要回收的目的條帶。用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，具體操作如下將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf 管中，稱其重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液(凝膠重為0. lg，其體積可視為ΙΟΟμ 1， 以此類推)。55°C水浴10分鐘，其間每3分鐘溫和上下翻轉(zhuǎn)Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取650 μ 1加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫O0-25°C 以下相同)放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600 μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中?？罩?2000rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置5_10分鐘，徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。向吸附膜中間位置懸空滴加50 μ 1洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。將純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(在promega公司購置)連接。連接體系如下1μ 1 IOXLigation Buffer ；2 μ 1 pGEM-T 載體；6 μ 1 純化后的 PCR 產(chǎn)物；1μ 1 Τ4 DNA Ligase。連接反應(yīng)液4°C水浴放置過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109。從LB平板上挑取單菌落于300 μ 1新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度lOOyg/ml氨芐青霉素)中，37°C，300rpm 搖床培養(yǎng)3小時，以此菌液為模板，以上游引物P1、下游引物P2進(jìn)行PCR初步鑒定，并送上海生工有限公司測序。將陽性克隆的菌液轉(zhuǎn)接5 μ 1于20ml新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為100yg/ml氨芐青霉素)中，37°C，300rpm搖床培養(yǎng)過夜，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，置于_20°C備用。重組質(zhì)粒命名為pGEM-T-GH。實施例2 融合基因Sgh的制備。PCR擴(kuò)增sgh基因通過PCR重疊延伸技術(shù)分3次PCR合成sgh。以實驗室保存的 pGEM-T-GH 質(zhì)粒為模板，上游引物 P3 :5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3 劃線處為 XhoI 位點，退火溫度為 56°C，PCR 擴(kuò)增目的片段。PCR 反應(yīng)體系5μ1 10XK0D Buffer ；2μ 1 MgCl2 (25mM)； 5 μ 1 dNTP Mixture(2. 5mM) ； 1 μ 1 Upstream primer(25pmol) ；1 μ 1 Downstream primer (25pmol) ;1 μ 1 Template ；1 μ 1 Taq DNAPolymerase (IU/μ 1)；力口無菌水至終體積為 50 μ 1。sgh 基因的 PCR 反應(yīng)條件為94°C 30s, 56 °C 30s, 68 °C Imin (30 個循環(huán))， 68°C IOmin0將上述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化。具體步驟如下先將PCR 產(chǎn)物在(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下要回收的目的條帶。 用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，具體操作如下將單一的目的 DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱其重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液(凝膠重為0. lg，其體積可視為100 μ 1，以此類推)。55°C水浴10分鐘，其間每3分鐘溫和上下翻轉(zhuǎn)Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取650 μ 1加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫O0-25°C以下相同)放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μ 1漂洗液，12000rpm離心 2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600μ 1漂洗液， 12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中?？罩?2000rpm離心 2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置5_10分鐘， 徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。向吸附膜中間位置懸空滴加50 μ 1洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。以上一步回收產(chǎn)物為模板，以上游引物 P5 :5_GTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_,下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGG TGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3_，退火溫度 56°C做 PCR，PCR 反應(yīng)體系5μ 1 10XK0D Buffer ； 2μ 1 MgCl2 (25mM) ；5 μ 1 dNTPMixture (2. 5mM) ；1 μ 1 Upstream primer (25pmol) ；1 μ 1 Downstream primer(25pmol) ； 1 μ 1 Template ； 1 μ 1 Taq DNA Polymerase(IU/μ 1)；力口無菌水至終體積為50 μ 1。sgh基因的PCR反應(yīng)條件為94°C 30s, 56°C 30s, 68°C Imin (30個循環(huán))，68°C lOmin。將上述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化。具體步驟如下先將PCR產(chǎn)物在(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下要回收的目的條帶。用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，具體操作如下將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱其重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液 (凝膠重為0. Ig,其體積可視為100 μ 1，以此類推)。55°C水浴10分鐘，其間每3分鐘溫和上下翻轉(zhuǎn)Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取650 μ 1加入到一個吸附柱中 (吸附柱放入收集管中)，室溫(20-25°C以下相同)放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μ 1漂洗液，12000rpm 離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600 μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置5_10 分鐘，徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。向吸附膜中間位置懸空滴加50μ 1 洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。以上一步回收產(chǎn)物為模板，以上游引物 P6 5 GCGGCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3 (劃線處為 NheI 位點)，下游引物 P4 5 GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA3 ,退火溫度 56°C 做 PCR，PCR 擴(kuò)增目的基因 sgh。PCR 反應(yīng)體系:5μ 1 IOXKODBuffer ；2 μ 1 MgCl2 (25mM) ；5 μ 1 dNTP Mixture (2. 5mM)； 1 μ 1 Upstream primer(25pmol) ； 1 μ 1 Downstream primer(25pmol) ； 1 μ 1 Template ； 1μ 1 Taq DNAPolymerase (IU/μ 1)；加無菌水至終體積為50 μ 1。sgh基因的PCR反應(yīng)條件為94°C 30s, 56°C 30s, 68°C Imin (30個循環(huán))，68°C IOmin0將上述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化。具體步驟如下先將PCR產(chǎn)物在(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下要回收的目的條帶。用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，具體操作如下將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱其重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液(凝膠重為0. Ig,其體積可視為100 μ 1，以此類推)。 55°C水浴10分鐘，其間每3分鐘溫和上下翻轉(zhuǎn)Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取650 μ 1加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫O0-25°C以下相同) 放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600 μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置5_10分鐘，徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。 向吸附膜中間位置懸空滴加50 μ 1洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。實施例3 亞克隆構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Nhel，XhoI雙酶切pcDNA3. 1㈠和純化的sgh PCR產(chǎn)物。酶切體系如下依次加入30 μ 1 pcDNA3. 1(-)質(zhì)?；蚣兓腜CR產(chǎn)物；4 μ 1 10Xbuffer2 ；1μ 1 NheI ；1μ 1 XhoI ；2μ 1 ddH20。酶切反應(yīng)條件為37°C，酶切時間3_4個小時。酶切產(chǎn)物經(jīng) 1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收開環(huán)pcDNA3. 1(_)和sgh PCR酶切片段。將sgh PCR酶切片段與開環(huán)pcDNA3. 1(_)連接。連接體系如下依次加入2 μ 1開環(huán)pcDNA3.1(_) ；6μ 1 sgh酶切片段；1 μ IlOXLigation Buffer ； 1 μ 1 Τ4 DNA Ligase。連接反應(yīng)體系16°C水浴連接14-16小時，貯于-4°C備用。實施例4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞其步驟是(1)用接種環(huán)挑取固體LB平板上新活化的大腸桿菌JM109單菌落，接種到20ml液體LB培養(yǎng)基(將Ig蛋白胨、0. 5g酵母粉、Ig NaCl溶解在75mlddH20中，調(diào)整pH值至7. 0， 最后加ddH20定容至IOOml，分裝于五個三角瓶里，115磅滅菌處理20min后備用)中，37°C， 300rpm搖床活化過夜。(2)無菌條件下取60 μ 1上述活化的大腸桿菌于新鮮的20ml液體LB培養(yǎng)基中， 370C，250rpm搖床培養(yǎng)3小時左右至OD6tltl值為0. 4-0. 6。(下述所有步驟均需無菌操作)(3)無菌條件下取1. 5ml上述菌液于無菌Eppendorf管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0°c。4000rpm，4°C離心10分鐘，用移液槍吸干上清。
(4)加入300 μ 1冰預(yù)冷的0. IM CaCl2溶液重懸菌體沉淀，冰浴30分鐘，4000rpm， 4°C離心10分鐘，用移液槍吸干上清。(5)加入100 μ 1冰預(yù)冷的0. IM CaCl2溶液重懸沉淀，即得感受態(tài)細(xì)胞，置于4°C 保存，24小時內(nèi)使用為宜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞在無菌條件下取過夜連接反應(yīng)液10 μ 1，加入到100 μ 1大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。(上述步驟均需無菌操作)42 °C水浴中熱激90秒，迅速移至冰上靜置，冰浴2-3分鐘。加入800 μ 1液體LB培養(yǎng)基，37°C，150rpm輕搖，溫育45分鐘。4000rpm離心10分鐘，吸取800 μ 1上清棄去，將剩余菌液用移液槍輕輕混勻。將上述菌液用無菌三角涂布棒均勻涂布在終濃度為100 μ g/ml Amp的LB平板上，正向放置0. 5 小時，直至液體被全部吸收，倒置平板于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16小時。用接種環(huán)挑取LB 平板上單菌落于300 μ 1新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度100 μ g/ml氨芐青霉素)中，37°C， 300rpm搖床培養(yǎng)3小時，以此菌液為模板，上游引物P6、下游引物P4進(jìn)行PCR初步鑒定，并送上海生工有限公司測序。由上述方法可以制備得到JM109/pcDNA3. 1 (-)-signal-GH的菌株。實施例5 重組質(zhì)粒pcDNA3. 1㈠一signal-GH轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌。減毒鼠傷寒沙門氏菌感受態(tài)的制備(1)用接種環(huán)在LB平板上挑取活化的減毒鼠傷寒沙門氏菌株 Salmonellatyphimurium W0420單菌落,將其接種到5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C，300rpm搖床過夜培養(yǎng)。(2)將培養(yǎng)過夜菌液的以的比例接種到新鮮20mlLB中以300rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)。 待菌液培養(yǎng)至0D600約為0. 6時，取1. 5ml上述菌液于滅菌的Eppendorf小管中，于4°C、 4000rpm離心lOmin，去上清。(3)加入無菌水重懸菌體，4°C、4000rpm離心lOmin，去上清。(4)重復(fù)(3) 2次后用100 μ 1冰冷的無菌水重懸菌體。(5)制備的感受態(tài)可暫時保存于4°C立即使用。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌(1)將5 μ 1 pcDNA3. 1 (-) —signal-GH質(zhì)粒加入到制備好的100 μ 1減毒鼠傷寒沙門氏菌&ilmonella typhimurium W0420感受態(tài)細(xì)胞中混勻。(2)將混合物加入直徑為2mm的電轉(zhuǎn)化杯底，于1. 5kV，25 μ F的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)。(3)電轉(zhuǎn)完畢立即加入Iml新鮮LB培養(yǎng)基，于37°C、150rpm溫育45Min。(4)將取100 μ 1菌液均勻涂布于終濃度100 μ g/ml氨芐青霉素的固體LB平板上， 37°C倒置培養(yǎng)過夜。減毒鼠傷寒沙門氏菌陽性重組子的鑒定從平板上挑取單個菌落接種于新鮮液體LB(Amp+)中，37°C、300rpm培養(yǎng)3_4h后， 分別用gh基因特異性引物和沙門氏菌fIiC基因特異性引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定后重組子命名為 Salmonella typhimuriumff0420/pcDNA3. 1 (-)—signal-GH。實施例6 基因工程口服DNA疫苗的制備及藥效試驗。
將重組菌Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1(-)-signal-GH 和 Salmonellatyphimurium W0420/pcDNA3. 1-于 LB(Amp+)中培養(yǎng) 16h 后 4000rpm、30min 離心收集菌體，菌液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后于平板上計數(shù)。在37°C水浴鍋中將菌體重懸于含0. 5% (質(zhì)量體積比)瓊脂的PBS中?？耸霄椢r商業(yè)化飼料與菌懸液以5 1 (g/ml)比例混合包被飼料，保存于4°C備用。將克氏螯蝦按實驗要求分組，8只/盒。飼料以0.4g/只的日劑量投喂克氏螯蝦(相當(dāng)于IO9CFU/只)，每天投喂一次，共喂食10天。喂食10天后開始每天以0. 4g/只的日劑量投喂商業(yè)化飼料20天，在這期間記錄每組幼蝦的生長情況和體重變化。各實驗組每頭克氏螯蝦幼蝦經(jīng)免疫后平均體重統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.一種基因工程DNA疫苗，其序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.—種基因工程DNA疫苗，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
3.一種基因工程DNA疫苗，其特征在于該疫苗為重組基因工程菌株 Salmonellatyphimurium W0420/pcDNA3. 1(-)—signal-GH, CCTCC NO :M2011233。
4.一種用于權(quán)利要求3所述的基因工程DNA疫苗的制備方法，包括下列步驟A、鯉魚生長激素成熟肽基因的制備用鯉魚腦垂體，按照RNA提取試劑盒的方法提取其總mRNA后，通過RT-PCR得到總 cDNA，根據(jù)GenBank鯉魚生長激素的cDNA序列，設(shè)計并合成引物，以得到的總cDNA為模板， PCR擴(kuò)增得到鯉魚生長激素GH基因，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到PGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含gh基因的大腸桿菌，命名為 pGEM-T-GH ；B、融合基因sgh的制備PCR擴(kuò)增sgh基因通過PCR重疊延伸技術(shù)分3次PCR合成sgh，以pGEM-T-GH質(zhì)粒為模板，上游引物 Pl :5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物 P4 5 GCGCTC GAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3 劃線處為 XhoI 位點，退火溫度為 56°C，PCR 擴(kuò)增目的片段，電泳并作回收；以上一步回收產(chǎn)物為模板，以上游引物P2 :5_GTCTGCCTGGTCTTCT TGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_,下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATC T3_，退火溫度56°C做PCR，電泳并作回收；以上一步回收產(chǎn)物為模板，以上游引物P3 :5_GCG GCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3，下游引物 P4 5 GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGT GCCAGAGTA3_,退火溫度56°C做PCR，PCR擴(kuò)增目的基因sgh，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含sgh基因的大腸桿菌，為pGEM-T-SGH ；C、融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NheI，XhoI雙酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3. 1 (_)，膠回收開環(huán)質(zhì)粒 pcDNA3. 1 (-)和SGH基因的片段，4°C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)JM109中，所得到的陽性克隆子為 JM109/pcDNA3. 1 (-) -signal-GH ；D、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌將質(zhì)粒pcDNA3. l(-)—Signal-GH(5l·! 1)轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌 Salmonellatyphimurium W0420感受態(tài)細(xì)胞中，PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得口服DNA疫苗。
5.權(quán)利要求3所述的一種口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯蝦幼蝦養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因工程口服DNA疫苗及制備方法和應(yīng)用，其步驟A、鯉魚生長激素成熟肽基因的制備用鯉魚腦垂體，提取其總mRNA后，通過RT-PCR得到總cDNA，設(shè)計并合成引物；B、融合基因sgh的制備；C、融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NheI,　XhoI雙酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3.1(-)，膠回收開環(huán)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)和SGH基因的片段，連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)JM109中，得到陽性克隆子為JM109/pcDNA3.1(-)--signal-GH；D、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌SalmonellatyphimuriumW0420感受態(tài)細(xì)胞中，得菌株SalmonellatyphimuriumW0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，為口服DNA疫苗。易于工業(yè)化生產(chǎn)，操作簡單，成本低，安全性好。該疫苗具有轉(zhuǎn)運(yùn)促生長的DNA疫苗到克氏螯蝦體內(nèi)的能力，該DNA疫苗能夠明顯促進(jìn)克氏螯蝦幼蝦生長；具有水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK102389575SQ20111036709
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者孟小林, 徐進(jìn)平, 王健 申請人:武漢凱肽來生物科技有限公司