專利名稱：一株鏈霉菌及其在生產(chǎn)棘霉素中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株鏈霉菌及其在生產(chǎn)棘霉素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是一種非常古老的疾病，伴隨著整個(gè)人類發(fā)展的歷史，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命。棘霉素(Echinomycin)自1998年以來就一直作為一種抗腫瘤藥物在進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)。棘霉素是一個(gè)DNA雙插入試劑，能夠與腫瘤細(xì)胞的DNA發(fā)生相互作用從而抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。棘霉素還涉及對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。除了抗腫瘤作用外，棘霉素對許多病原微生物也具有顯著的抑制作用，如結(jié)核分枝桿菌、炭疽桿菌等。除了長期被作為一種抗腫瘤抗生素進(jìn)行研究外，近年來，棘霉素的抗微生物活性和發(fā)色團(tuán)的熒光性質(zhì)也逐漸引起人們的關(guān)注，利用其喹喔啉環(huán)發(fā)色團(tuán)在插入雙鏈DNA后能引起電信號發(fā)生變化的性質(zhì)，可用來研制電化學(xué)DNA傳感器，用于鑒別單鏈和雙鏈DNA。另外，棘霉素還有望作為一種高靈敏度和專一性的DNA熒光探針，用于與核酸分子成像有關(guān)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株鏈霉菌及其在生產(chǎn)棘霉素中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )LS462，已于2011年11月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. M53。本發(fā)明還保護(hù)所述鏈霉菌LS462在生產(chǎn)棘霉素中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種種子培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基將20_30g可溶性淀粉、0. 2-0. 6gL-天冬酰胺、0. 5-1. Og ΚΝ03、0· 2-0. 6g K2HPO4 · H20,0. 2-0. 6gNaCl 和 0.2-1. Og MgSO4 ·7Η20用水定容至1L。所述種子培養(yǎng)基的pH可為7. 0_7. 5。所述種子培養(yǎng)基具體可通過如下方法制備得到將25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KN03、0.4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl 和 0. 6g MgSO4 · 7H20 用水定容至 IL0本發(fā)明還保護(hù)一種發(fā)酵培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基將5_15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3_(N_嗎啉基)丙磺酸用水定容至1L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH可為7. 0-7. 5。所述發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基具體可通過如下方法制備得到 將IOg葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g 3-(N-嗎啉基)丙磺酸用水定容至1L。本發(fā)明還保護(hù)一種制備棘霉素的方法，是發(fā)酵所述鏈霉菌LS462，得到棘霉素。所述發(fā)酵的條件具體可為25-30°C、140-200rpm、6-15天。所述發(fā)酵的條件具體可為^°C、 180rpm、10 天。所述方法具體可包括如下步驟將所述鏈霉菌LS462的種子液接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵并收獲發(fā)酵液。
所述方法中，可將5ml所述種子液接種至IOOml所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述種子液具體可通過如下方法制備將所述鏈霉菌LS462接種于所述種子培養(yǎng)基中，25-30°C (如 280C )、140-200rpm(如180rpm)培養(yǎng)2-6天(如96小時(shí))，得到種子液。所述方法還可包括如下步驟(1)將所述發(fā)酵液離心(離心參數(shù)具體可為4°C、8000轉(zhuǎn)/min、15min)，分別收集
上清液和沉淀；(2)將步驟(1)獲得的沉淀用丙酮浸提(可室溫靜置10小時(shí))，離心(離心參數(shù)具體可為4°C、8000轉(zhuǎn)/min、15min)并收集上清液；(3)將步驟(1)的上清液和步驟( 的上清液合并，即為棘霉素粗提液(菌株粗提液)；(4)將所述棘霉素粗提液上樣于HP-20大孔吸附樹脂，依次用體積百分比為40% 和60%的丙酮水溶液洗脫(各一升)，收集用60%丙酮水溶液洗脫得到的過柱后洗脫液；(5)將步驟(4)收集的過柱后洗脫液蒸干并用丙酮重新溶解，過濾后進(jìn)行反相 HPLC ；反相HPLC參數(shù)采用 Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9. 4X 250mm)；流動相為體積百分比為70%的甲醇水溶液，流速為2. Oml/min ；收集保留時(shí)間為26. 3-27. 2min的過柱后洗脫液，蒸干后得到棘霉素。本發(fā)明提供的鏈霉菌LS462在沒有經(jīng)過任何培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的前提下，其棘霉素的產(chǎn)量可達(dá)61. 8aiig/l，高于目前已見報(bào)道的棘霉素生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)棘霉素的方法是發(fā)酵鏈霉菌LS462，發(fā)酵穩(wěn)定、化合物分離工藝簡便、產(chǎn)率高。本發(fā)明提供的菌株具有很好的工業(yè)化潛力和前景。


圖1為菌株LS462在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天的照片。圖2為菌株LS462在掃描電鏡(Quanta 200) 10000X下觀察的照片。圖3為菌株粗提液的HPLC分析圖。圖4為活性組分的ESI-MS質(zhì)譜圖。圖5為活性組份的紫外光譜圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。可溶性淀粉購自北京化工廠，產(chǎn)品目錄號為K0800034。葡萄糖購自北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司(HG)。稷粉購自農(nóng)貿(mào)市場。棉籽蛋白粉(藥媒)購自北京中棉紫光生物科技有限公司。MOPS即3-(N-嗎啉基)丙磺酸，購自北京江晨生物。HP-20大孔吸附樹脂 (三菱)購自北京慧德易科技有限公司。Agilent Zorbax XDB C_8column :購自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZORBAX XDB C-18 column 購自北京慧德易科技有限公司。實(shí)施例1、鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )LS462的分離和鑒定一、鏈霉菌LS462的分離
菌株分離培養(yǎng)基的組成如下(以下均為質(zhì)量百分比)淀粉2%、L-天冬素 0. 05%,KNO3 0.1%,K2HPO4 · H2O 0. 05%,NaCl 0. 05%,MgSO4 · 7H20 0. 05%,CaCO3 0.1%, 瓊月旨1.8%和吐0 ；pH值為7.5。取1. Og 土樣(采自中國江西瑤里原始森林的泥土樣品)，放入裝有9. Oml無菌水的50ml離心管中，180rpm搖2h，于20KHz、100W功率超聲2min ；取1. Oml懸濁液，放入裝有 9. Oml無菌水的50ml離心管中，混勻；取1. Oml懸濁液，放入裝有9. Oml無菌水的50ml離心管中，混勻；系列稀釋10_3和10_4 ；蓋緊管蓋，于100°C保溫lh，取0. 2ml涂板。獲得了一株菌，將其命名為菌株LS462。菌株LS462的保藏方法于25%甘油凍存管_80°C保藏。二、鏈霉菌LS462的鑒定菌株LS462在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天的照片見圖1。菌株LS462在掃描電鏡 (Quanta 200) 10000X下觀察的照片見圖2。在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天產(chǎn)生卵圓形孢子， 表面刺狀，大小均勻(0. 5-0. 7μπιΧ1. 1-1.3μπι)。氣生菌絲呈棕色，表面光滑，基內(nèi)菌絲呈棕色，有棕色色素產(chǎn)生。根據(jù)菌落形態(tài)特征，將菌株LS462鑒定為鏈霉菌。鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )LS462已于2011年11月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. M53。實(shí)施例2、應(yīng)用鏈霉菌LS462生產(chǎn)棘霉素斜面培養(yǎng)基的制備方法如下(pH7. 0)將2 可溶性淀粉、0. 4g L-天冬酰胺、0. Sg ΚΝ03、0· 4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl,0. 6g MgS04 · 7H20 和 18g 瓊脂溶于水并用水定容至 IL0種子培養(yǎng)基的制備方法如下(pH7. 5)將2 可溶性淀粉、0. 4g L-天冬酰胺、0. Sg ΚΝ03、0· 4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl 和 0. 6g MgSO4 · 7H20 溶于水并用水定容至 IL0發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下(pH7. 0)將IOg葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和 20g MOPS溶于水并用水定容至1L。一、菌株發(fā)酵1、種子培養(yǎng)(1)將鏈霉菌LS462的孢子接種于斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)8天(到氣生菌絲豐滿)， 即得到斜面菌種。(2)在500ml玻璃瓶中裝入IOOml種子培養(yǎng)基。(3)從步驟(1)的斜面挖塊接種至步驟O)的培養(yǎng)基，280C、ISOrpm培養(yǎng)96小時(shí)， 得到種子液。2、發(fā)酵培養(yǎng)(1)在500ml的三角瓶中裝IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基。(2)在步驟(1)的培養(yǎng)基中接種5ml步驟1得到的種子液，、ISOrpm培養(yǎng)10 天，收獲發(fā)酵液(發(fā)酵液為容器內(nèi)的所有物質(zhì))。二、有效成分的分離純化1、將1升步驟一得到的發(fā)酵液4°C條件下離心15min(8000轉(zhuǎn)/min)，分別收集上清液和沉淀(菌體)。
2、將步驟1獲得的菌體用350mL丙酮室溫條件下浸泡過夜(約10小時(shí))，4°C條件下離心15min (8000轉(zhuǎn)/min)，收集上清液。3、將步驟1的上清液和步驟2的上清液合并，即為棘霉素粗提液(菌株粗提液)。4、將50ml棘霉素粗提液上樣于HP-20大孔吸附樹脂，用100%丙酮洗脫，濃縮洗脫液，并進(jìn)行HPLC分析。HPLC 參數(shù)Agilent Zorbax XDB C_8column(5 μ m，4. 6X 150mm)；體積百分比為 70%的甲醇水溶液為流動相，流速為1. Oml/min ；檢測波長為2Mnm。HPLC圖譜見圖3。主要活性成分的保留時(shí)間約為7. 32min。5、將步驟3得到的菌株粗提液(約1300ml)上樣于300ml HP-20大孔吸附樹脂， 先用800ml水洗脫，然后依次用體積百分比為40%、60%和80%的丙酮水溶液(各1升) 洗脫，收集用60%丙酮水溶液洗脫得到的過柱后洗脫液(約1升)。6、將步驟5收集的過柱后洗脫液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去丙酮并蒸干，用5mL丙酮重新溶解，過濾后進(jìn)行反相HPLC。反相HPLC參數(shù)Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9. 4X 250mm)；體積百分比為70%的甲醇水溶液為流動相，流速為2. Oml/min ；檢測波長為2Mnm。收集保留時(shí)間為26. 3-27. 2min的過柱后洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到活性組分(每升步驟一得到的發(fā)酵液中含有61. 82mg活性組分)。三、有效成分的鑒定1、外觀白色粉末。2、溶解性易溶于氯仿、DMS0,微溶于丙酮、甲醇，不溶于水。3、質(zhì)譜ESI-MS質(zhì)譜見圖4，檢測其分子離子峰[M+H]+為1101. 3，_a]+為1123. 3。與文獻(xiàn)報(bào)道棘霉素的結(jié)果一致。4、紫外光譜紫外光譜測試儀器為Mariner System 5304 instrument。
活性組份的紫外光譜圖見圖5，在204nm、M3. Onm和323nm處有最大吸收峰。與文獻(xiàn)報(bào)道棘霉素紫外特征一致。5.核磁圖譜碳信號歸屬核磁圖譜測試儀器為Varian Inova 600MHz，所用溶劑為DMS0_d6。活性組分碳々 號歸屬如表1所示。與文獻(xiàn)報(bào)道一致。表1活性組份的碳譜核磁信號歸屬
‘、.-
權(quán)利要求
1.鏈霉菌(Sti^ptomycessp.) LS462，它的保藏編號為 CGMCC No. 5453。
2.權(quán)利要求1所述鏈霉菌LS462在生產(chǎn)棘霉素中的應(yīng)用。
3.用于培養(yǎng)權(quán)利要求1所述鏈霉菌LS462的培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基將 20-30g 可溶性淀粉、0. 2-0. 6gL-天冬酰胺、0. 5-1. Og ΚΝ03、0· 2-0. 6gK2HP04 · H2O, 0. 2-0. 6gNaCl 和 0. 2-1. Og MgSO4 · 7H20 用水定容至 1L。
4.用于培養(yǎng)權(quán)利要求1所述鏈霉菌LS462的培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基將5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3_(N_嗎啉基)丙磺酸用水定容至1L。
5.一種制備棘霉素的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1所述鏈霉菌LS462，得到棘霉素。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的條件為25-30°C、140-200rpm、 6-15 天。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟將權(quán)利要求1 所述鏈霉菌LS462的種子液接種至權(quán)利要求4所述培養(yǎng)基中發(fā)酵并收獲發(fā)酵液。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述種子液的制備方法如下將權(quán)利要求1 所述鏈霉菌LS462接種于權(quán)利要求3所述培養(yǎng)基中，25-300C、140-200rpm培養(yǎng)2_6天，得到種子液。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟(1)將所述發(fā)酵液離心，分別收集上清液和沉淀；(2)將步驟(1)獲得的沉淀用丙酮浸提，離心并收集上清液；(3)將步驟(1)的上清液和步驟O)的上清液合并，即為棘霉素粗提液；(4)將所述棘霉素粗提液上樣于HP-20大孔吸附樹脂，依次用體積百分比為40%和 60%的丙酮水溶液洗脫，收集用60%丙酮水溶液洗脫得到的過柱后洗脫液；(5)將步驟(4)收集的過柱后洗脫液蒸干并用丙酮重新溶解，過濾后進(jìn)行反相HPLC；反相HPLC參數(shù)采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column ；流動相為體積百分比為70%的甲醇水溶液，流速為2. Oml/min ；收集保留時(shí)間為26. 3-27. 2min的過柱后洗脫液，得到棘霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株鏈霉菌及其在生產(chǎn)棘霉素中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株為鏈霉菌(Streptomyces sp.)LS462，它的保藏編號為CGMCC No.5453。本發(fā)明提供的鏈霉菌LS462在沒有經(jīng)過任何培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的前提下，其棘霉素的產(chǎn)量可達(dá)61.82mg/l，高于目前已見報(bào)道的棘霉素生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)棘霉素的方法是發(fā)酵鏈霉菌LS462，發(fā)酵穩(wěn)定、化合物分離工藝簡便、產(chǎn)率高。本發(fā)明提供的菌株具有很好的工業(yè)化潛力和前景。
文檔編號C12P21/02GK102391968SQ20111036662
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者代煥琴, 余珂, 傅成章, 劉雪婷, 宋福行, 張立新, 楊娜, 王倩, 謝峰, 郭徽, 陳彩霞 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所