專利名稱：基于環介導等溫擴增技術的鴨疫里默氏桿菌的核酸檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種鴨疫里默氏桿菌的環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)的核酸檢測方法。
背景技術：
鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和其他禽類的接觸性傳染病。該病主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、 干酪樣輸卵管炎等，發病率高，病死率也高，耐過鴨多成僵鴨，生長遲緩，給養殖業造成極大的經濟損失。自從1904年Reiemer首次報道該病到現在，該病呈世界流行，發病率和死亡率一般為10-30%，但部分鴨場達95%以上。該病對養殖業的危害除直接引起動物發病、死亡外，感染耐過鴨因飼料轉化率降低，生長發育遲緩而帶來的間接經濟損失也十分嚴重，以及導致抗菌藥物的大量使用而引起食品安全。傳統鑒定鴨疫里默氏桿菌方法主要是通過細菌分離、血清型鑒定、生化鑒定等經典方法，但經典方法操作繁瑣、耗時長、檢出率低等，對該病的準確檢測和及時治療十分不利。針對鴨疫里默氏桿菌其他檢測技術如ELLSA、免疫組化及免疫熒光等技術也有報道， 但也不同程度地存在某些缺點。至上世紀80年代末聚合酶鏈反應技術誕生，極大的推動了分子生物學技術的發展，并促進了病原微生物核酸水平檢測技術的長足發展，成為最重要的手段之一。而就鴨疫里默氏桿菌的檢測而言，先后出現了重復序列PCR基因指紋 ^ff (Repetitive element PCR genomic finger printing，REP-PCR)、隨機擴增多態性 DNA(Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD)以及實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real time fluorescent quantified PCR)等一系列的核酸擴增檢測技術。這些方法對鴨疫里默氏桿菌檢測，較經典的鑒定方法而言更加的敏感及快速。其中熒光定量PCR技術，不僅僅具備PCR技術中的Taq酶對靶基因進行高效的擴增，而且探針的加入大幅度的提高了其特異性與敏感性，充分體現了分子檢測技術的優越性。但是由于熒光定量PCR技術需要昂貴的儀器以及繁瑣的操作過程，使得該技術在基層實驗室以及檢疫機構推廣使用受到了局限。21世紀初，Notomi T等幾位日本學者開發了一種新型的恒溫擴增技術，即環介導等溫擴增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。其原理為采用能夠特異性識別靶序列上8個區域設計的6個特異引物，利用一種具有鏈置換性Bst-DNA聚合酶在恒溫條件(60°C -65°C )下作用幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。其擴增效率可達到 IO9-IOltl個拷貝數的數量級，并且可以通過擴增副產物焦凝酸鎂沉淀產生的濁度或者顯色反應判斷反應發生與否。LAM技術與PCR技術相比具有相同的靈敏度，而且LAMP省去復雜的溫度變化、長時間的溫度循環、繁瑣的電泳檢測等。LAMP技術使得整個檢測過程在恒溫水浴鍋中即可完成，大幅降低了儀器成本，并且簡便，適合于基層醫療防疫、檢驗檢疫機構使用，可用于大量的樣本同時檢測。

發明內容
本發明提供一種基于環介導等溫擴增技術的鴨疫里默氏桿菌的檢測方法。一種基于環介導等溫擴增技術的鴨疫里默氏桿菌的核酸檢測方法，通過使用特異性引物，利用環介導等溫擴增技術體系擴增靶基因的特定區域；所述特異性引物為
權利要求
1. 一種基于環介導等溫擴增技術的鴨疫里默氏桿菌的核酸檢測方法，其特征在于，通過使用特異性引物，利用環介導等溫擴增技術體系擴增靶基因的特定區域；所述特異性引物為引物類別序列組成F3外引物5’ -AGAGCGAGAAGAAAAAACCT-3，B3外引物5' -CTCCCATAAGCATAGAGAAGA-3‘FIP內引物5 ‘ -GGTTCATTTCCCCAAGACCTTTATA-TAGAAATGTCTGCCGATGG-3‘BIP內引物5 ‘ -CAGAACAACTTTGGGAAACTACACT-CTATCTGCTTCACCTGCA-3LAMP檢測的反應體系組成如下2xU-LAMP反應混合液OxU-LAMP反應混合液是購買的試劑盒，其組成為40mM Tris-HCKpH 8. 8)、20mM KCl、20mM(NH4)2S04、IOmM MgSO4、0· 2 % Triton Χ_100、2· 4mM dNTPsU. 6M 甜菜堿；)IOul ；IOx引物混合液Iul，其組成為引物F3為2uM，引物B3為2uM，引物BIP為12uM，引物 FIP 為 12uM ；模板DNAlul、Bst聚合酶0. 75ul、補水至20ul ； LAMP 反應條件:63°C 60min — 80°C 5min — _20°C保存。檢測過程同時設置陰性對照和陽性對照，所述的陽性對照為含有鴨疫里默氏桿菌gyrB 目的基因的DNA(鴨疫里默氏桿菌基因組DNA或含鴨疫里默氏桿菌gyrB基因的重組質粒 DNA)，所述陰性對照為不同于靶基因的DNA，并使用電泳分析或Sybrgreen I熒光染料紫外燈下顯色同時檢測陰陽對照擴增產物。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，針對鴨疫里默氏桿菌中的Genbank登錄號為CP002346. 1的gyrB基因設計環介導等溫擴增特異性引物。
全文摘要
本發明公開了一種基于環介導等溫擴增技術的鴨疫里默氏桿菌的核酸檢測方法。所述方法為根據鴨疫里默氏桿菌gyrB基因設計特異性的引物序列，提取待測樣品的DNA為模板，進行LAMP反應；對LAMP結果進行分析，若LAMP擴增結果為陽性，則待測樣品含有鴨疫里默氏桿菌。本發明提供的針對鴨疫里默氏桿菌的檢測方法，具有簡便、快速、特異、靈敏和經濟的優點，結果判斷方法簡便，適合于臨床或者基層實驗室使用，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102417930SQ201110369359
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月21日 優先權日2011年11月21日
發明者朱德康, 汪銘書, 王雪平, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農業大學