專利名稱：大豆食心蟲18srDNA基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，尤其涉及一種大豆食心蟲ISsrDNA基因及其應用。
背景技術：
大豆食心蟲(Leguminivora glycinivorella(Mats. Obraztsov))是我國東北大豆產區發生最嚴重的一種蟲害，主要是幼蟲蛀入豆莢危害豆粒。一般年份蟲食率10% 20 %，重害年份30% 40 %，個別年份超過50 %以上。造成被害豆粒不完整或破粒，降低大豆產量和品質。黑龍江是我國大豆之鄉，大豆種植面積占全國的33. 2 %，占東北的64%， 總產量占全國的37. 3%，在我國大豆生產中起著舉足輕重的作用。但近年來由于氣候變化和“豆麥產區”小麥種植面積逐年減少，重迎茬大豆種植比例逐漸增力卩，致使大豆食心蟲發生加重。據黑龍江省植保站統計2009年黑龍江省大豆食心蟲的發生面積為1720. 5萬畝； 2010年大豆食心蟲的發生面積為1383. 7萬畝。黑龍省每年大豆種植面積都在6000萬畝左右，接近1/3大豆田遭受不同程度的害蟲侵害，不僅使大豆田嚴重減產，而且降低大豆商品質量使大豆優質率只有50% -60%，嚴重影響其在國際市場的競爭力。為了減少害蟲對大豆產量和品質的危害，以黑龍江為例，豆農每年至少使用2次化學殺蟲劑對大豆食心蟲和草地螟進行防治?，F在使用的化學殺蟲劑都是廣譜性殺蟲劑，不僅殺死目標昆蟲，而且殺死有益昆蟲，同時化學殺蟲劑在自然界可以長期存在，在土壤和河流中逐漸積累，破壞土壤和河流的生態環境；化學殺蟲劑還可以通過食物鏈進入人體，誘發致畸、致癌、嚴重損害人體健康。因此各種不必利用化學農藥來防治大豆害蟲的方法日益受到重視。轉蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis，簡稱Bt)抗蟲基因雖為害蟲防治一度帶來了希望，并在抗蟲棉的應用上獲得了舉世矚目的成果。培育抗大豆食心蟲的大豆品種的傳統育種方法雖然有效，但周期長，效率低。所以，現在需要建立一種防治大豆食心蟲的新方法，能夠更精確、更高效的控制大大豆食心蟲，加快我國抗大豆食心蟲育種研究速度。RNA干擾是利用外源導入或轉錄載體在體內轉錄的雙鏈RNA介導受體細胞中的序列特異的同源性mRNA發生降解或翻譯受阻，引發受體細胞產生轉錄后基因沉默，使與此相應的內源靶基因的表達被阻抑，從而得到類似于“基因敲除”的基因阻抑效果。顯微注射法是RNAi研究中最廣泛使用的dsRNA導入方法，該方法在蟋蟀G. bimaculatus、擬谷盜 Tribolium castaneum、家香Bombyx mori、舌甘菜液蛾S. exigua、褐飛風Nilaparvata Iugens 等昆蟲中均取得成功。但顯微注射法dsRNA方法只能用于研究昆蟲基因功能，不能采用該方法在田間對害蟲進行防控。如果利用植物表達與昆蟲生長關鍵基因匹配的dsRNA分子， 當昆蟲取食這類植物后，將這些dsRNA攝入體內，在昆蟲體內發生RNA干擾現象，使關鍵基因的表達被明顯抑制，從而達到控制害蟲的目的。這就是利用RNA干擾技術防治害蟲的基本過程。RNA干擾利用的是基因片段，在轉錄后誘導相應靶基因沉默，與常規轉抗蟲基因相比，RNA干擾介導的昆蟲基因沉默不產生新的蛋白質，具有更高的生物安全性。由于該方法具有高效、特異、安全等特點，被認為是一種非常具有前途的控制害蟲的新方法，能夠更好的防治那些以農作物為食、影響農作物產量的害蟲，是農作物害蟲防御領域的突破。而且， 目前國內外尚無利用RNA干擾防治大豆食心蟲的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種編碼大豆食心蟲18srDNA的基因，其堿基序列如SEQ ID NO 1 所示。本發明的第二個目的在于提供一種含有大豆食心蟲ISsrDNA基因的載體。本發明的第三個目的在于提供大豆食心蟲ISsrDNA基因在提高大豆抗食心蟲能力中的應用。本發明的第四個目的在于提供一種提高大豆抗食心蟲能力的方法，將大豆食心蟲 ISsrDNA基因導入大豆組織或細胞，得到食心蟲抗性提高的大豆，所述大豆食心蟲ISsrDNA 基因的核苷酸序列如如SEQ ID N0:1所示。所述大豆食心蟲18srDNA基因通過含有所述大豆食心蟲18srDNA基因的載體導入植物組織或細胞。本發明的技術路線為1)利用分子生物學方法克隆大豆食心蟲ISsrDNA基因；2)體外合成大豆食心蟲18srDNA基因的dsRNA，利用顯微注射技術將大豆食心蟲 18srDNA基因dsRNA導入到一齡末大豆食心蟲幼蟲體內，結果證明注射18srDNA的dsRNA 能夠引起大豆食心蟲幼蟲體內ISsrDNA基因沉默從而對大豆食心蟲幼蟲的生長發育產生影響，甚至導致大豆食心蟲幼蟲的死亡。本發明克隆了一種大豆食心蟲18srDNA基因，體外合成大豆食心蟲18srDNA基因的dsRNA，利用顯微注射技術將大豆食心蟲18srDNA基因dsRNA導入到一齡末大豆食心蟲幼蟲體內，結果證明注射18srDNA的dsRNA能夠引起大豆食心蟲幼蟲體內18srDNA基因沉默從而對大豆食心蟲幼蟲的生長發育產生影響，甚至導致大豆食心蟲幼蟲的死亡。該基因可以作為靶基因用于構建RNAi表達載體，用于培育高抗大豆食心蟲大豆種質。


圖1大豆食心蟲18srDNA基因的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，M :DL2000DNA分子量標準，1 :18srDNA的PCR產物；圖2根據昆蟲ISSrDNA序列用相鄰連接(NJ)法構建系統發生樹；圖318SrDNA在大豆食心蟲不同發育階段的表達模式；圖418SrDNA在大豆食心蟲不同組織的表達模式；圖518srDNA體外合成的dsRNA電泳檢測結果圖，a) M =DNA分子量標準；1_3 18srDNA 的 dsRNA ；圖6注射不同濃度18srDNAdsRNA對大豆食心蟲幼蟲死亡率的影響；圖7注射不同濃度dsRNA對大豆食心蟲幼蟲18srDNAmRNA表達水平的影響；圖8注射18rDNA dsRNA對大豆食心蟲幼蟲死亡率的影響；圖9注射18rDNAd sRNA對大豆食心蟲幼蟲體重的影響；圖10注射18rDNA dsRNA對大豆食心蟲幼蟲發育的影響；
圖1118SrDNA目的片段的PCR擴增產物；圖12(a)BP反應的PCR鑒定結果，M :DNA標準；1-3BP轉化子PCR擴增產物；4 ddH20 ；圖12(b) LR反應的PCR鑒定結果，M :DNA標準；l_4intronA和引物6PCR擴增產物；圖13RNAi植物表達載體pJawohl8_18SrDNARNAi的構建流程圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明的技術路線做進一步詳細說明。實施例1大豆食心蟲18srDNA基因克隆及序列分析根據文獻報道的6個昆蟲的18srDNA基因的全序列，利用DNAMAN軟件進行分析， 設計了覆蓋了 ISSrDNA的全部序列的2個特異引物18srDNA 引物 1 :5_T (AC) CCTCGT (GT)GATCCTGCCAGT-3‘；
18srDNA 引物 2 :5_CATCCTTC(CT)GCAGGTTCACCT-3‘。以大豆食心蟲基因組為模板進行PCR的擴增，95 V 5min, 57. 1 V 1. Omin, 72°C 2. 0min，30循環，最后72°C延伸IOmin0用引物1和引物2進行PCR反應，從大豆食心蟲基因組模板獲得擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，將產物進行測序，得到全長的大豆食心蟲18SrDNA序列，其堿基序列如SEQ ID NO 1所示，該序列長度為1825bp。同源序列比較發現，該序列與 Cacoecimorpha pronubana(AJ830747)、；Galleria mellonella(AF286298)、；X. vesparum(X77784)、；P. dominulus (X77785)，分別為 95. 1 %、 94. 8%,81. 66%和 80. 94%。采用 MEGA4. O 軟件使用相鄰連接法 NJ(neighbor-joining method)構建系統進化樹，結果表明大豆食心蟲18SrDNA(Leguminivora glycinivorella) 和大賭螟(Galleria mellonella)、荷蘭石竹卷蛾(Cacoecimorpha pronubana)等鱗翅目的親緣關系較近分布在同一分支，與捻翅目X. vesparum和膜翅目馬蜂(P. dominulus)親緣關系較遠則處于不同分支。系統發生樹(圖2)中的各種生物的氨基酸序列來源于GenBank 非冗余的數據庫，左下方標尺為0. 1進化距離單位，樹枝的長度與遺傳距離成比例，由氨基酸的替換計算所得，每個分枝上的數字表示1000次重復性隨機抽樣實驗中支持該分枝的百分比。實施例2大豆食心蟲18srDNA基因的表達模式分析為了確定大豆食心蟲18srDNA基因在大豆食心蟲不同發育時期和大豆食心蟲幼蟲不同組織的表達情況，從7月末8月初大豆田間出現大豆食心蟲成蟲開始，收集卵、幼蟲、 蛹、成蟲四個時期的大豆食心蟲樣品，收集的蟲樣分別放入無Rnase的EP管后立即在液氮中冷凍，放入-80°C的低溫冰箱中保存。每個試驗重復3次。選取大豆食心蟲3-4齡幼蟲進行解剖，剖取的神經節、表皮、唾腺、中腸、卵巢、睪丸和脂肪體7個組織分別放入無Rnase的 EP管后立即在液氮中冷凍，放入-80°C的低溫冰箱中保存。每個試驗重復3次。利用Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取大豆卵、幼蟲、蛹、成蟲四個時期和神經節、表皮、 唾腺、中腸、卵巢、睪丸和脂肪體7個組織的總RNA，利用采用Fermentas公司M-MLV反轉錄酶合成cDNA第一鏈.以cDNA為模板，利用RT-PCR和熒光定量PCR對結果表明18SRDNAmRNA 的表達情況進行檢測。熒光定量PCR按照Τ0Υ0Β0公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-的程序進行。熒光定量PCR反應中所使用的基因及其引物如下
actin-s 5' GGCGACATAGCACAGCTTCTC 3‘actin-a 5' ATCCTCCGTCTGGACTTGGC3‘18S-s :5GACTCAACACGGGAAATCTCACC' 3'18S-a 5' CAGACAAATCGCTCCACCAACT3‘為了確定大豆食心蟲18srDNA基因在大豆食心蟲不同發育時期和大豆食心蟲幼蟲不同組織的表達情況，利用RT-PCR和熒光定量PCR對結果表明18srDNA mRNA的表達情況進行檢測，結果表明ISsrDNAmRNA在各發育階段均表達，包括卵、幼蟲、蛹、成蟲四個時期 (圖3)；成蟲期18srDNAmRNA的表達量最高，4齡幼蟲、蛹、1齡幼蟲的表達量較高，2齡幼蟲和3齡幼蟲幼蟲表達量較低，卵中表達量最低。同時，選取4齡幼蟲進行解剖，取神經節、表皮、唾腺、中腸、卵巢、睪丸和脂肪體7個組織用上述引物檢測，結果發現ISsrDNAmRNA在這7 個組織中均有表達，其中神經節、脂肪體和睪丸的相對表達量較高，其它4個組織相對表達量較低(圖4)。實施例3不同濃度大豆食心蟲18srDNA dsRNA對大豆食心蟲幼蟲死亡率的影響體外合成18srDNA 的 dsRNA將大豆食心蟲18SrDNA序列利用DNAman軟件和大豆的18SrDNA序列進行序列比較，選擇保守性最低的大豆食心蟲區域作為目標片段。根據T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒(Promega，USA)設計如下引物18ST7sense5’ -GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGTAGTTGCATTTGT-3’18S antisese 5'-CCCACCTCGACACTCACT-3‘18ST7antisense5’ -GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCCACCTCGACACTCACT-3’18Ssense 5’ -GCTCGTAGTTGCATTTGT-3，體外合成長度為189bp的18srDNA dsRNA,利用1. 5%的瓊脂糖檢測dsRNA片段的大小。結果顯示，合成的dsRNA與預期的結果一致，如圖5所示。不同濃度18srDNA dsRNA對大豆食心蟲幼蟲死亡率的影響國內外的研究結果表明只有合適濃度的dsRNA才可以引起RNAi效果，因此本發明設計了 5 μ g/ μ L(高濃度)，2. 5 μ g/ μ L(中濃度)，0. 5 μ g/ μ L(低濃度)的dsRNA進行試驗，以期找到一個合適的抑制靶基因表達的濃度。禾_顯微注射技術將相同體積的靶基因3 種濃度dsRNA和生理鹽水分別導入到100條一齡末大豆食心蟲幼蟲體內，試驗設3次重復。 注射后的幼蟲放入溫度^TC,濕度80%，光照18h的人工氣候箱內利用天然飼料豆莢進行飼養，7 后統計不同濃度的大豆食心蟲幼蟲的死亡率，提取注射相應處理組的總RNA，利用熒光定量PCR對靶基因的mRNA表達水平進行檢測。從圖6和圖7可以看出，注射不同濃度18srDNAdsRNA均引起大豆食心蟲幼蟲的死亡，而且死亡率明顯高于對照生理鹽水，表明注射18srDNA dsRNA能夠引起大豆食心蟲幼蟲體內ISsrDNA基因沉默從而對大豆食心蟲幼蟲的生長發育產生影響，甚至導致大豆食心蟲幼蟲的死亡。對不同濃度處理組幼蟲18srDNA mRNA表達水平進行分析表明，中濃度處理組 18srDNAmRNA的表達水顯著低于高濃度和低濃度處理，而幼蟲死亡率顯著高于高濃度和低濃度處理，此因2. 5 μ g/μ L是抑制靶基因表達的最合適的注射濃度。注射18srDNAdsRNA對大豆食心蟲生長發育的影響利用顯微注射方法將2. 5 μ g/ μ L 18srDNAdsRNA和生理鹽水導入二齡大豆食心蟲幼蟲，放入溫度26°C，濕度80%，光照18h的人工氣候箱內利用人工飼料進行飼養，每天觀察大豆幼蟲死亡率、生長發育情況、稱量幼蟲的體重、挑選4頭合適的幼蟲放入-80度冰箱保存用于提取總RNA用于熒光定量PCR檢測ISsrDNA mRNA的表達水平。實驗結果表明 將18sdsRNA導入大豆食心蟲幼蟲體內12h后大豆食心蟲幼蟲的死亡率為29.4%，顯著高于對照生理鹽水8. 5%的死亡率；到第IOd注射18s dsRNA的大豆食心蟲的累計死亡率為 53. 125%，注射生理鹽水幼蟲的死亡率是31. 3%，注射18sdsRNA的大豆食心蟲幼蟲的死亡率顯著高于與對照生理鹽水(圖8)；注射ISsdsRNA存活的大豆食心蟲幼蟲平均體重明顯低于注射生理鹽水大豆食心蟲幼蟲的體重(圖9)；而且注射ISsdsRNA存活的大豆食心蟲幼蟲30%提前化蛹并羽化(圖10)，表明ISsrDNA基因是大豆食心蟲生長發育關鍵基因而且可能在控制大豆食心蟲幼蟲的發育周期中起重要作用。大豆食心蟲每年僅發生1代，以老熟幼蟲在地下結繭越冬。翌年7月中、下旬向土表移動化蛹，7月下旬至8月初化為蛹盛期。8月上、中旬為羽化盛期。雌蛾喜產卵在有毛豆莢上。幼蟲孵化后多從豆莢邊緣合縫處蛀入。幼蟲在豆莢內驅食豆粒直到發育成四齡老熟幼蟲，9月中、下旬脫莢入土越冬。將18srDNA dsRNA注射大豆大豆食心蟲體內后，不僅引起53. 125%大豆食心蟲死亡，存活的大豆食心蟲幼蟲不僅體重低于對照而且有部分提前化蛹并羽化。北方9月末溫度較低，而且田間沒有合適大豆食心蟲成蟲產卵的合適大豆莢，大豆食心蟲成蟲不能產卵變迅速死亡而減少對次年大豆生產的危害，具有重要的生態防治效應，因此大豆食心蟲ISrDNA基因片段可以作為靶基因片段用于構建植物RNAi表達載體。實施例4 18rDNA基因RNAi表達載體構建及大豆遺傳轉化核糖體蛋白18rDNA基因RNAi表達載體構建核糖體蛋白18rDNA基因RNAi表達載體構建流程參見圖14，由于大豆轉化效率較低，而且轉化效率因基因型不同差別很大，所以在進行體外人工合成ISrDNA的dsRNA的同時，利用introgen公司的Gateway技術構建高效植物表達載體構建，在設計擴增用于體外轉錄dsRNA的18SRDNA目的片段引物時，在引物上下游的5，端加上attb特異序列形成 Gateway接頭，引物具體如下18rDNAattBl5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC GCTCGTAGTTGCATTTGT-3，18rDNAattB25' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CCCACCTCGACACTCACT-3‘利用引物18rDNA attBl和引物18SNA attB2以大豆食心蟲cDNA為模板進行 PCR 擴增，條件為95°C 5min,95°C lmin,56°C lmin,72°C 2min,30 循環；最后 72°C 延伸 IOmin0擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物約為198bp，將擴增產物利用DNA 凝膠回收試劑盒獲得帶Gateway接頭的ISSrDNA目的片段(圖11)。利用introgen BP ClonaseTMEnzyme Mix進行中間載體pD0NR201和Gateway接頭的18SDNA的片段的Bp連接反應，構建帶有18SDNA目的基因片段的入門克隆(pD0NR201-18SrDNA)(圖13)，利用 introgen LP Clonase Enzyme Mix 將已構建好的入門克隆(pD0NR201_18SrDNA)載體與植物RNAi表達載體pJawohl8-RNAi進行LP反應，構建了 18SrDNA基因的RNAi植物表達載體PJawohl8-18SrDNA RNAi，PCR鑒定陽性的克隆轉化子(圖12a和12b)，用凍融法將構建的載體轉化農桿菌LBA4404感受態細胞。
大豆種子經氯氣消毒處理，萌發培養7d后，將兩片子葉從子葉節處縱向切開，保留2-3mm下胚軸，用解剖刀切去萌發的頂芽和側芽，用帶有植物表達RNAi載體 PJawohl8-18SrDNA RNAi農桿菌浸染大豆子葉節，經ppT篩選得到TO抗性苗，利用18SrDNA 基因特異性引物和pJawohl8-RNAi載體上intron特異性引物18ssense64 5’ -TATCGTCGGTGAATCGTA-3，intronanti431 5’ -GTCGAGCTGTGGTTGGAGAAG-3’對TO代抗性苗進行PCR分子檢測，獲得PCR陽性4株系(DN50_18SrDNA_l 1， DN50-18SrDNA-26, DN50-18SrDNA-28, DN50-18SrDNA-40)，18SrDNA 植物表達 RNAi 載體整合到大豆中，獲得表達豆食心蟲18SrDNA dsRNA的轉基因株系。實驗例轉基因大豆抗食心蟲性驗證轉基因后代材料抗食心蟲鑒定在東北農業大學轉基因中間試驗基地進行防蟲網室中進行。在防蟲網室內種植穩轉表達豆食心蟲18SRDNAdsRNA T3代轉基因株系 (DN50-18SrDNA-26、N50-18SrDNA-28、N50-18SrDNA-40)和受體材料(東農 50)，每個品種種 15盆，3次重復，隨機排列。于8月上中旬(5 15日)大豆食心蟲成蟲發生盛期到田間捕蛾，進行網室內人工接蟲。接蟲密度20對/m2。每5天接蟲一次，分早、中、晚三期接入，以增大成蟲選擇適宜豆莢產卵的機會。籽粒成熟后，每次重復隨機取樣10株，脫粒后調查蟲食率。大豆抗蟲性分級標準蟲食率彡30%為高感(HS) ；30% >蟲食率彡20%為感蟲(S)； 20%>蟲食率彡13%為中度感蟲(M) ；13%>蟲食率彡9%為抗蟲(R)；蟲食率< 9%為高抗(HR)。數據分析采用SAS8. 02進行。結果如下表1 T2轉基因大豆部分農藝性狀及抗蟲分析
株高分枝節數莢數粒數百粒重蟲食率抗蟲性DN5 0-18 SrDNA-2661.2314.645.683.87.311.54RDN5 0-18 SrDNA-2867.22.81746.2987.211.69RDN5 0-18 SrDNA-4068.82.815.64899.67.915.8MWT60.352.114.449.588.157.521.6M 對T2代轉基因18SRDNA植物表達RNAi載體的農藝性狀進行分析表明(表1)，轉基因材料農藝性狀與受體親本東農50無明顯差異。其中DN50-18SrDNA-26、DN50-18SrDNA-28 的蟲食率與受體親本東農50差異顯著，抗蟲級別提高了 1個數量級。表明在這兩個轉基因材料中，外源的大豆食心蟲18SrDNA基因的dsRNA已獲得表達，轉基因材料抗食心蟲的能力顯著提高。本研究培育的抗蟲轉基因材料不僅可以作為親本材料，通過常規育種技術培育抗蟲大豆新品種，同時，也可以直接形成品種并在生產中加以利用。
權利要求
1.一種編碼大豆食心蟲18srDNA的基因，其堿基序列如SEQ ID N0:1所示。
2.含有權利要求1所述大豆食心蟲ISsrDNA基因的載體。
3.權利要求2所述載體為RNAi植物表達載體。
4.權利要求3所述RNAi植物表達載體為pJawohl8-18srDNARNAi。
5.用權利要求2-4任意一項所述含有大豆食心蟲ISsrDNA基因的載體轉化的具有殺蟲能力的植物細胞、組織或植株。
6.權利要求1所述大豆食心蟲ISsrDNA基因在提高大豆抗食心蟲能力中的應用。
7.權利要求2所述含有大豆食心蟲ISsrDNA基因的載體在在提高大豆抗食心蟲能力中的應用。
8.一種提高大豆抗食心蟲能力的方法，將大豆食心蟲ISsrDNA基因導入大豆組織或細胞，得到食心蟲抗性提高的大豆，所述大豆食心蟲ISsrDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述大豆食心蟲ISsrDNA基因通過含有所述大豆食心蟲ISsrDNA基因的載體導入植物組織或細胞。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程領域，提供了一種大豆食心蟲18srDNA基因，其堿基序列如SEQ ID NO1所示。體外合成大豆食心蟲18srDNA基因的dsRNA，利用顯微注射技術將大豆食心蟲18srDNA基因dsRNA導入到一齡末大豆食心蟲幼蟲體內，結果證明注射18srDNA的dsRNA能夠引起大豆食心蟲幼蟲體內18srDNA基因沉默從而對大豆食心蟲幼蟲的生長發育產生影響，甚至導致大豆食心蟲幼蟲的死亡。該基因可以作為靶基因用于構建RNAi表達載體，用于培育高抗大豆食心蟲大豆種質。
文檔編號C12N5/10GK102492688SQ20111037264
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月22日 優先權日2011年11月22日
發明者孟凡立, 李文濱, 王志坤, 韓英鵬 申請人:東北農業大學