專利名稱：一種基因消除pcr的方法
技術領域：
本發明屬分子生物學領域，涉及一種基因消除PCR的方法，具體涉及一種通過PCR 的方法將基因群體中的非目標基因消除從而達到分離目標基因的目的，主要應用于生物學，醫學，農學，畜牧獸醫學，環境科學，食品科學等與分子生物學相關的基因消除和基因分離技術領域。
背景技術：
PCR,聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是 1985 年由美國 PE-Cetus公司的科學家Kary Banks Mulis發明的一種可在體外快速擴增特定基因或DNA 序列的技術。這項新技術是根據生物體內DNA序列能進行快速復制的某些特點，實現在體外對某些特定DNA序列進行快速擴增，可在短時間內在試管中獲得數百萬個特異DNA序列拷貝。PCR技術的原理是DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3’-0H末端，并以此為起始點，沿模板5’ -3’方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。PCR反應的基本成分包括模板DNA(待擴增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。PCR 反應中，通過雙鏈DNA的高溫變性(denaturation)、引物與模板的低溫退火(annealing)和適溫延伸(extension)這三步反應反復循環。每一循環中所合成的新鏈，又都可作為下一循環中的模板。PCR合成的特定的DNA序列產量隨著循環次數呈指數增加，從而達到迅速大量擴增的目的。PCR技術操作簡便、結果可靠，并被世界各國廣泛應用于醫學、農業、考古學等各個領域的基因研究和分析，對分子生物學的發展產生了革命性的影響。然而我們使用PCR的目的是用來擴增已知或部分已知基因片段，對于那些我們未知的新基因，由于缺少相關信息，我們就無法有效地對其擴增。
抑制性消減雜交技術(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)是 Diatchenko等于1996年依據消減雜交和抑制PCR發展起來的一種分離差異表達基因的新方法。該方法主要基于抑制PCR,并結合標準化(normalization)和消減雜交 (subtractive hybridization)技術。所謂抑制PCR就是通過利用含引物序列的雙鏈接頭 (adaptor)充當引物模板，使兩端接上同一接頭的非目的雙鏈片段(具有反向末端重復序列)，在退火時產生“鍋-柄”結構，無法與引物配對，從而選擇性抑制非目的序列的擴增，以達到抑制非目的片段而選擇性擴增目的片段的目的。該方法運用了雜交二級動力學原理， 即高豐度單鏈cDNA在退火時同源雜交速度快于低豐度單鏈cDNA，標準化步驟平衡了目的基因群中cDNA的豐度，從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達到基本一致，即低豐度差異表達的基因不會丟失，而高豐度差異表達的基因又不會被過量分離。消減雜交
5則扣除了目的基因群(tester)與驅趕基因群(driver)間的同源序列。SSH技術的操作流程首先提取2種細胞或組織的mRNA，并反轉錄獲得cDNA，用含有4個堿基的限制性核酸內切酶(RsaI或HaeIII)酶切，產生大小適當的平端cDNA片段，將tester cDNA分為均等的 2份，各自連接接頭，將過量的driver cDNA分別加到2份tester cDNA中，變性后退火雜交，獲得4種雜交產物單鏈tester cDNA、雙鏈tester cDNA、異源雙鏈cDNA和雙鏈driver cDNA。第一次雜交使單鏈tester cDNA均等化并富集差異表達基因，然后合并2份雜交產物，另加上新的變性單鏈drivercDNA，再次退火雜交；第二次雜交中只有第一次雜交后剩余的經均等化和消減的單鏈tester cDNA,它能與driver cDNA—起形成各種雙鏈分子， 并產生新的雙鏈分子，這種分子的2個5’端有2個不同的接頭，使其能在以后的PCR中被有效擴增。2次雜交后，填平黏性末端，利用巢氏PCR原理進行擴增。作為一種快速有效的分離差異表達基因的技術，SSH技術具有高度富集低豐度 cDNA，操作簡便，高效高速等優點。但同時它也存在假陽性高等不可避免的缺點在二次扣除雜交driver-cDNA過量，可掩蓋tester-cDNA中表達有豐度差異的cDNA ;在SSH原理中認為二次雜交后，同時加上相同接頭的片段鏈內退火優于鏈間退火，使得片段兩端的反向重復序列形成類似“鍋柄”的結構而無法擴增，然而在我們的實驗中已經證實“鍋柄”同樣能高效擴增。另外一個例子就是RAPD (random amplified polymorphic DNA)技術,它的原理就是利用單弓I物對模板進行擴增。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種基因消除PCR的方法，利用基因消除引物，含有堿基誤配的和Poly (dA)等特制的模板，耐高溫的限制性內切酶及PCR組合等可消除混合基因群體中的非目標基因。本項發明的技術要點是把非目標基因做成基因消除引物，把含目標基因的混合基因群體酶切加上帶有一個堿基誤配的限制性酶切位點及帶有Poly (dA)的接頭，經過純化作為模板，在PCR反應中，通過基因消除引物與模板退火延伸恢復正確的酶切位點，然后用耐熱的限制性酶酶切從而消除非目標基因的接頭，使其無法得到擴增。以上反應是利用PCR儀做如下循環94°C，30秒；60°C，40秒；75°C，8分鐘，經過12至18個循環，富集目標基因，然后常規PCR進一步擴增目標基因。本項發明中的限制性引物即可以由非目標基因酶切擴增制備，也可以根據非目標基因的序列人工合成短核苷酸序列制備。特定的樣品處理，特定的物種均可以工廠化大量制備相應的標準的基因消除引物供商業化使用。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施一種基因消除PCR的方法，其步驟是(I)基因消除PCR模板的制備a.限制性核酸內切酶ApeK-I和Mse-I消化含目標基因的混合基因群體；b.設計并合成四條寡核苷酸鏈01，02，03，04并制備接頭，與上述⑴中a步驟的限制性酶切片段連接；c. Oligo-dT柱子純化上述(I)中b步驟中加上接頭的片段作基因消除PCR模板；(2)基因消除PCR引物的制備a.限制性核酸內切酶ApeK-I和Mse-I消化不含目標基因的混合基因群體；
b.設計并合成四條寡核苷酸鏈05，06，07，08并制備接頭，與上述⑵中a步驟限制性酶切片段連接；c.根據限制性內切酶位點與接頭序列設計引物05和07對上述(2)中b步驟中加上接頭的片段進行PCR擴增；d.采用乙醇沉淀法對(2)中c步驟中PCR產物進行純化；e.限制性核酸內切酶Mse-I消化⑵中d步驟中純化的PCR產物；f. PCR產物清潔試劑盒純化上述⑵中e步驟中酶切產物作基因消除PCR引物；(3)基因消除PCR循環a.消除非目標基因，富集目標基因，條件為在94°C條件下預熱I分鐘30秒；12 至18個循環。每個循環包括94°C變性30秒，60°C退火40秒，75°C延伸8分鐘。20ul反應體系為:40ng基因消除PCR模板，40ng基因消除PCR引物，6pM PCR引物01，4mM dNTP，4ul 5XPhusion HF Buffer,4U ApeK-1,0. 35UPhusion DNA Ploymerase ；b.目標基因的進一步擴增，條件為在94°C條件下預熱I分鐘30秒；25至35個循環。每個循環包括94°C變性30秒，54°C退火40秒，72°C延伸2分鐘30秒。20ul反應體系為4ul 目標基因富集 PCR 產物，2ul 10XPCR Buffer, 4mM dNTP，8pM PCR 引物 01，8pM PCR引物03，0.5U TaKaRa Taq。經過循環之后目標基因可在瓊脂糖凝膠上檢測出來。所述的步驟3中目標基因富集階段，通過基因消除引物與模板退火延伸恢復正確的酶切位點， 然后用耐熱的限制性酶酶切從而消除非目標基因的接頭，使其無法得到擴增。所述的步驟(I)中限制性核酸內切酶為NEB公司的ApeK-I和Mse-I。所述的限制性核酸內切酶的識別位點如下ApeK-I : 5，-G ▼ CWGC-3，3，-CGWC AG-S，Mse-I :5，-Tf TAA-3’3，-AAT AT-S,▲表示限制性酶從該處酶切所述的步驟(I)中設計的寡核苷酸鏈序列如下01 :5，-TTACCACGACCACCCTATTGCTGCTGC-3’02 :5’ -TAGCAGAAGCAATAGGGTGGTCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA A-3，03 :5’ -ACGAGGTGCGGTCTTGGACTACTT-3’04 :5，-CWGAAGTAGTCCAAGACCGCACCTCGT-3，所述的步驟⑴接頭04中W(W為A和T的簡稱)在合成時各用一半A (腺嘌呤) 和一半T (胸腺嘧啶)。所述步驟(I)中制備接頭的方法按合成報告單上說明將合成的寡核苷酸溶于去尚子水中，在微量尚心管中分別將01和02，03和04按60ul反應體系混合，60ul反應體系分別為15ul 01，15ul 02，24ulddH20，6ul 10XPCR Buffer ；15ul 03，15ul 04，24ul ddH20, 6ul 10XPCR Buffer。在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫(20_25°C，以下相同)。形成的接頭(01/02，03/04)如下
權利要求
1.一種基因消除PCR的方法，其步驟是(1)基因消除PCR模板的制備a.限制性核酸內切酶ApeK-I和Mse-I消化含目標基因的混合基因群體；b.設計并合成四條寡核苷酸鏈01，02，03，04并制備接頭，與上述(I)中a步驟的限制性酶切片段連接；c.Oligo-dT柱子純化上述(I)中b步驟加上接頭的片段作基因消除PCR模板；(2)基因消除PCR引物的制備a.限制性核酸內切酶ApeK-I和Mse-I消化不含目標基因的混合基因群體；b.設計并合成四條寡核苷酸鏈05，06，07，08并制備接頭，與上述(2)中a步驟的限制性酶切片段連接；c.根據限制性內切酶位點與接頭序列設計引物05和07對上述(2)中b步驟加上接頭的片段進行PCR擴增；d.采用乙醇沉淀法對(2)中c步驟PCR產物進行純化；e.限制性核酸內切酶Mse-I消化⑵中d步驟純化的PCR產物；f.PCR產物清潔試劑盒純化上述(2)中e步驟酶切產物作基因消除PCR引物；(3)基因消除PCR循環a.消除非目標基因，富集目標基因，條件為在94°C條件下預熱I分鐘30秒；12至 15個循環，每個循環包括94°C變性30秒，60°C退火40秒，75°C延伸8分鐘，20ul反應體系為40ng基因消除PCR模板，45ng基因消除PCR引物，6pM PCR引物01，4mM dNTP, 4ul 5XPhusion HF Buffer,4U ApeK-1,0. 35UPhusion DNA Ploymerase ；b.目標基因的進一步擴增，條件為在94°C條件下預熱I分鐘30秒；25至30個循環， 每個循環包括94°C變性30秒，54°C退火40秒，72°C延伸2分鐘30秒，20ul反應體系為 4ul 目標基因富集 PCR 產物，2ul 10XPCR Buffer, 4mM dNTP，8pM PCR 引物 01，8pM PCR 引物03，0. 5U TaKaRa Taq，經過循環之后目標基因在瓊脂糖凝膠上檢測出來。
2.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(I)中的限制性核酸內切酶的識別位點如下ApeK-I :5，-G TCWGd3，-CGffC ▲ G-5，Mse-I :5’ -TfTAA-Sj3，-AAT ▲ T-5，ApeK-I為耐高溫的限制性內切酶。
3.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(I)中設計的寡核苷酸鏈序列如下01 :5’ -TTACCACGACCACCCTATTGCTGCTGC-3’02:5， -TAGCAGAAGCAATAGGGTGGTCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，03:5’ -ACGAGGTGCGGTCTTGGACTACTT-3’04:5’ -CWGAAGTAGTCCAAGACCGCACCTCGT-3’02中設計有36個A的Poly (dA)，用于mRNA純化柱的純化。
4.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(I)中制備接頭的方法按合成報告單上說明將合成的寡核苷酸溶于去離子水中，在微量離心管中分別將01和02，03和04按60ul反應體系混合，60ul反應體系為15ul 01，15ul 02，24ul ddH20，6ul 10XPCR Buffer ；15ul 07，15ul 08，24ul ddH20，6ul 10XPCR Buffer，在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成的接頭01/02，03/04如下
5.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(I)中連接酶為T4 DNALigase，50ul反應體系接頭與酶切片段的摩爾數之比約為10 l，5ul 10XT4 Ligase Buffer, lffeiss U T4Ligase,加離子水至 50ul。
6.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(2)中設計的寡核苷酸鏈序列如下
7.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(2)中制備接頭的方法按合成報告單上說明將合成的寡核苷酸溶于去離子水中，在微量離心管中分別將05和06，07和08按60ul反應體系混合，60ul反應體系分別為15ul 05，15ul 06，24ul ddH20，6ul IOXPCR Buffer ；15ul 07，15ul08，24ul ddH20，6ul 10 X PCRBuffer,在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成的接頭05/06，07/08如下 05/06: CGACATTCTG TAGGAAACACTAGGACTTGCTGTAAGACATCCT TTG TGATCCT GAAAT 07/08: CWGGTGACCTATAACAATCGTATCGCAACCCCACTGGATATTG TTAGCATAGCGTTGGG
8.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(2)中連接酶為T4DNALigase，50ul反應體系接頭與酶切片段的摩爾數之比約為10 l，5ul 10XT4 Ligase Buffer, lffeiss U T4Ligase,加去離子蒸懼水至 50ul。
9.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(2)中基因消除引物由非目標基因酶切擴增制備，根據非目標基因的序列人工合成短核苷酸序列制備。
10.根據權利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(3)中目標基因富集階段，通過基因消除引物與模板退火延伸恢復正確的酶切位點，然后用耐熱的限制性酶酶切從而消除非目標基因的接頭，使其無法得到擴增。
全文摘要
本發明公開了一種基因消除PCR的方法，本項發明可以消除混合基因群體中的非目標基因。本項發明的技術要點是把非目標基因做成或人工合成短序列基因消除引物，把含目標基因的混合基因群體酶切加上帶有一個堿基誤配的限制性酶切位點及帶有Poly(dA)的接頭，經過純化作為模板，在PCR反應中，通過基因消除引物與模板退火延伸恢復正確的酶切位點，然后用耐熱的限制性酶酶切從而消除非目標基因的接頭，使其無法得到擴增。以上反應是利用PCR儀做如下循環94℃，30秒；60℃，40秒；75℃，8分鐘，經過12至18個循環，富集目標基因，然后常規PCR進一步擴增目標基因。本發明高效快速，操作簡便，成本低廉，可重復性高，分離效果好且假陽性率低。
文檔編號C12N15/10GK102604932SQ201110382308
公開日2012年7月25日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者呂茹婧, 張婷婷, 桓嬌嬌, 程夢蘭, 董五輩 申請人:華中農業大學