專利名稱：用于檢測人類jak2基因突變的探針、引物及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地涉及JAK2基因驅動突變的檢測試劑盒。
背景技術：
JAK2基因屬于JAK基因家族，編碼JAK —種酪氨酸蛋白激酶，屬于非受體型酪氨酸蛋白激酶。JAK2蛋白激酶與JAKs家族具有相同結構功能區，其結構由4部分組成，分別為 C端激酶區、假激酶區、假SH2區和N端FERM區。JAK2蛋白酪氨酸激酶激活的信號通路是細胞分化的主要細胞因子信號傳導通路之一。受體信號轉導起始于JAK2，通過活化JAK2， 進一步活化其下游的STAT蛋白，活化的STAT將信號直接導入細胞核內，調節基因表達，從而參與包括造血和免疫系統在內的多條信號通路。JAK2可以介導多種細胞因子和生長因子信號轉導，包括紅細胞生成素(ΕΡ0)，白細胞介素(IL-3)、生長因子(GH)、血小板生成素 (TPO)，粒巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，從而調節細胞生長、增值和分化。JAK2激酶的持續活化，會激活JAK介導的下游STAT的持續活化，其持續活化可誘發包括骨髓增殖性腫瘤在內的多種腫瘤。骨髓增殖性腫瘤(Myeloproliferative neoplasms, MPN)是骨髓里一種血細胞惡變導致的腫瘤，主要包括真性紅細胞增多癥(Polycythemia vera, PV)、原發性血小板增生多癥(Essential thrombocythemia，ET)、特發j"生骨髓纖維化(Idiopathic myelofibrosis, IMF)、慢性骨髓細胞性白血病(Chronic myelogenous，CML)。研究發現，骨髓增殖性腫瘤發生通常伴有JAK2基因第1849位突變，導致第617位的纈氨酸(V)變為苯丙氨酸(F)。 JAK2 V617F 突變率在 PV 患者中約有 90% (Lippert，Boissinot et al. Blood 108(6) 1865-1867. 2006)，在 ET 和 IMF 的突變率為 50-60% (Sazawal，Bajaj et al. Indian J Med Res 132 =423-4272010)。JAK2基因V617F突變在MPN的發現，使2008年世界衛生組織(WHO) 修訂MPN的診斷標準，將JAK2V617F的突變作為MPN主要診斷指標之一。因此，檢測JAK2 基因V617F突變的對臨床MPN患者的診斷和篩查有重要意義。針對JAK2基因V617F突變靶點設計藥物已經成為治療ET，PV, IMF等疾病的最重要的靶點之一。目前的臨床藥物TG101348和AZD1480是特異性作用于JAK2激酶開發的一類治療腫瘤的藥物，其可以阻斷腫瘤細胞JAK2下游的STAT3信號通路的傳導，抑制腫瘤的生長和增值，從而達到治療腫瘤目的。因此，檢測JAK2基因是否存在V617F突變，不但可以幫助臨床醫生進行MPN的診斷，而且可以為臨床醫生的科學用藥提供參考依據。目前檢測JAK2基因突變的檢測方法主要為DNA直接測序法。然而，直接測序的靈敏度低，檢測靈敏度只有20-30% ；檢測操作復雜，效率低，通常要1-2天才可出檢測結果。 特別是對于小樣本的病理組織的檢測，直接測序的方法幾乎無法實現其準確檢測，會導致大量的漏檢和假陰性的發生。包括JAK2基因在內的驅動性基因突變屬體細胞稀有突變，具有稀少性、異質性、不穩定性等特點，而且多數驅動性突變的檢測為小樣本組織。因此，直接測序等技術遠不能達到其實際應用的需求，迫切需要開發一種高靈敏度與高特異性的JAK2 基因驅動突變檢測技術，以實現采用高靈敏度檢測方法對JAK2基因驅動性突變的檢測，從而為臨床個體化用藥方案提供科學參考依據。針對上述問題，本發明開發一種高靈敏，快速、操作簡便的JAK2基因突變檢測方法和檢測試劑盒。本檢測方法設計運用一種新型“雙環探針”技術，其環狀部分以及探針內部雙鏈結合區可以和靶標序列結合形成一種熱力學更穩定的復式結構，通過與特異性引物相結合，阻止了非特異性擴增。該檢測方法的靈敏度可達到0. 1%，檢測時間只需90分鐘即可完成，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準確等優點。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于JAK2基因突變檢測的引物和雙環探針，通過對其驅動性突變的檢測實現骨髓增殖性腫瘤的早期篩查和化療預后，其特異引物與雙環探針包括如下序列表IEGFR驅動突變特異性引物和雙環探針核苷酸序列 V617F
SEQ. ID NO
JAK-F: GCAGTGACCTCCAGAGACAGTCTATCTTTGAAGCAATACGTATGA
01
SEQ. ID NO
JAK-R: GCAGTGACCTCCAGAGACACTTACTTCGTCTCCACAGAA
02
Γ--,,-,SEQ. ID NO
JAK-P: 5-FAM GTCATGCTTGCAGT|^C|GCTTGC^CTG|-3-BHO1。3
Control
SEQ. ID NO
E2-T-S5: GCAGTGACCTCCAGAGACACGACAAGCTCAC
04
SEQ. ID NO
E2-T-R5: GCAGTGACCTCCAGAGACAAACAAGGACAC
05
SEQ. ID NO
E2-P-C3: CGACTCCAGCAGCTGGTTCAATAACCAAG
06
SEQ. ID NO
T2-primer: TCAAGCCGACAGTAGCCTA
07本發明另一方面提供一種用于檢測JAK2基因驅動突變檢測試劑盒，其PCR反應擴
增體系如下
4IXPCR緩沖液
模板DNA5 mL
JAK2特異引物5 μΜ
JAK2雙環探針4 μΜ
Taq 酶1. 5 U
E2_s5 引物2. 5μΜ
E2-R5 引物5 μΜ
E2-P-C3 探針2 μΜ
dNTP12. 5 mM
MgCL210 mM
甲酰胺1. 5%本發明另一方面提供一種用于檢測JAK2基因驅動性突變方法，其方法包括以下步驟(1)根據COSMIC數據公布的人類JAK2為野生型基因序列，針對JAK2的驅動性突變點，來設計特異性簡并引物和特異性雙環探針。(2)提取檢測樣本中基因組DNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、全血和血漿等組織中的DNA。(3)配制實時熒光PCR擴增反應體系。(4)根據熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷檢測結果檢測反應體系的FAM和HEX 熒光強度，以HEX信號達到設定閾值(Ct > 16)是表明檢測DNA在允許范圍內，FAM信號結果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值為0 或31:陰性；Ct值小于31:陽性。本發明的有益效果是本發明采用了特異性引物和雙環探針技術，可以特異性地檢測人類JAK2基因驅動性突變。此方法(1)建立了實時PCR體系實現對JAK2基因V617F 驅動突變快速檢測；(2)靈敏度高，5-10拷貝的突變可以檢出；(3)特異性強，IOng的野生型基因組DNA不會產生非特異性信號；(4)檢測速度快，檢測過程只需要90分鐘即可完成。


圖1為實施例1陰性對照PCR圖。圖2為實施例1檢測JAK2基因V617F突變的PCR圖。圖3為實施例1靈敏度分析試驗結果PCR圖。圖4為實施例1選擇性試驗結果PCR圖。圖5為實施例2檢測臨床樣本JAK2突變陽性PCR圖。
具體實施例方式本發明以野生型細胞系SW480的基因組為DNA野生型為檢測模板，以基因工程構建的質粒為突變模板，建立實時熒光PCR檢測JAK2反應體系，針對突變位點設計特異引物和雙環探針，檢測JAK2基因V617F驅動突變的方法包括以下步驟(1)針對突變位點設計特異性引物和雙環探針根據COSMIC數據庫公布的JAK2基因序列為野生型序列，針對JAK2基因V617突變位點設計特異性引物和特異性雙環探針。通過特異性引物和雙環探針的優化，實現JAK2 基因V617F突變高靈敏、特異性檢測。基本原理本發明設計探針的基本原理是利用雙環探針為一條寡核苷酸，其環狀部分以及探針內部雙鏈結合區可以和靶標序列結合形成一種熱力學更穩定的復式結構。如序列JAK-P， 5-FAM :GTCATGCTTGCAGT \TGA(\ GCTTGC jACTG| -3-BHQ1，其中，帶下劃線的部分結合成環，帶方
框的部分結合成另一環，雙環探針環形結構的消失引起熒光的產生。雙環探針可以在該反應中，將完全匹配的靶序列檢測出來。只有突變的DNA擴增產物可以與雙環探針結合，發出熒光信號而被檢測出來。該技術與“特異引物技術”相結合，可以阻止非特異性擴增，使檢測基因突變的靈敏度和準確性得到大幅度提高，運用上述基本原理，設計JAK2基因V617F 突變位點的雙環探針。應用I^emier 6. 0引物設計軟件設計雙環探針和特異引物核苷酸序列，設計的特異性引物和雙環探針的序列如表1所示。(2)檢測樣本處理與DNA的提取檢測樣本包括全血和血漿，對于全血、血漿其體積不少于200 μ L，按如下操作步驟提取DNA。加入蛋白酶K和Buffer ATL，56°C消化裂解1小時，加入200mL Buffer AL混勻再加入200 μ L無水乙醇充分混勻，將上清小心轉移到QIA 2mL離心柱中，6000 X g (8000rpm) 離心Imin，加入500 μ LBuffer Affl,6000Xg(8000rpm)離心Imin，小心打開蓋子加入 500 μ L Buffer AW2,6000 X g (8000rpm)離心 lmin，空管離心 20000 X g (14000rpm)離心 3min，加入 100 μ L Buffer ATE 于膜中央，溫育 5 分鐘，20000 X g (14000rpm)離心 lmin。所提DNA經紫外分光光度計檢測提取質量，要求所提DNA的0D26(1/0D28(1在1. 8 2. 0之間。然后用Tris-HCl (10mmol/L,PH 8. 0)溶液調整DNA濃度到2ng/ μ L作為PCR模板，取5 μ L進行PCR反應擴增。(3)建立PCR擴增反應體系應用上述設計合成的雙環探針和特異引物，取5μ L提取的DNA作為反應模板，采用如下PCR反應體系進行擴增，PCR擴增反應體系為
IXPCR緩沖液
模板DNA5 mL
JAK2特異引物5 μΜ
JAK2雙環探針4 μΜ
Taq 酶1. 5 U
E2_s5 引物2. 5μΜ
E2-R5 引物5 μΜ
E2-P-C3 探針2 μΜ
dNTP12. 5 mM
MgCL210 mM
甲酰胺1. 5%實時PCR反應條件是95°C預變性5分鐘，1個循環；95°C變性25秒，60°C退火20 秒，72 °C延伸20秒，15個循環；93 °C變性25秒，56 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31個循環。
6后31個循環在退火時檢測FAM和HEX熒光信號。(4)檢測熒光信號，根據Ct值作為結果判斷的標準檢測FAM和HEX熒光信號Ct值，根據熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果檢測反應體系的FAM和HEX熒光強度，以HEX信號達到設定閾值(Ct > 16)是表明檢測DNA在允許范圍內，FAM信號結果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值為0或31 陰性；Ct值小于31 陽性。以下結合具體實施例，對本發明進一步闡述。應理解，這些實施例僅用于本發明而不用于限制本發明的范圍。除非另有定義或說明，本專利所述的科學技術術語與本領域普通技術人員所理解具有相同的含義。實施例1本實施例以質粒和細胞系檢測本發明體系，經基因工程構建的突變質粒模板1株 (含V617F)，細胞系2株，分別為H1650 (JAK2基因野生型)和SW480 (JAK2基因野生型)。 利用本發明實時熒光PCR檢測JAK2基因V617F突變的方法包括如下步驟(1)樣本DNA提取將蛋白酶K和Buffer ATL，加入到800 μ 1的細胞液中，56 °C消化裂解1小時， 90°C孵化lh，加入200mL Buffer AL混勻再加入200 μ L無水乙醇充分混勻，將上清小心轉移到 QIA 2mL 離心柱中，6000Xg(8000rpm)離心 lmin，加入 500μ 1 Buffer Affl, 6000Xg(8000rpm)離心 lmin，小心打開蓋子加入 500 μ L Buffer AW2,6000 X g (8000rpm) 離心lmin，空管離心20000Xg(14000rpm)離心3min，加入100 μ L Buffer ATE于膜中央， 溫育5分鐘，20000 Xg (14000rpm)離心lmin。所提DNA經紫外分光光度計檢測提取質量， 要求所提 DNA 的 0D260/0D280 在 1. 8 2. 0 之間。然后用 Tris-HCl (10mmol/L,PH 8. 0)溶液調整DNA濃度到2ng/ μ L作為PCR模板，取5 μ L進行PCR反應擴增。(2)熒光PCR擴增反應體系將上述所提DNA樣本應于如下實時熒光PCR擴增體系進行擴增，JAK2熒光PCR擴增體系為
IXPCR緩沖液
模板DNA5 mL
JAK2特異引物5 μΜ
JAK2雙環探針4 μΜ
Taq 酶1. 5 U
E2_s5 引物2. 5μΜ
E2-R5 引物5 μΜ
E2-P-C3 探針2 μΜ
dNTP12. 5 mM
MgCL210 mM
甲酰胺1. 5%實時PCR反應條件是95°C預變性5分鐘，1個循環；95°C變性25秒，60°C退火20 秒，72 °C延伸20秒，15個循環；93 °C變性25秒，56 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31個循環。 后31個循環在退火時檢測FAM和HEX熒光信號。(3)檢測結果判定
采用MX3000P實時熒光PCR儀進行擴增，在后31個循環退火階段檢測FAM和HEX 的熒光信號，以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值為0或31 陰性；Ct值小于31 :陽性。細胞系和質粒的PCR檢測結果分別見圖1和圖2。靈敏度分析將突變質粒DNA連續10倍梯度稀釋。每次反應加入5 μ L DNA。結果表明本發明的熒光PCR方法的靈敏度高，5拷貝DNA基因組即可檢出，見圖3。選擇性分析固定每次PCR反應總DNA用量，IOOng/反應和IOng/反應。先將野生型細胞系(SW480) DNA濃度都調整為20ng/ μ L和2ng/ μ L。這樣每個反應加5 μ L模板即為IOOng/反應和IOng/反應。然后將105拷貝/ μ L的突變質粒DNA用20ng/ μ L和2ng/ μ L的SW480細胞系的DNA連續10倍稀釋。結果表明本發明的熒光PCR方法的選擇性檢測能力為在IOng總DNA中可以檢出5拷貝的突變DNA，檢測能力為0. 1%，見圖4。重復性試驗每個反應分別加入突變質粒DNA1000拷貝、100拷貝和10拷貝，重復 10次進行熒光PCR擴增，10次Ct值相差不到0. 2個循環。檢測結果表明，本發明的檢測體系可以高靈敏、準確地檢測上述混合體系的JAK2 基因突變。實施例2運用本發明檢測臨床樣本，取送我公司檢測的臨床骨髓增殖性腫瘤血液樣本50 例，其中PV患者14例，IMF患者25例，ET患者11例。年齡為30-72歲，平均年齡為56歲。 利用本發明雙環探針和熒光PCR體系檢測50例臨床樣本的JAK2基因驅動突變步驟如下。(1)臨床病理樣本DNA提取將上述樣本各取800 μ 1的血液，按如下步驟進行DNA提取。加入蛋白酶K和 Buffer ATL，56 "C消化裂解1小時，加入200mL Buffer AL混勻再加入200 μ L無水乙醇充分混勻，將上清小心轉移到QIA 2mL離心柱中，6000Xg(8000rpm)離心lmin，加入 500 μ LBuffer Affl,6000Xg(8000rpm)離心 lmin，小心打開蓋子加入 500 μ L Buffer Aff2, 6000 X g (8000rpm)離心 lmin,空管離心 20000 X g(14000rpm)離心 3min,加 Λ 100 μ L Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘，20000Xg(14000rpm)離心lmin。所提DNA經紫外分光光度計檢測提取質量，要求所提DNA的0擬60/0D280在1. 8 2. 0之間。然后用 Tris-HCl (10mmol/L, PH 8. 0)溶液調整 DNA 濃度到 &ig/μ L 作為 PCR模板，取 5 μ L 進行 PCR 反應擴增。(2)熒光PCR擴增反應體系將上述所提DNA樣本應于如下實時熒光PCR擴增體系進行擴增，JAK2熒光PCR擴
增體系為IXPCR緩沖液
模板DNA5 mL
JAK2特異引物5 μΜ
JAK2雙環探針4 μΜ
Taq 酶1. 5 U
E2_s5 引物2. 5μΜ
E2-R5 引物5 μΜ
E2-P-C3 探針2 μΜ
dNTP12. 5 mM
MgCL210 mM
甲酰胺1. 5%實時PCR反應條件是95°C預變性5分鐘，1個循環；95°C變性25秒，60°C退火20 秒，72 °C延伸20秒，15個循環；93 °C變性25秒，56 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31個循環。 后31個循環在退火時檢測FAM和HEX熒光信號。(3)檢測結果判定采用MX3000P實時熒光PCR儀進行擴增，在后31個循環退火階段檢測FAM和HEX 的熒光信號，以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值為0或31:陰性；Ct值小于31:陽性。在所檢測的50例骨髓增殖性腫瘤的臨床樣本中，包括PV患者14例、IMF患者25 例、ET患者11例。同時，在足夠量樣本下，采用直接測序法進行對比檢測，結果表明本發明體系與直接測序法的符合率達到100%，進一步證明了本發明體系檢測的準確性，結果見表 2。本發明熒光PCR反應體系可檢測JAK2基因V617F驅動性突變，檢測方便快捷，準確性高，可滿足JAK2基因驅動性突變的快速檢測。該熒光PCR方法和傳統測序方法結果的符合率為100%，熒光PCR靈敏度和選擇性檢測能力均遠高于傳統測序方法。表1:引物和探針序列
權利要求
1.用于檢測JAK2基因突變的引物及探針，包括下列7條引物和探針其序列為SEQID NO :1 至 SEQ ID NO 7。
2.一種檢測JAK2基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的7條引物和探針。
3.如權利要求2所述的檢測JAK2基因突變的檢測試劑盒，包括如下的熒光PCR的反應體系IXPCR緩沖液模板 DNA2-10mLJAK2特異引物1-10 μΜJAK2雙環探針1-10 μΜTaq Sl1-5 UE2_s5 引物1-10 μΜE2-R5 引物1-10 μΜE2-P-C3 探針1-10 μΜdNTP5-20 mMMgCL25-50 mM甲酰胺1-5%
4.如權利要求2所述的JAK2基因突變檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟(1)提供權利要求1所述的7條引物和探針；(2)待測樣品的處理和模板DNA的提取；(3)配制熒光PCR擴增反應體系；(4)用步驟(1)的引物和探針擴增待測驅動性基因突變靶序列；(5)利用雙環探針與特異性引物的雜交，檢測反應體系的FAM和HEX熒光強度，以HEX 信號達到設定閾值(Ct> 16)是表明上樣DNA的量在允許范圍內，FAM信號結果可信；以FAM 達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值為0或31 陰性；Ct 值小于31 陽性。
5.如權利要求4所述的一種JAK2基因突變檢測試劑盒的使用方法，其特征在于步驟 (2)所述的待檢測樣品包括全血、血漿和血清。
6.一種用于檢測JAK2基因突變的引物及探針，其特征在于，其由SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 7的寡核苷酸引物和探針或與其有至少70%同一性的寡核苷酸引物序列組成。
全文摘要
本發明公開了用于檢測人類JAK2基因驅動突變的引物、探針及試劑盒，涉及到基因突變的檢測。本發明的方法包括(1)提供7條引物和探針；(2)檢測樣品DNA模板的提取；(3)配制檢測JAK2基因驅動突變的熒光PCR反應體系；(4)利用雙環探針與特異性引物的雜交，檢測反應體系的FAM和HEX熒光強度，根據FAM和HEX熒光強度判定結果。本發明的方法可以檢測JAK2基因V617F驅動突變，該方法具有靈敏度高，特異性強，檢測速度快，檢測方便等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102465183SQ20111039683
公開日2012年5月23日 申請日期2011年12月2日 優先權日2011年12月2日
發明者張海龍, 肖桃英, 鄭立謀, 阮力 申請人:廈門艾德生物醫藥科技有限公司