專利名稱：兔波氏桿菌lamp檢測用引物組、檢測試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發明涉及家畜細菌病的診斷技術領域，尤其涉及用于兔波氏桿菌LAMP檢測的引物組、檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
兔波氏桿菌病是由波氏桿菌(BordetellabornchispeticEiJb)引起的一種多發性呼吸道疾病，主要引起哺乳仔兔和斷乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支氣管炎和膿皰性肺炎等，部分兔場波氏桿菌感染率高達70%。近年來在我省乃至我國各養兔地區波氏桿菌發病日趨嚴重，是引起家兔呼吸系統疾病的最主要病原，該病病程長，反復發生，難治愈，易造成患兔生長障礙，飼料利用率低，給養兔業帶來了很大的經濟損失。此外，機體感染該菌后，往往容易繼發或并發感染其他細菌和病毒，導致更嚴重的呼吸道疾病，帶來更加嚴重的損失。并且也可感染人，尤其是免疫力低下的人群。國外對波氏桿菌的研究主要集中在豬， 特別是和多殺性巴氏桿菌混合感染所引起的豬萎縮性鼻炎，而國內對兔的波氏桿菌病的研究多在于該病的普通細菌學方法的診斷和最基本的防治措施。目前，在病原體檢測方面主要檢測方法有形態學觀察、免疫學檢測和核酸檢測。兔波氏桿菌病的診斷主要還是依靠普通細菌學檢測方法，進行各項生化指標的鑒定，動物回歸試驗等。傳統的細菌學診斷方法，繁瑣費時，檢出率低，且檢測工作量大，效率不大。血清學診斷方法主要集中在乳膠凝集試驗、微量凝集試驗、Dot-ELISA和間接ELISA， ELISA檢測方法在敏感性和特異性上都有很大提高，操作相對簡單，但存在空窗期、交叉反應等問題。核酸檢測是一種較理想的病原學檢測方法，PCR及其衍生技術在敏感性及特異性上均表現良好，但這些技術存在儀器昂貴，對操作人員要求高的缺點，在基層和流行病調查前線難以應用。環介導恒溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)是 Notomi等2000年發明的一種新穎的擴增技術，其特點是針對靶基因上的6個特定區域的4 條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴增核酸，具有高特異性、 快速靈敏、高效、操作簡便等特點。經過對現有技術的文獻檢索未發現兔巴氏桿菌LAMP檢測的引物組、檢測試劑盒及其檢測方法相關研究報道，因此研制兔巴氏桿菌LAMP檢測的引物組、檢測試劑盒及其檢測方法十分必要。

發明內容
本發明目的在于克服現有技術的不足，本發明的第一個目的是提供一種兔波氏桿菌LAMP檢測用弓I物組，本發明的第二個目的是提供兔波氏桿菌LAMP檢測試劑盒，本發明的第三個目的是提供兔波氏桿菌LAMP檢測方法。本發明的檢測方法經過一次簡單的恒溫擴增，就可以達到快速檢測兔波氏桿菌的目的。采用該試劑盒和檢測方法具有操作簡單、靈敏度高的特點。為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案兔波氏桿菌LAMP檢測用引物組，引物組包括 外引物組 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT
內引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 內引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。為了實現上述的第二個目的，本發明采用了以下的技術方案
兔波氏桿菌LAMP檢測試劑盒，該試劑盒包含如下組分引物組、陽性對照品、LAMP反應液、Bst DNA聚合酶和顯色液，所述引物組為 外引物組 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT
內引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 內引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。作為優選，所述引物組中外引物組對和內引物組對添加的摩爾比為1 :4 12 作為優選，所述的陽性對照品為含有兔波氏桿菌的基因組DNA。作為優選，所述的反應液中含有0.6 1.8 mmol/L dNTP，1.25 3 mmol/L Mg2+， 0. 2-1. 4mol/L Betaine, 2 X Thermopol Buffer (市售)。作為優選，所述的Bst DNA聚合酶和顯色液為市售，顯色液優選為STOR Green L為了實現上述的第三個目的，本發明采用了以下的技術方案 兔波氏桿菌LAMP檢測方法，該方法包括以下的步驟
1)提供待測樣品DNA;
2)在LAMP反應體系中加入權利要求1所述的引物組、LAMP反應液、BstDNA聚合酶，混勻，進行恒溫擴增反應后滅活；
3)取滅活后部分產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余產物加入顯色液，觀察顯色結果， 并同時對比陽性對照品的顯色結果，若顯色結果一致，說明待測樣品中含有兔波氏桿菌，若顯色結果不一致，則說明待測樣品中不含有兔波氏桿菌。作為優選，所述的恒溫反應的溫度范圍為60_65°C，反應時間為50-60min。最優選，恒溫反應的溫度范圍為61°C，反應時間為50min。作為優選，所述滅活的溫度為80°C，滅活時間為lOmin。與現有的技術相比，本發明的有益效果
1、該兔波氏桿菌LAMP方法操作簡單，具有良好的特異性，對同種細菌的不同菌株具有廣泛的適用性；
2、具有較高的靈敏度，可以檢出痕量級的模板兔波氏桿菌最低模板檢出量為10拷貝；
3、該快速反應試劑盒反應條件溫和，所需儀器簡單，擴增快速高效，不到Ih可完成，產率高，與PCR相比更快速、經濟。


圖1為兔波氏桿菌LAMP檢測結果圖，其中左-右1000DNA Marker、1 6 臨床樣品、7:陽性對照、8 陰性對照。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1
本實施例提供利用LAMP檢測兔波氏桿菌的引物組，該引物組由如下外引物對和內引物對組成
外引物組 1: GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT
內引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 內引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。實施例2
本實施例的兔波氏桿菌LAMP檢測試劑盒，包括，9個凍存管和說明書。9個凍存管分別為代號凍存管A (4個)裝有2XLAMP核心試劑預混物(dNTP、Mg2+、Betaine、 2 X Thermopol Buffer )，凍存管B裝有50ul兔波氏桿菌DNA溶液，凍存管C裝有LAMP檢測體系所用引物混合物，凍存管D裝有Bst DNA聚合酶，凍存管F裝有顯色液優選為STOR Green I，凍存管G裝有去離子水。本實施例試劑盒的檢測方法，按常規方法提取待測樣品基因組DNA，取 μ ，在 LAMP反應體系中加入上述引物組4 ul、LAMP反應液12. 5 Pl、Bst DNA聚合酶1. 5μ1、混勻， 去離子水調至25μ1，6 進行恒溫擴增反應，80°C滅活時間為IOmin后，取3μ1滅活產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余液體產物加入顯色液，觀察顯色結果，并同時對比陽性對照品的顯色結果，若顯色結果一致，而與不加模板陰性樣品不一致，則說明待測樣品中含有兔波氏桿菌；若顯色結果與陽性樣品不一致，與陰性樣品一致，則說明待測樣品中不含有兔波氏桿菌；若待測樣品、陽性樣品、陰性樣品顯色結果一致，則需重新檢測。試驗例
將兔波氏桿菌參考菌株、分離株單克隆接種于2ml增菌肉湯培養基，37°C培養過夜，按常規方法提取DNA，然后進行以下試驗
25μ1 兔波氏桿菌 Lamp 反應體系FIP μ (1. 8Mmol/L)、BIP μ (1. 8Mmol/L ) F3 μ (0. 3Mmol/L)、B3 μ (0. 3Mmol/L)、Betaine 5μ1 (0. 4mol/L)、MgS04 1. 5μ1 (2.5mmol/L)、Bst DNA 聚合酶 1· 5μ1 (8υ/μ1)、dNTPl. 5μ1 (1. 2mmol/L) Thermopol Buffer :2. 5μ1,模板 μ , ddH20 補至 25μ1。61°C進行恒溫擴增反應，80°C滅活時間為IOmin后，取3ul滅活產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余液體產物加入顯色液，觀察顯色結果，結果顯示二者結果一致，對波氏桿菌分離株、陽性對照檢測結果為陽性，而沒加DNA模板的對照檢測結果為陰性。
權利要求
1.兔波氏桿菌LAMP檢測用引物組，其特征在于引物組包括外引物組 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT內引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG內引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。
2.兔波氏桿菌LAMP檢測試劑盒，特征在于該試劑盒包含如下組分引物組、陽性對照品、LAMP反應液、Bst DNA聚合酶和顯色液，所述引物組為外引物組 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT內引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG內引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。
3.根據權利要求2所述的兔波氏桿菌LAMP檢測試劑盒，特征在于所述引物組中外引物組對和內引物組對添加的摩爾比為1 :4 12。
4.根據權利要求2所述的兔波氏桿菌LAMP檢測試劑盒，特征在于所述的陽性對照品為含有兔波氏桿菌的基因組DNA。
5.根據權利要求2所述的兔波氏桿菌LAMP檢測試劑盒，特征在于所述的LAMP反應液中含有 0.6 1.8 mmol/L dNTP，1. 25 3 mmol/L Mg2+，0. 2 1. 4mol/L Betaine, 2XThermopol Buffer。
6.根據權利要求2所述的兔波氏桿菌LAMP檢測試劑盒，特征在于所述的BstDNA聚合酶和顯色液為市售，顯色液優選為S Y B R G r e e nL
7.兔波氏桿菌LAMP檢測方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)提供待測樣品DNA;2)在LAMP反應體系中加入權利要求1所述的引物組、LAMP反應液、BstDNA聚合酶，混勻，進行恒溫擴增反應后滅活；3)取滅活后部分產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余產物加入顯色液，觀察顯色結果， 并同時對比陽性對照品的顯色結果，若顯色結果一致，說明待測樣品中含有兔波氏桿菌，若顯色結果不一致，則說明待測樣品中不含有兔波氏桿菌。
8.根據權利要求7所述的兔波氏桿菌LAMP檢測方法，其特征在于所述的恒溫反應的溫度范圍為60 65 °C，反應時間為50 60min。
9.根據權利要求7所述的兔波氏桿菌LAMP檢測方法，其特征在于所述的恒溫反應的溫度范圍為61°C，反應時間為50min。
10.根據權利要求7所述的兔波氏桿菌LAMP檢測方法，其特征在于所述滅活的溫度為80°C，滅活時間為IOmin0
全文摘要
本發明涉及家畜細菌病的診斷技術領域，尤其涉及用于兔波氏桿菌LAMP檢測的引物組、檢測試劑盒及其檢測方法。兔波氏桿菌LAMP檢測的引物組，外引物組1如SEQNO1所示，外引物組2如SEQNO2所示，內引物組1如SEQNO3所示，內引物組2如SEQNO4所示。本發明還同時公開了采用上述的引物組的檢測試劑盒和檢測方法。本發明所建立的兔波氏桿菌LAMP檢測方法特異、靈敏、簡便快捷，約1h內可完成，能用于基層臨床樣品的快速檢測及波氏桿菌的分子流行病學調查研究。
文檔編號C12Q1/04GK102399890SQ20111039778
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月5日 優先權日2011年12月5日
發明者劉燕, 季權安, 李科, 肖琛聞, 韋強, 鮑國連 申請人:浙江省農業科學院