專利名稱：鑒定或輔助鑒定小麥新疆拉面品質性狀基因的pcr體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于鑒定或輔助鑒定小麥拉面品質性狀基因的PCR體系及其應用，特別涉及一種用于鑒定或輔助鑒定待測新疆冬小麥的面筋品質性狀相關基因和拉面粘性及光滑性相關基因的多重PCR引物對組、試劑盒及其應用。
背景技術：
面條是我國北方居民的傳統食品，是人們日常主食之一。在2000多年的發展過程中，面條在不同地域形成了其特色形式。在新疆地區，拉面是當地日常主食之一，深受人們喜愛。作為鮮濕白鹽面條，新疆拉面以其制作、食用方便，口感彈韌、光滑，拌菜豐富、美味等諸多優點，已逐漸走出新疆地區，被全國各地的人們所接受和喜愛。據統計，新疆地區小麥面粉年產量的80%用于制作拉面。但是，與新疆拉面在人們日常飲食中日益重要的地位相比，新疆拉面品質的評價仍以傳統儀器分析和成品感官評價相結合的方法為主，直接限制了其發展。因此，創建微量、快速的優質拉面評選方法，對于拉面專用品種的栽培、選育和優質拉面的加工、評價具有重要意義。近年來，隨著生活水平的提高，人們對新疆拉面品質的要求越來越高，品質相關研究已得到重視。目前研究主要集中于與優質拉面相關的磨粉、蛋白質、淀粉、面團流變學特性等品質品指標的篩選，評價方法的改良和拉面專用品種的選育方面。因為新疆拉面品質構成因素較復雜，與其相關的指標較多，所以通過新疆拉面品質評價方法的研究，將篩選出的指標有效應用于其品質評價，成為新疆拉面品質改良的關鍵環節。新疆拉面評價指標主要包括面條色澤和感官評價兩部分。面條色澤除受小麥出粉率、蛋白質含量及面粉顆粒指數等磨粉品質指標的影響外，黃色素(YP)含量和多酚氧化酶 (PPO)活性對其也有顯著影響(胡鳳靈，何中虎，葛建貴，等小麥品種黃色素含量和多酚氧化酶活性基因的分子標記檢測.麥類作物學報[J]. 2011,31 (1) :47-53.) 0根據評價標準 (穆培源，桑偉，王亮，等.新疆市售小麥面粉制作新疆拉面的加工品質特性及其專用粉品質評價指標的研究[J].麥類作物學報，2007，27 (6) :1034-1041.)，優質新疆拉面最佳色澤為亮白色，而低的YP含量和PPO活性低的品種，具有較好的白度和顏色性狀。籽粒或面粉YP 含量主要受八氫番茄紅素合酶(PSY)基因影響，與面粉和面團的白度高度負相關(Kruger J EiMatsuo R R,Presten K. A comparison of methods for the prediction of Cantonese noodle colour [J]. Canadian Journal of Plant Science，1992，72 :1021—1029.)，與其黃度高度正相關，低的YP含量基因型為Psy-Alb和Psy-Blb ；PPO活性主要受Ppo基因影響， 可以解釋面條(團)顏色褐變變異的50% 70%，是引起面條(團)顏色變褐的主要原因(Kruger J E,Hatcher D W,De Pauw R. A whole seed assay for polyphenol oxidase in Canadian prairie spring wheats and its usefulnesses a measure of noodle darkening [J], Cereal Chemistry, 1994,71 :324-326.)，籽粒或面粉低的 PPO 活性基因型為Ppo-Alb和Ppo-Dla。因此，對低YP含量和PPO低活性目標基因型的鑒定，可作為新疆拉面色澤快速預測的方法。
拉面感官評價主要包括拉面手感、面條質地、口感等項目。研究表明，蛋白質特性、 淀粉特性和籽粒硬度等品質性狀，可通過對面團流變學特性和淀粉糊化特性的影響在一定程度上決定拉面的感官評價結果(Yun S H,Quail K,Moss R. Physicochemical properties of Australian wheat flours for white salted noodles[J]. Journal of Cereal Sciences,1996,23 :181-189.)。蛋白質的數量與質量對面條品質有重要影響，其質量主要是指面粉中醇溶蛋白與麥谷蛋白的構成及比例，不同的蛋白質構成賦予了小麥籽粒蛋白質不同的質量，其中，高分子量谷蛋白亞基(HMW-GQ和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GQ的組成與面團的粘彈性及延伸性密切相關，在一定程度上決定了面條的品質。適合新疆拉面制作的面粉一般為中筋，且具有較好的延伸性。盧靜等人研究發現(蘆靜，黃天榮，聶莉小麥高分子量谷蛋白亞基及 1B/1R易位系對新疆拉面品質性狀的影響[J],新疆農業科學2010,47(10) 1909-1917.)， HMW-GS 7+8,5+10,2+10等對新疆拉面的品質有正向效應，但未對Glu-Al位點的優質 HMW-GS和優質LMW-GS予以說明。對優質拉面品種的HMW-GS和LMW-GS的分子標記檢測發現，除已發現的優質拉面亞基類型外，2*和Glu-B3a等亞基類型對新疆拉面的品質也有一定的正向效應。Glu-Al位點的Ax2*基因表達的2*亞基通過提高面筋強度(Payne P I， Lawrence G J. Catalogue of alleles for the complex gene loci, Glu-Al,Glu-Bl, and Glu-Dl which code for high molecular weight subunits of glutenin in hexaploid wheat [J]. Cereal Research Communications, 1983，11 :29-35.)，對拉面品質有一定的貢獻。此外，1B/1R易位對小麥的蛋白特性也有顯著影響。小麥的IB染色體短臂被黑麥的 IR染色體短臂取代而形成小麥-黑麥1B/1R易位系。易位使普通小麥IB染色體短臂上 LMW-GS(Glu-B3位點)和醇溶蛋白(Gli-Bl位點)缺失，或被品質較差的黑麥堿(secalin 基因編碼)取代，導致面團粘性增大，強度降低，對面團流變學特性和面條品質都有極顯著的負面影響(Wieser H, Kieffer R, Lelley T. The influence of 1B/1R chromosome translocation on gluten protein composition and technological properties of bread wheat [J]. J Sci Food Agric，2000，80 :1640-1647.)。蘆靜(蘆靜，黃天榮，聶莉小麥高分子量谷蛋白亞基及1B/1R易位系對新疆拉面品質性狀的影響[J].新疆農業科學， 2010,47(10) :1909-1917.)等研究發現，與非1B/1R易位系(不含有co-secalin基因)相比，1B/1R易位系(含有ω-secalin基因)的各項加工品質均顯著降低，大多不能滿足優質拉面制作的要求，在新疆拉面品質育種中應當淘汰。LMW-GS對小麥面粉加工品質起著重要的作用，主要影響面筋的強度和延展性 (Cornish GB,Bekes F,Allen HM,et al. Flour proteins linked to quality traits in an Australian doubled haploid wheat population[J]. Aust J Agric Res,2001,52: 1339-1348.)。He等(He ZH,Liu L，Xia XC,et al,Composition of HMW and LMW glutenin subunits and their effects on dough properties,pan bread,and noodle quality of Chinese bread wheats [J]. Cereal Chem，2005，82 :345-350.)和 Liu 等(Liu L，He ZH, Yan J, et al. Allelic variation at the Glu-I and Glu_3 loci presence of the 1B/1R translocation, and their effectson mixographic properties in Chinese bread wheat [J]. Euphytica，2005，142 :197-204.)對中國小麥品種的 Glu-I 和 Glu-3 位點的等位變異做了較詳細的研究，表明Glu-A3和Glu-B3位點與面包和面條品質相關，其中Glu_B3位點的d和b等位基因對面團延展性的作用大于其他等位基因；在對和面時間的貢獻上，表現為 Glu-Dl >Glu-B3> Glu-Al =Glu-Bl = Glu_A3 ；對面團耐揉性而言，Glu-Dl > Glu_B3 =Glu-Bl > Glu-A3 > Glu-Al ；對 SDS 沉淀值的影響大小依次為 Glu_B3 > Glu-Bl > Glu-Al > Glu-Dl > Glu-A30在提高面團最大抗延阻力方面，不同的等位變異具有不同的效應，在 Glu-A3 位點，b>d>e>c，在 Glu-B3 位點，i>b = a>e = f = g = h>c，在 Glu-D3 位點， e>b >a>c> d(Gupta RB，Singh NK，Shepherd KW. The cumulative effect of allelic variation in LMWand HMW glutenin subunits on dough properties in the progeny of two bread wheats[J]. Theor Appl Genet, 1989, 77 :57-64. Gupta RBiBekes FiWrigley CW. Prediction of physical dough properties from glutenin subunit composition in bread wheats[J]. Cereal Chem, 1991,68 :328-333.Metakovsky EV,Wrigley CW,Bekes F，et al· Gluten polypeptides as useful genetic markers of dough quality in Australian wheats [J]. Aust J Agric Res，1990,41 :289-306.)。而且近來很多育種學以及數量遺傳學等方面的研究認為，LMW-GS對提高面團的強度和延展性，進而改良面包的品質方面具有很高的正效應(Nelson JCiAndreescu C，Breseghello F，et al. Quantitative trait locus analysis of wheat quality traits[J]. Euphytica，2006，149 145-159. Li Y，Song Y，Zhou R，et al. Detection of QTLs for bread-making quality in wheat using a recombinant inbred line population[J]. Plant Breeding, 2009,128 :235-243. Mann G，Diffey S，Cullis B，et al. Genetic control of wheat quality !interactions between chromosomal regions determining protein content and composition, dough rheology, and sponge and dough baking properties[J]. Theor Appl Genet，2009，118 1519-1537. Oury F-XiChiron H,Faye A,et al. The prediction of bread wheat quality joint use of the phenotypic information brought by technological tests and the eenetic information brought by HMW and LMW glutenin subunits [J]. Euphytica，2010， 171 :87-109. Raman R，Allen H，Diffey S，et al. Localization of quantitative trait loci for qualityattributes in a doubled haploid population of wheat(Triticum aestivum L.) [J] · Genome，2009，52 :701-715.)。 淀粉的含量、直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例對面條的柔軟度、彈性和光滑度有很大影口向(Toyokawa H, Rubenthaler G L, Powers J R, et al. Japanese noodle qualities I. Flour components [J] · Cereal Chem, 1989,66 (5) :387-391.)，對面條的感官評價有重要影響。在小麥籽粒淀粉合成中，糯蛋白(Waxy)是合成直鏈淀粉的關鍵酶(Miura H，Tanii S,Nakamura T,et al. Genetic control of amylase content in wheat endosperm starch and differential effects of three Wx genes[J]. Theor Appl Genet,2000,100 (1) 32-38.)，由fe-Al、Wx-Bl和三個基因編碼合成(羅光彬，黃修文，尤明山，等小麥 fe基因研究進展[J].糧油食品科技，2010，18(6) :1-4.)，它主要是通過直鏈淀粉含量影響面條品質的。一般認為直鏈淀粉含量低的面粉做出的面條評分高(趙俊曄，于振文小麥籽粒蛋白質和淀粉代謝及其與品質形成關系的研究進展[J].麥類作物學報，2005，25 (3) 106-111.)。在普通小麥的三個fe蛋白亞基中，同樣缺失單個亞基的情況下，缺失fe-Bl亞基使直鏈淀粉減少得最多，同時也使得膨脹勢和峰值粘度增高幅度最大(Miura H，Araki E，Tarui S. Amylose synthesis capacity of the three Wx gene of wheat cv. ChineseSpring[J], Euphytica,1999,108(2) :91-95. Araki E, Miura H, Sawada S. Differential effects ofthe nullalleles at the three Wx loci on the starch-pasting properties of wheat[J]. Theor Appl Genet, 1991,97 :199-205.Yamamori M,Quynh N T. Differential effects of Wx-Al, Wx-Bl and Wx-Dl protein deficiencies on apparent amylase content and starch pasting properties in common wheat[J]. Theor Appl Genet,1994, 89 :276-觀0.)，面粉的面條加工品質較好(劉建軍，何中虎，楊金，等小麥品種淀粉特性變異及其與面條品質關系的研究[J]·中國農業科學，2003，36(1) :7-12. )0籽粒硬度的主效基因puroindoline位于5D染色體短臂，分為Pina和Pinb兩種類型，其不同變異對小麥磨粉品質和食品加工品質有重要的影響。Chen等(陳鋒，尚曉麗，董中東，等.中國小麥歷史品種puroindoline基因等位變異檢測[J].麥類作物學報，2011， 31(3) 389 394)研究表明，Pinb-Dlb比Pina-Dlb類型出粉率高、灰份低、具有更好的磨粉品質，同時前者的饅頭、面條和面包加工品質也均優于Pina-Dlb和野生型。新疆拉面的傳統評價方法需要多種分析儀器、樣品用量大、測定周期長，且很難實現大量材料、多個指標的同時檢測，制約了新疆拉面的品質改良和評價。隨著與小麥加工品質相關基因的克隆及其分子標記的開發，利用特異性引物對品質基因進行快速PCR檢測的方法得到廣泛應用。但新疆拉面的品質改良涉及多個基因，傳統的PCR方法一般一次只能檢測一個或少數幾個基因，很難滿足拉面專用品種的選育及其后續篩選、加工、評價的需求。

發明內容
本發明的目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀相關基因的多重PCR引物對組、試劑盒，以及利用所述多重PCR引物對組鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀的方法。本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀相關基因的多重PCR 引物對組為如下al)或a2)的引物對組al)由引物對組A和引物對組B組成的弓丨物對組；3幻引物對組A;所述引物對組A中的引物對均特異于拉面面筋強度、面筋質量和磨粉品質相關基因，具體由特異于Ax2*基因的一個引物對，特異于Pinb-Dlb基因的一個引物對，和特異于 ω-secalin基因的一個引物對組成；所述引物對組B中的引物對均特異于拉面面筋強度， 及粘性和光滑性相關基因，具體由特異于Glu-B3a基因(使拉面中等面筋強度相關基因) 的一個引物對，和特異于fe-Bl基因(拉面粘性和光滑性相關基因)的一個引物對組成；所述引物對組A中，所述特異于Ax2*基因的一個引物對為序列表中序列1和序列 2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1 ；所述特異于PinbDlb基因的一個引物對為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ；所述特異于ω-secalin基因的一個引物對為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3。所述引物對組B中，所述特異于Glu_B3a基因的一個引物對為序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4 ；所述特異于Wx-Bl基因的一個引物對為序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5。
其中，序列1由21個核苷酸組成；序列2由20個核苷酸組成；序列3由21個核苷酸組成；序列4由18個核苷酸組成；序列5由20個核苷酸組成；序列6由20個核苷酸組成；序列7由20個核苷酸組成；序列8由19個核苷酸組成；序列9由25個核苷酸組成；序列10由22個核苷酸組成。本發明中，所述^31基因有兩個等位基因，分別是化-81￡1和fe-Blb。所述引物對組A中每個引物對的兩條引物在PCR反應體系中等量使用，且所述引物對1，所述引物對2和所述引物對3在PCR反應體系中的摩爾比為1 1 1;所述特異引物對組B中每個引物對的兩條引物在PCR反應體系中等量使用，且所述引物對4和所述引物對5在PCR反應體系中的摩爾比為5 2。含有所述用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀相關基因的多重PCR引物對組的試劑盒也屬于本發明的保護范圍。所述用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀相關基因的多重PCR引物對組的制備方法也屬于本發明的保護范圍。該制備方法具體可包括將所述用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀相關基因的多重PCR引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。所述試劑盒的制備方法也屬于本發明的保護范圍。該制備方法具體可包括如下步驟將所述用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀相關基因的多重PCR引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。鑒定或輔助鑒定待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種的方法也屬于本發明的保護范圍。該方法包括下述(1)和O)的步驟所述(1)為如下A)和B)A)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為從62°C起，每進行IfPCR反應循環下降0. rc ；在本發明的實施例中，用所述引物對組A進行PCR反應共進行了 35個循環；B)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對組B進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為55. 50C ；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和ω -secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種以所述引物對組A的進行PCR反應的產物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥含有ω-secalin基因或候選含有co-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因；以所述引物對組B的進行PCR反應的產物中，如果含有大小為1095bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Glu-B3a基因或候選含有Glu-B3a基因；如果不含有大小為1095bp的 DNA片段，所述待測小麥不含有Glu-B3a基因或候選不含有Glu_B3a基因；如果含有大小為 425bp的DNA片段，所述待測小麥含有Wx-Bla基因或候選含有Wx-Bla基因；如果不含有大小為42^p的DNA片段，所述待測小麥含有fe-Blb基因或候選含有基因。鑒定或輔助鑒定待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種的方法也屬于本發明的保護范圍。該方法包括下述(1)和O)的步驟(1)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR 反應的退火溫度為從62°C起，每進行1個PCR反應循環下降0. 1°C，在本發明的實施例中， 用所述引物對組A進行PCR反應共進行了 35個循環。(2)檢測步驟(1)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種以所述引物對組A的進行PCR反應的產物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥含有ω-secalin基因或候選含有ω-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因。本發明的另一個目的是提供一種培育拉面小麥品種的方法。該方法包括采用如下a)_e)中至少一種的小麥作為親本進行育種的步驟a)含有或候選含有Ax2*基因；b)含有或候選含有Pinb-Dlb基因；c)不含或候選不含有ω-secal in基因；d)含有或候選含有Glu_B3a基因；e)含有或候選含有fe-Blb基因。從眾多小麥品種中選擇滿足a)_e)中至少一項的小麥的方法，即為上述鑒定或輔助鑒定待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種的方法。所選擇的小麥滿足上述a)-e)五項中的項數越多，表示所選擇的小麥越適合制作拉面。在本發明的實施例中，所述待測小麥具體為新疆冬小麥，如小麥品種(系)新冬22 號、新冬23號、藁優8901、HD04-23、79-18、新冬14號、新冬對號、新冬觀號、新冬18號、冀麥26、奎冬4號、石冬8號、85(1) ,89(35)、80182、花91_26、89_44、新冬2號、新冬7號、華北497,91 (28)、89-2012、新冬19號、冀麥31、石冬9號和87YF5等。利用本發明對上述小麥品種(系)進行鑒定或輔助鑒定后，發現小麥品種(系)石冬8號具有拉面面筋強度、面筋質量和磨粉品質優質基因AUi^nPinb-Dlb的同時，又不含有影響拉面品質的ω-secalin 基因；小麥品種(系)華北497和冀麥31同時具有拉面粘性和光滑性優質基因Glu-B3a和 Wx-Blb0本發明所提供的引物對組A或引物對組B的各引物對之間不存在相互抑制作用和錯配，檢測品種(系)的結果可靠、重復性好，成本低。本發明所提供的引物對組A或引物對組B均選用同樣的退火溫度，實現了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且特異性強， 檢測過程耗時短。將本發明含有引物對組A或引物對組B的多重PCR體系用于小麥品質育種的親本評價和雜交后代優質基因的聚合，將會提高優質拉面專用小麥品種評價和選育的效率，加快拉面專用小麥品種的加工品質改良。


圖1為Ax2*、Pinb_Dlb和ω-secalin基因標記的多重PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為Glu_B3a、Wx-Bla和基因標記的多重PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、拉面面筋強度、面筋質量和磨粉品質相關基因的多重PCR檢測本實施例的多重PCR引物對組由特異于Ax2*基因的一個引物對，特異于Pinb-Dlb 基因的一個引物對，和特異于ω-secalin基因的一個引物對組成；其中，所述特異于Ax2* 基因的一個引物對為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1 ；所述特異于Pinb-Dlb基因的一個引物對為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ；所述特異于ω-secalin基因的一個引物對為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3。本實施例的多重PCR引物對組可用于同時檢測Ax2*、Pinb-Dlb和ω-secalin基因。在Glu-Al位點含有Ax2*基因的材料中，PCR擴增出大小為1319bp的一條帶；在含有 Pinb-Dlb基因的材料中，PCR擴增出大小為250bp的一條帶；在含有ω-secalin基因的材料中，PCR擴增出大小為1067bp的一條帶。一、已知基因型小麥品種拉面面筋強度、面筋質量和磨粉品質相關基因的多重PCR 擴增1、小麥基因組的制備采用CTAB法對5份已知基因型的小麥品種(系)進行基因組DNA的提取，得到對應于5份已知基因型的小麥品種(系)的基因組DNA，作為拉面面筋強度、面筋質量和磨粉品質相關基因多重PCR擴增的模板。其中，5份已知基因型的小麥品種(系)依次為新冬22 號、新冬23號、藁優8901、HD04-23和79-18。王亮等(王亮，穆培源，徐紅軍，等.新疆小麥品種高分子量麥谷蛋白亞基組成分析[J].麥類作物學報，2008，觀(3) =430-435.王亮，穆培源，桑偉，等.新疆小麥品種籽粒硬度及puroindoline基因等位變異的分子檢測[J].麥類作物學報，2010，30(1) :17-22.王亮，穆培源，徐紅軍，等.新疆小麥1BL/1RS易位和Dx5 基因的多重PCR檢測及其面筋品質分析[J],麥類作物學報，2011,31(3) :469-474.)對這五個小麥品種(系)的Glu-Al和Pinb-Dl基因的基因型，以及是否含有co-secalin基因進行了分子標記檢測，詳見表1。 表1已知基因型小麥品種(系)拉面面筋強度、面筋質量和磨粉品質相關基因的基因型
權利要求
1.用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀相關基因的多重PCR引物對組，所述拉面品質性狀相關基因為Ax2*基因、Pinb-Dlb基因、co-secalin基因、Glu_B3a基因和基因，其特征在于所述多重PCR引物對組由引物對組A和引物對組B組成；所述引物對組 A由特異于所述Ax2*基因的一個引物對，特異于所述Pinb-Dlb基因的一個引物對，和特異于所述ω-secalin基因的一個引物對組成；所述引物對組B由特異于所述Glu-B3a基因的一個引物對，和特異于所述fe-Bl基因的一個引物對組成；所述引物對組A中，所述特異于Ax2*基因的一個引物對為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1 ；所述特異于Pinb-Dlb基因的一個引物對為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ；所述特異于ω-secalin基因的一個引物對為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3 ；所述引物對組B中，所述特異于Glu-B3a基因的一個引物對為序列表中序列7和序列 8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4;所述特異于Wx-Bl基因的一個引物對為序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5。
2.用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質性狀相關基因的多重PCR引物對組，為權利要求1中的所述引物對組A，由特異于所述Ax2*基因的一個引物對，特異于所述Pinb-Dlb 基因的一個引物對，和特異于所述ω-secalin基因的一個引物對組成；所述特異于Ax2*基因的一個引物對為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1 ；所述特異于Pinb-Dlb基因的一個引物對為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ；所述特異于ω-secalin基因的一個引物對為序列表中序列 5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3。
3.根據權利要求1或2所述的引物對組，其特征在于所述引物對組A中每個引物對的兩條引物在PCR反應體系中等量使用，且所述引物對1，所述引物對2和所述引物對3在 PCR反應體系中的摩爾比為1 1 1 ；所述特異引物對組B中每個引物對的兩條引物在 PCR反應體系中等量使用，且所述引物對4和所述引物對5在PCR反應體系中的摩爾比為5 · 2 ο
4.含有權利要求1-3中任一所述引物對組的試劑盒。
5.權利要求1-3中任一所述引物對組的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權利要求1-3中任一所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
6.權利要求4所述PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權利要求1-3中任一所述的引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
7.鑒定或輔助鑒定待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種的方法，其特征在于所述方法包括下述(1)和O)的步驟所述(1)為如下A)和B)A)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權利要求1或3所述引物對組中的所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為從62°C起，每進行1個PCR反應循環下降.0. rc ；B)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權利要求1或3所述引物對組中的所述引物對組B進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為55. 5°C ；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種以所述引物對組A的進行PCR反應的產物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥含有ω-secalin基因或候選含有co-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因；以所述引物對組B的進行PCR反應的產物中，如果含有大小為1095bp的DNA片段，所述待測小麥含有Glu-B3a基因或候選含有Glu-B3a基因；如果不含有大小為1095bp的DNA片段，所述待測小麥不含有Glu-B3a基因或候選不含有Glu-B3a基因；如果含有大小為的DNA片段，所述待測小麥含有Wx-Bla基因或候選含有Wx-Bla基因；如果不含有大小為 425bp的DNA片段，所述待測小麥含有fe-Blb基因或候選含有基因。
8.鑒定或輔助鑒定待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種的方法，其特征在于所述方法包括下述(1)和O)的步驟該方法包括下述(1)和O)的步驟(1)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權利要求2或3所述引物對組中的所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為從62°C起，每進行1個PCR反應循環下降0. rc ；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測小麥是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種以所述引物對組A的進行PCR反應的產物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥含有ω-secalin基因或候選含有co-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因。
9.一種培育拉面小麥品種的方法，包括采用通過權利要求7的方法鑒定得到的如下 a)-e)中至少一種的小麥作為親本進行育種的步驟a)含有或候選含有Ax2*基因；b)含有或候選含有Pinb-Dlb基因；c)不含或候選不含有ω-secalin基因；d)含有或候選含有Glu-B3a基因；e)含有或候選含有^^讓基因。
10.根據權利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述小麥為新疆冬小麥。
全文摘要
本發明公開了一種用于鑒定或輔助鑒定小麥拉面品質性狀基因的PCR體系及其應用。本發明的PCR體系中的引物對組為下述1)或2)1)引物對組A和引物對組B；2)引物對組A；所述引物對組A中的三個引物對分別由序列1和序列2所示兩條DNA單鏈，序列3和序列4所示兩條DNA單鏈，序列5和序列6所示兩條DNA單鏈組成；所述引物對組B兩個引物對分別由序列7和序列8所示兩條DNA單鏈，序列9和序列10所示兩條DNA單鏈組成。本發明所提供的引物對組各引物對間不存在抑制和錯配，實現了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且結果可靠、重復性好，特異性強，成本低，耗時短，為優質拉面小麥品種選育及加工品質改良提供依據。
文檔編號C12N15/11GK102399892SQ20111039810
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月2日 優先權日2011年12月2日
發明者崔鳳娟, 張曉科, 徐紅軍, 桑偉, 王曉龍, 相吉山, 穆培源, 聶迎彬, 鄒波, 韓新年 申請人:新疆農墾科學院