專利名稱：一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種單克隆抗體片段的制備方法，特別涉及一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法。
背景技術：
人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)是人類受孕后胎盤合體滋養層細胞分泌的一種糖蛋白激素，分子量約為38000D，hCG的合成與分泌與妊娠是密切相關的。hCG的檢查可作為早孕檢測的一項重要指標，采用抗hCG單克隆抗體進行早孕檢測，可以進一步提高早期妊娠診斷的敏感性和特異性。而且hCG的含量與許多腫瘤性疾病有著密切的聯系，可將hCG看作是腫瘤標志物之一，因此hCG的檢查也可對滋養層細胞腫瘤和非滋養層細胞腫瘤的診斷與治療監測提供依據。近年來發現，惡性腫瘤如胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等血中hCG也可升高，在患膀胱癌、胰腺癌、結腸癌的個體的血清中常可檢測得到hCGi3亞基蛋白有明顯地提高，而且在腫瘤組織中通過過氧化物酶染色法也可以檢測到。另外相對于單克隆抗體，單克隆抗體片段(包括Fab和F(ab' )2片段)具有更多優勢(1)不受位于巨噬細胞、B細胞、T細胞、中性粒細胞和巨細胞等細胞上的Fc受體的影響；(2)不沉淀抗原；(3)在正常組織中分解放射性標記片段比整個IgG偶聯物更快；(4) 降低免疫原性(Fe區缺失)，使人抗鼠免疫球蛋白(HAMA)反應最小化；(5)更不易遭到吞噬細胞攻擊；(6)分子量小，到達腫瘤部位迅速。因此，若能研制出高純度、效果好、免疫原性弱的人絨毛膜促性腺激素(hCG)單克隆抗體片段，并應用與診斷試劑的開發，必將帶來可觀的社會與經濟效益。根據目前國內外文獻及專利報道，抗體片段的制備，都采用游離的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解抗體再經過多步分離純化制得，該類方法存在游離酶無法重復利用，去除游離酶同時會降低產物回收率等問題。

發明內容
本發明目的是提供一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，該方法操作簡便、純化步驟少、所得抗體片段純度高。本發明采用的技術方案是一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，所述方法為將含0. 1 lmmol/L DTT 和 0. 1 2. 5mmol/L EDTA 的 ρΗ5· 0 9. 0 的 0. lmol/L 醋酸緩沖溶液在 30 50°C下水浴5 lOmin，加入固定化木瓜蛋白酶，30 50°C水浴20 30min，抽濾，棄去濾液A即除去DTT，獲得濾餅A即為活化的固定化木瓜蛋白酶，將活化的固定化木瓜蛋白酶于pH5. 00. lmol/L醋酸緩沖液中，加入抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體，30 60°C水浴反應4 Mh，反應液抽濾，濾餅B為固定化木瓜蛋白酶回收利用，濾液B即為含單克隆抗體片段的水解液，采用弱陰離子交換層析對含單克隆抗體片段的水解液進行分離純化，獲得所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段；所述固定化木瓜蛋白酶以氨化紙纖維為載體， 以戊二醛為交聯劑，以木瓜蛋白酶為底物，于含lmmol/L DTT和2mmol/L EDTA的pH5. 0的 0. lmol/L醋酸緩沖液中，室溫下攪拌8 Mh，抽濾，得濾餅C即為固定化木瓜蛋白酶；所述氨化紙纖維是紙纖維先經0. 1 0. 2mol/L的NaOH溶液處理2 3h，再用環氧氯丙烷于 60 70°C活化0. 5 lh，最后用對苯二胺于40 50°C氨化0. 5h，用蒸餾水充分洗滌，真空干燥至恒重，獲得氨化紙纖維；所述固定化木瓜蛋白酶質量用量以抗體體積計為0. 1 0. 2g/ml抗體，所述固定化木瓜蛋白酶載酶量為0. 002g/g固定化酶，所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體利用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化獲得。所述固定化木瓜蛋白酶按如下方法制備將氨化紙纖維分散于含lmmol/L DTT和 2mmol/L EDTA的pH2. 0 6. 5的0. lmol/L醋酸緩沖溶液A中，加入木瓜蛋白酶和質量濃度25 %的戊二醛水溶液，室溫下攪拌8 Mh，抽濾，濾餅C用與所述的醋酸緩沖溶液A相同的醋酸緩沖液B充分洗滌，過濾，濾餅即獲得固定化木瓜蛋白酶；所述氨化紙纖維與木瓜蛋白酶的質量比為1 0.006，所述25%戊二醛水溶液以氨化紙纖維質量計為0.317ml/g， 所述醋酸緩沖溶液A的體積用量對本發明沒有影響，能夠使紙纖維充分分散即可，體積用量通常以氨化紙纖維的質量計為33 40ml/g，所述醋酸緩沖液B的體積用量通常能夠充分洗滌即可。所述氨化紙纖維按如下方法制備將濾紙剪碎、水煮至爛，紗布過濾，濾餅a即紙纖維，將紙纖維加入0. 1 0. 2mol/L的NaOH溶液A中攪拌池，水洗至pH7. 0，抽濾，取濾餅 b按質量體積比1 9加入0.5 lmol/L的NaOH溶液B，按與濾餅b質量體積比1 1加入環氧氯丙烷，60 70°C水浴攪拌反應30min，抽濾，濾餅c用去離子水充分洗滌后抽干，獲得濾餅d，再以質量體積比0.2 1加入對苯二胺，于45°C下反應30min，用蒸餾水充分洗滌，真空干燥至恒重，獲得氨化紙纖維。所述弱陰離子交換層析為DEAE-S^horose-FF層析，以pH8. 0含lmol/LNaCl的 20mmol/L的Tris-HCl作為洗脫液，線性梯度洗脫，收集第一洗脫峰，獲得所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段。本發明所述固定化木瓜蛋白酶的載酶量為0.002g/g固定化酶，酶活1940U/g，酶活定義為在上述條件下，每分鐘釋放Iug的酪氨酸的酶量為一個酶活力單位U。本發明所述固定化木瓜蛋白酶酶活測定方法為在試管中加入2ml的0. Imol/ L的醋酸緩沖液(ρΗ5· 0，內含0. 005mol/L DTT和0. OOlmol/LEDTA)，8ml 2%酪蛋白溶液 (ρΗ7· 0)，37°C水浴預熱5min,然后加入0. 5g(濕重，Ig濕重相當于0. 4g干重)固定化酶， 于37°C反應30min后加入5ml 10%三氯乙酸溶液，震蕩后于37°C放置lOmin，過濾，測濾液在^Onm處的吸光度。效價(單位/g) = A/As*Cs*12/2* 稀釋倍數 /V式中A為供試品溶液的吸光度減去空白溶液的吸光度；As為酪氨酸對照品溶液的吸光度；Cs為酪氨酸對照品溶液的濃度ug/ml ；W為供試品質量，g。本發明所述小鼠腹水來源通常是將hCG抗原注入小鼠體內，小鼠體內發生免疫反應，得到hCG抗原，抽取小鼠腹水，即得到所述粗抗，本發明采用艾康生物技術有限公司生產的抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體的小鼠腹水作為粗抗，經過辛酸-硫酸銨法純化獲得抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體。本發明所述紙纖維取自普通濾紙。DTT即DL-Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇。分子式為C4HltlO2S2，分子量為 154. 25，純度> 99%。本發明所述濾餅A、濾餅B、濾餅C，濾餅a、濾餅b、濾餅c，均為不同步驟過濾所得濾餅，濾液A即為濾液，為便于區分而命名。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在本發明中的以氨化紙纖維為載體，以戊二醛為交聯劑，以木瓜蛋白酶為底物得到的固定化木瓜蛋白酶可以反復利用，回收簡單，隨著生產規模的擴大，可以大大降低生產成本，并且不用考慮游離酶在抗體片段中的殘留問題，可以節省分離純化的步驟從而提高抗體片段的得率；另外本發明方法操作簡便、純化步驟少、所得抗體片段純度高本發明中制備的抗體片段只需經過一步純化就可達到90%以上的純度。


圖1固定化木瓜蛋白酶懸浮液照片圖2DEAE-S印horose-FF柱純化抗體片段色譜圖A為穿透峰，B洗脫峰圖3抗體片段的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定圖1為抗體片段電泳圖，2為標準蛋白電泳圖
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例11)木瓜蛋白酶的固定化將濾紙剪碎，加入自來水，煮沸，煮爛后用8層紗布過濾，取濾餅加入IOOOml 0. lmol/L的NaOH溶液，攪拌2h,水洗至pH將近7. 0，抽濾，取1. 2g 濾餅(干重)按1 9 (g/ml)的比例加入lmol/L的NaOH溶液，再按與濾餅質量體積比 1 l(g/ml)的比例補加環氧氯丙烷，60°C水浴攪拌反應30min，抽濾，濾餅用去離子水充分洗滌，抽干，濾餅再按與1.2g濾餅質量比0.2 1加入對苯二胺(0.24g對苯二胺/1.2g 濾餅載體)，于45°C下反應30min，過濾，濾餅用蒸餾水充分洗滌，真空干燥至恒重，獲得氨化紙纖維1. 2g。以氨化紙纖維為載體，以戊二醛為交聯劑制備固定化木瓜蛋白酶將上述 1. 2g氨化紙纖維分散于pH5. 0的0. lmol/L的醋酸緩沖液(內含lmmol/L DTT和2mmol/L EDTA)40ml，加入7. 2mg木瓜蛋白酶(生工生物工程上海有限公司)和質量濃度25%戊二醛水溶液0. 387ml，室溫(25°C )下攪拌12h，抽濾，濾餅用pH5. 0,0. lmol/L的醋酸緩沖液充分洗滌，過濾，濾餅為固定化木瓜蛋白酶，懸浮于pH5.0、0. lmol/L的醋酸緩沖液中備用，如圖 1所示。2)單克隆抗體的制備利用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化用4倍體積的醋酸緩沖液(60mmol/L，pH4. 0)稀釋含抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體的小鼠腹水(艾康生物技術有限公司)，用0. lmmol/L NaOH調pH至4. 5，獲得150ml混合液，逐滴加入1. 875ml辛酸(25ul/ml混合液)，邊滴加邊攪拌，滴完后繼續攪拌30min，8000r/min離心30min，取上清液按體積比10 1與PBS混合，用0. lmol/L的NaOH調pH至7. 4，加入；35. 0658g硫酸銨(0. 227g/ml混合液)攪拌30min后，6000r/min離心15min，棄上清液，將沉淀懸浮于 PBS (起始腹水體積的1/ 中，懸浮液用100倍體積的PBS透析過夜，獲得抗人絨毛膜促進性腺激素單克隆抗體(HCG) 5ml，于-20°C保存。為了防止提純過程中抗體被破壞，以上所有攪拌和操作過程均在4°C條件下進行。3)單克隆抗體的酶解在試管中加入3. 5ml 0. lmol/L, pH5. 0的醋酸緩沖液(內含0.5ml DTT及lmlEDTA)，30°C水浴預熱5min，然后加入Ig固定化木瓜蛋白酶(濕重，載酶量0. 002g,酶活1940U/g)，30°C反應30min，抽濾，棄去濾液即除去DTT，獲得濾餅即活化的固定化木瓜蛋白酶，將活化后的固定化木瓜蛋白酶Ig置于0. lmol/L、pH5. 0的15ml醋酸緩沖溶液中加入5ml上述HCG抗體，37°C水浴反應他，抽濾，取濾液，即為含HCG片段的水解液，濾餅即固定化木瓜蛋白酶，回收重復利用。4)單克隆抗體片段的純化取上述含HCG片段的水解液，用非還原性的SDS-PAGE 電泳檢測抗體消化的程度(非還原性的電泳即樣品中不加DTT，從而保證抗體內部的二硫鍵不被破壞，電泳可以直觀顯示片段的分子量及純度，如果未消化完全，則除了有片段的條帶外，還有完整的抗體條帶)，采用弱陰離子交換層析(DEAE-S印horose-FF，2cmX 18cm, Pharmacia公司)對所得抗體片段進行分離純化，利用Tris-HCl (pH8. 0,20mmol/L)作為上樣緩沖液(A液)，以lmol/LNaCl的Tris-HCl (ρΗ8· 0，20mmol/L)作為洗脫液(B液)，采用線性梯度洗脫，流速2ml/min，收集第一洗脫峰即為抗體片段(參見圖2)。實施例21)木瓜蛋白酶的固定化將濾紙剪碎，加入自來水，煮沸，煮爛后用8層紗布過濾， 在紙纖維中加入1000ml 0. 2mol/L的NaOH溶液，攪拌3h，水洗至pH將近7. 0，抽濾，取1. 2g 濾餅(干重)按1 9 (g/ml)的比例加入lmol/L的NaOH溶液，再按與濾餅質量體積比 1 1 (g/ml)的比例補加環氧氯丙烷，60°C水浴攪拌反應30min，抽濾，濾餅用去離子水充分洗滌后抽干，獲得濾餅，再按與1.2g濾餅質量體積比0.2 1加入對苯二胺(0.24g對苯二胺/1. 2g濾餅載體)，于45°C下反應30min，用蒸餾水充分洗滌，真空干燥至恒重，獲得氨化紙纖維。以氨化紙纖維為載體，以戊二醛為交聯劑，以木瓜蛋白酶為底物制備固定化木瓜蛋白酶將1. 2g氨化紙纖維載體分散于pH5. 0的0. lmol/L的醋酸緩沖液(內含lmmol/L DTT和2mmol/L EDTA) 40ml，加入7. 2mg木瓜蛋白酶和0. 387ml質量濃度25 %戊二醛水溶液，室溫下攪拌12h，抽濾，濾餅用0. lmol/L的醋酸緩沖液充分洗滌，過濾，濾餅即為固定化木瓜蛋白酶，懸浮于pH5.0、0. lmol/L的醋酸緩沖液中備用。2)單克隆抗體的制備利用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化，小鼠腹水的獲得同實施例1。用4倍體積的醋酸緩沖液(60mmol/L，pH4. 0)稀釋腹水，用0. Immom/LNaOH 調pH至4. 5，獲得150ml混合液，將1. 875ml辛酸(25ul/ml混合液)逐滴加入樣品中，邊滴加邊攪拌，滴完后繼續攪拌30min，8000r/min離心30min，取上清液按體積比10 1與 PBS混合，用0. lmol/L的NaOH調pH至7. 4，加入硫酸銨35. 0658g(0. 227g/ml混合液)攪拌30min后，6000r/min離心15min，棄上清液，將沉淀懸浮于PBS(起始腹水體積的1/5)中。 懸浮液用100倍體積的PBS透析過夜，獲得抗人絨毛膜促進性腺激素單克隆抗體(HCG)5ml，于-20°C保存。微量防止提純過程中抗體被破壞，以上所有攪拌和操作過程均在4°C條件下進行。3)單克隆抗體的酶解在試管中加入3. 5ml 0. lmol/L, pH8. 0的磷酸緩沖液(內含0.5ml DTT及lmlEDTA)，50°C水浴預熱5min，然后加入0. 5g固定化木瓜蛋白酶(濕重， 載酶量0. 002g,酶活1940U/g)，50°C反應30min。抽濾，棄去濾液即除去DTT，濾餅即再活化的固定化木瓜蛋白酶。活化后的固定化木瓜蛋白酶0. 5g置于0. lmol/L、pH5. 0的15ml醋酸緩沖溶液中加入5ml HCG抗體，50°C水浴反應12h，抽濾，取濾液即為含HCG片段的水解液，濾餅即固定化酶回收重復利用。4)單克隆抗體片段的純化取上述含HCG片段的水解液，用非還原性的SDS-PAGE 電泳檢測抗體消化的程度，采用弱陰離子交換層析對所得抗體片段進行分離純化，利用 Tris-HCl (ρΗ9· 0，20mmol/L)作為上樣緩沖液(A 液，lmol/LNaCl 的 Tris-HCl (ρΗ9· 0， 20mmol/L)作為洗脫液(B液)，采用線性梯度洗脫，流速aiil/min，收集第一洗脫峰即為抗體片段。所得抗體片段經聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度達到95% (參見圖3)。
權利要求
1.一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，其特征在于所述方法為將含 0. 1 lmmol/L DTT 和 0. 1 2. 5mmol/L EDTA 的 pH5. 0 9. 0 的 0. lmol/L 醋酸緩沖溶液在30 50°C下水浴5 lOmin，加入固定化木瓜蛋白酶，30 50°C水浴20 30min， 抽濾，棄去濾液A，獲得濾餅A即為活化的固定化木瓜蛋白酶；將活化的固定化木瓜蛋白酶于pH5.0、0. lmol/L醋酸緩沖液中，加入抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體，30 60°C水浴反應4 Mh，反應液抽濾，濾餅B為固定化木瓜蛋白酶回收利用，濾液B即為含單克隆抗體片段的水解液；采用弱陰離子交換層析對所述含單克隆抗體片段的水解液進行分離純化， 獲得所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段；所述固定化木瓜蛋白酶以氨化紙纖維為載體，以戊二醛為交聯劑，以木瓜蛋白酶為底物，于含lmmol/LDTT和2mmol/L EDTA的pH5. 0 的0. lmol/L醋酸緩沖液中，室溫下攪拌8 Mh，抽濾，得濾餅C即為固定化木瓜蛋白酶；所述氨化紙纖維是紙纖維先經0. 1 0. 2mol/L的NaOH溶液處理2 汕，再用環氧氯丙烷于 60 70°C活化0. 5 lh，最后用對苯二胺于40 50°C氨化0. 5h，用蒸餾水充分洗滌，真空干燥至恒重，獲得氨化紙纖維；所述固定化木瓜蛋白酶質量用量以抗體體積計為0. 1 0. 2g/ml抗體，載酶量為0. 002g/g固定化酶，所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體利用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化獲得。
2.如權利要求1所述的抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，其特征在于所述固定化木瓜蛋白酶按如下方法制備將氨化紙纖維分散于含lmmol/L DTT和2mmol/L EDTA的pH2 6. 5的0. lmol/L醋酸緩沖溶液A中，加入木瓜蛋白酶和質量濃度25%戊二醛水溶液，室溫下攪拌8 Mh，抽濾，濾餅C用與所述的醋酸緩沖溶液A相同的醋酸緩沖液B充分洗滌，過濾，濾餅即獲得固定化木瓜蛋白酶；所述氨化紙纖維與木瓜蛋白酶的質量比為1 0.006，所述25%戊二醛水溶液的體積用量以氨化紙纖維質量計為0.317ml/g。
3.如權利要求1或2所述的抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，其特征在于所述氨化紙纖維按如下方法制備將濾紙剪碎、水煮至爛，紗布過濾，濾餅a即紙纖維， 將紙纖維加入0. 1 0. 2mol/L的NaOH溶液A中攪拌2h，水洗至pH7. 0，抽濾，取濾餅b按質量體積比1 9加入0.5 lmol/L的NaOH溶液B，按與濾餅b質量體積比1 1加入環氧氯丙烷，60 70°C水浴攪拌反應30min，抽濾，濾餅c用去離子水充分洗滌后抽干，獲得濾餅d，再按與濾餅b質量比0.2 1加入對苯二胺，于45°C下反應30min，用蒸餾水充分洗滌，真空干燥至恒重，獲得氨化紙纖維。
4.如權利要求1所述的抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，其特征在于所述弱陰離子交換層析為DEAE-S印horose-FF層析，以pH8. 0含lmol/LNaCl的20mmol/L的 Tris-HCl作為洗脫液，線性梯度洗脫，收集第一洗脫峰，獲得所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段。
全文摘要
本發明公開了一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法將活化的固定化木瓜蛋白酶于pH5.00.1mol/L醋酸緩沖液中，加入抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體，30～60℃水浴反應4～24h，反應液抽濾，濾餅B為固定化木瓜蛋白酶回收利用，濾液B即為含單克隆抗體片段的水解液，采用弱陰離子交換層析對含單克隆抗體片段的水解液進行分離純化，獲得所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段；本發明方法操作簡便、純化步驟少、所得抗體片段純度高；本發明中制備的抗體片段只需經過一步純化就可達到90％以上的純度。
文檔編號C12P21/06GK102417920SQ20111040300
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者應國清, 易喻, 李慧娟, 梅建鳳, 王鴻, 陳建澍 申請人:浙江工業大學