專利名稱：一種特異性腫瘤殺傷細胞的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗腫瘤的細胞免疫治療，特別涉及一種特異性腫瘤殺傷細胞的制備。
背景技術：
腫瘤發病率逐年上升，傳統的手術、放療、化療三大模式中，化療是唯一的全身治療手段，但化療的有效率低(25-30%)、副反應大、耐藥性、只對分裂期細胞有效、嚴重的免疫抑制、對腫瘤干細胞無效六大缺陷，嚴重限制了臨床應用。“細胞免疫治療”作為一種全新的全身治療新技術應用于臨床，并獲得了有效率高、副反應小的良好效果，被越來越多的腫瘤病患所接受，因而成為腫瘤的第四大治療模式。目前國內外多用NK、TIL、CTL、或DC-CIK等技術進行腫瘤的細胞免疫治療，臨床療效雖遠高于化療，但回輸的效應細胞在體內存留時間短，有效率低仍是目前亟待解決的瓶頸問題。基礎研究證實，腫瘤一旦形成，就會形成“腫瘤微環境”，產生大量的免疫抑制因子如IL-10、TGF-i3、IL-6等，同時調節性T淋巴細胞(Treg)水平大幅升高，結果導致病人本身的免疫系統不能辨認和清除體內的腫瘤細胞，致使腫瘤無限制生長，我們稱之為腫瘤的 “免疫耐受”或“免疫逃逸”。因而只要這些免疫抑制因素存在，體外制備的效應細胞回輸體內后很快被抑制，體內的存留時間只有3-5天，嚴重影響了效應細胞對腫瘤的殺傷效應。因而，消除以上免疫抑制因素，是打破腫瘤免疫耐受、提高免疫治療療效的關鍵。細胞免疫治療方法很多，上世紀初就出現了應用LAK細胞治療腫瘤的技術，但由于有效率低，療效不確切而被放棄。以后，人們逐一探討了 NK細胞、TIL細胞、CTL細胞、 DC疫苗等臨床應用的可行性，均因療效的不確切性而未被臨床認可。本世紀初，人們發現 DC-CIK細胞具有強大的腫瘤殺傷功能，并能在體內產生免疫記憶，有利于持續的免疫殺傷， 而且副反應小、安全性高，因而國內外臨床已廣泛推廣應用至今。DC-CIK技術的方法是從腫瘤病人外周血獲取單狀核細胞，體外分離出DC細胞 (貼壁)和T細胞(懸浮)。貼壁的DC細胞內加入GM-CSF、CI成熟化，第5-7天收集備用。懸浮的T細胞加入INF-γ沖擊，然后加入CIK細胞因子，每48小時擴增一次。第5-7天，將成熟DC和CIK細胞混合培養8-10天獲得DC-CIK，移至含有2. Og白蛋白的0. 9%生理鹽水中制備成DC-CIK效應細胞制劑，直接靜脈輸注治療(參照專利200510112381 )。上述方法存在的問題是①效應細胞制劑腫瘤殺傷力強但特異性相對差；②直接回輸后，在腫瘤微環境中IL-10、TGF-i3及Treg的免疫抑制下，效應細胞在體內的存留時間短(3-5天)，殺傷效率低；③所產生的免疫記憶也被抑制而不能發揮免疫激發功能，因而，臨床療效有限。本發明在于提供一種在干擾腫瘤微環境、打破腫瘤免疫耐受基礎上，DC-CIK-CTL 高效特異性細胞免疫治療的新技術，解決了現有DC-CIK技術存在的特異性差、體內存留時間短、殺傷效率低等瓶頸問題。本發明的方法是外周血獲得單狀核細胞，體外分離出DC細胞和T細胞。DC細胞經過5天的培養擴增并加入病人自體腫瘤相關全抗原至第7天成熟，獲得腫瘤特異性DC疫苗備用。T細胞經過INF-γ沖擊后，應用CIK細胞因子擴增至第7天，半數移瓶加入DC疫苗激活制備腫瘤特異性CTL，另外半數繼續CIK擴增，至第10天收集CIK和CTL效應細胞， 混合移入含有2. Og人血白蛋白的250ml 0. 9%氯化鈉中，制備成高效DC-CIK-CTL。回輸前首先對病人實施微環境干擾，方法是環磷酰胺(CTX)600-1200mg靜脈滴入，2次/日，次日靜脈回輸DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。本發明還發現，單次應用小劑量替加氟或環磷酰胺(CTX)，能夠有效的降低腫瘤病人外周血調節性T淋巴細胞(Treg)的比率，同時能夠降低外周血中IL-10和TGF-β的量， 但并不能有效的殺傷腫瘤細胞。因而我們假設，盡管小劑量CTX的應用不能起到治療腫瘤的作用，但降低外周血Treg、IL-10和TGF- β含量，恰恰能夠達到消除腫瘤微環境中重要的免疫抑制因素，在此基礎上實施細胞免疫治療，可以有效的延長回輸的效應細胞在體內的存留時間，強化細胞免疫對腫瘤的殺傷效應，獲的更高的臨床療效。基于以上發現，我們建立了本發明，即首先應用小劑量替加氟和CTX對腫瘤病人進行預處理，然后給予DC-CIK-CTL高效特異性殺傷細胞，進行細胞免疫治療。經過實驗室研究、動物實驗研究及臨床試驗研究，獲得大量研究數據，證實了該技術的有效性和安全性。目前臨床應用替加氟和CTX，目的是化療，用量分別是替加氟800-1000mg，總量 20g-40g —療程，CTX 500-1000mg/m2,每周1次，此劑量是化療的常規劑量，具有較大的副反應，而小劑量雖可降低副反應，但達不到化療目的。本技術應用小劑量替加氟和CTX，目的不是化療，而是降低外周血Treg、IL-10和 TGF- β的含量，達到干擾腫瘤微環境，打破腫瘤免疫耐受的療效，為隨后進行的細胞回輸治療創造環境，因而目的和用途是不同的。本技術應用了替加氟和CTX復合制劑，對腫瘤病人進行預處理，使外周血Treg、 IL-10和TGF-β等免疫抑制因素顯著降低，在此基礎上，回輸的效應細胞在體內的存留時間顯著延長，達到20-30天，腫瘤的殺傷效率明顯提高，使臨床總體療效提高到68%。所以， 本技術是國際國內最新研究成果，也是最合理的臨床治療模式。

發明內容
本發明的主要目的在于解決目前DC-CIK方法腫瘤殺傷率低、臨床有效率低的瓶頸問題，應用本技術，可以顯著提高腫瘤的殺傷效率，提高臨床有效率和客觀療效。為保證上述技術的實施，本發明提供了一種特異性腫瘤殺傷細胞的制備方法，本發明的制備方法，包括以下步驟
步驟1，外周血采集單狀核細胞； 步驟2，DC和T細胞分離； 步驟3，DC成熟和DC疫苗制備； 步驟4，CIK制備； 步驟5，CTL制備；
步驟6，特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備。其中，步驟1的外周血采集單狀核細胞的方法如下應用COBE SPECTRA細胞成分分離機，按照說明書設定參數設定程序，外周血循環 6000-8000ml，采集單狀核細胞120_140ml。分裝入50ml離心管，日立細胞離心機1500轉 /分離心5分鐘。收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清(方法加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉/分離心5分鐘，收集上清)，4°C冷藏備用。收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液(FicOll，1.077)15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機離心2000rpmX15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層(單狀核細胞)。分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清。加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清。重復洗滌3次后，加入1640培養基，細胞計數(細胞總數量6-10X109)。其中，步驟2的DC和T細胞分離的方法如下
175cm2培養瓶分別加入1640無血清培養基20ml，室溫下放置20分鐘行培養瓶活化。 將單狀核細胞平均分裝到培養瓶中，細胞濃度控制在IX IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為T細胞，剩余貼壁細胞即為DC細胞。其中，步驟3的DC成熟和DC疫苗制備的方法如下
貼壁的DC細胞中加入無血清DC培養基20ml (含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，慶大霉素2. 0萬單位/500ml)，置于37°C，5%0)2飽和濕度培養箱中擴增培養5 天。第6天加入自體腫瘤相關全抗原50ug/ml (自體腫瘤相關抗原制備方法新鮮腫瘤組織0. 5cm3，剪除腫瘤周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量)，次日補充10-15%的自體血清， 培養2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶83、HLA-DR表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療(附圖1-5)。其中，步驟4的CIK制備的方法如下
取175cm2培養瓶，分別加入AIM-V無血清培養基20ml (含IFN- y 50ug/500ml ；慶大霉素2萬單位/500ml)，將懸浮的T細胞移入，置于37°C，5%0)2細胞培養箱中培養。次日， 補充半量的CIK培養基(該培養基為AIM-V無血清培養基500ml，含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬單位)。第5天補充IL-2培養基(該培養基為=AIM-V無血清培養基500ml，含IL-2 15ug，慶大霉素2萬單位)。以后根據培養液顏色適量補充IL-2培養基，每次補充40%以上。第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養瓶中，作為CTL培養，剩余半量繼續作為CIK培養。其中，步驟5的CTL制備的方法如下
第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制為5 :1，繼續培養3天獲取CTL (附圖6_9)。其中，步驟6的高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備的方法如下
第10天分批取DC疫苗1-2X107復蘇、洗滌后、和數量分別為0.5X109的CIK和CTL 細胞混合，細胞總數量控制為1-2 X IO9,加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3_6次去除細胞碎片，移入200ml回輸用生理鹽水瓶，(該生理鹽水中含1%人血白蛋白2. 0g, IL-2 20萬單位)，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑(細胞數量控制在1-2X109)，4°C環境輸送病房備用。
通過以上方法得到的特異性DC-CIK-CTL細胞，在經過常規的制劑學處理后可以得到用于治療的細胞制劑。因此本發明還包括，含有本發明特異性DC-CIK-CTL細胞的細胞制劑。本發明的另一個內容是，用本發明的細胞制劑治療腫瘤病人，其方法是將本發明制備的特異性DC-CIK-CTL細胞制劑回輸到腫瘤病人體內。本發明還包括制備一種干擾微環境制劑，該制劑為注射用替加氟和CTX，注射用替加氟和CTX均為小劑量，以干擾腫瘤微環境為目的，而不以抗腫瘤為目的，兩種制劑的制備方法依據制劑學常規技術制備即可，如制備成水針或粉針，也可直接制備成輸液劑。以上制劑的劑量范圍分別為可一次性用于病人的劑量，如靜脈注射用替加氟一次用量為800mg， CTX 一次用量為300-400mg/m2，制備成的制劑可直接輸注，也可加入含有0. 9%氯化鈉或 5%-10%的葡萄糖注射液中給病人輸注，兩種制劑可單獨使用，也可混合使用，必要時可制備成復方藥物制劑。本發明還包括一種組合試劑，其特征在于，包括制備特異性DC-CIK-CTL細胞及其制劑的全部需要使用的試劑，試劑的名稱如下
DC-CIK-CTL組合試劑
1.單核巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)；
2.白細胞介素4(IL-4)；
3.慶大霉素；
4.自體腫瘤相關全抗原；
5.IFN- γ ；
6.CD3單抗；
7.白細胞介素-2(IL-2)；
8.0. 9%氯化鈉；
9.人血白蛋白；
10.注射用白細胞介素-2(IL-2)； 干擾腫瘤微環境組合制劑
1.09%氯化鈉；
2.注射用替加氟；
3.注射用環磷酰胺； 試劑的劑量如下
DC-CIK-CTL組合試劑的劑量和終濃度如下
1.GM-CSF :50ug/500ml ；
2.IL-4 :30ug/500ml ；
3.慶大霉素2.0萬單位/500ml ；
4.自體腫瘤相關全抗原50ug/ml；
5.IFN-y :50ug/500ml ；
6.CD3 單抗:25ug/500ml ； 7.IL-2 :15ug/500ml ；
8. 0. 9% 氯化鈉200ml ；9.人血白蛋白:2.Og ；
10.注射用白細胞介素-2(IL-2):20萬U; 干擾腫瘤微環境組合制劑的劑量如下
1.0. 9% 氯化鈉500ml ；
2.注射用替加氟800mg；
3.注射用環磷酰胺300-400mg/m2；
本發明還包括一種組合包裝，其特征在于，將權利要求6中的注射用替加氟和注射用 CTX分別裝入到各自的容器中，再一同裝入同一包裝盒中形成組合包裝。本發明的細胞制劑和干擾微環境制劑的使用方法如下
細胞培養的第9天，開始應用干擾微環境制劑對病人進行前處理，方法為替加氟 IOOOmg加入5%的葡萄糖或0. 9%的生理鹽水500ml靜脈輸注，環磷酰胺(CTX)400_600mg加入0. 9%的生理鹽水20ml靜脈推注或入壺，1次/日，連續2天。細胞培養第11天，細胞回輸治療，方法為采用帶濾器輸血袋，生理鹽水IOOml靜脈點滴(沖袋)，換細胞制劑200ml靜脈輸注，速度40-60滴/分，期間每5-10分鐘輕柔搖晃輸液瓶(袋)，保持細胞混懸狀態。細胞輸注完成后，換生理鹽水IOOml靜脈點滴(沖洗輸液器)。細胞回輸治療每日2次，上下午分開，共6次3天完成。細胞回輸當日行DC疫苗局部淋巴結注射接種，以后每周接種一次共三次。細胞回輸當日起IL-2 100萬U肌肉注射，2次/日，連續5天。干擾微環境制劑處理前1天和處理后4天分別采取外周血(抗凝)，流式細胞學(FCM)檢測Treg (⑶4+⑶25+) 水平，ELISA法檢測IL-10和TGF-β水平(附圖10-12)。本發明的優點在于，通過干擾腫瘤微環境能夠有效降低腫瘤病人外周血中IL-10、 TGF-β等免疫抑制因子及調節性T淋巴細胞(Treg)水平，打破腫瘤免疫耐受，在此基礎上回輸體外制備的高強度、特異性腫瘤殺傷細胞(DC-CIK-CTL)進行細胞免疫治療，可以有效延長效應細胞在體內的存留時間；同時，在打破腫瘤免疫耐受基礎上實施DC疫苗接種，能夠有效激發體內特異性腫瘤免疫，從而實現體內、體外雙途徑腫瘤殺傷效應，提高細胞免疫治療的臨床療效(附圖13-15)。本技術的意義在于，提出了一種全新的細胞免疫治療理念，即“打破腫瘤免疫耐受基礎上的細胞免疫治療”；提出了一種高效特異性腫瘤殺傷細胞(DC-CIK-CTL)的制備方法； 提出了一種在打破腫瘤“免疫耐受”基礎上實施高效特異性腫瘤殺傷的新技術、新方法。本技術解決了目前腫瘤免疫治療中效應細胞在體內存留時間短，腫瘤殺傷效率低，臨床療效低的瓶頸問題，大幅提高了細胞免疫治療的臨床療效。現有技術的主要缺陷是①、所制備的細胞制劑雖然殺傷力較強，但特異性較差； ②、雖然DC-CIK具有產生免疫記憶，誘導持續的腫瘤殺傷的優點，但由于體內的免疫抑制因素未被清除，抵消了持續腫瘤殺傷的功能；③、由于沒有打破腫瘤免疫耐受，回輸的 DC-CIK細胞，只能在體內存留3-5天，因而對腫瘤的殺傷效率低；④、臨床療效主要是改善患者生存質量，延長生存期，但腫瘤的客觀緩解率(腫瘤縮小或消失)不明顯。本技術的主要內容是實驗室制備高效率DC-CIK-CTL細胞制劑，回輸治療前，首先干擾腫瘤微環境，降低外周血Treg、L-IO及TGF-β水平，并使其低水平狀態保持4_10 天，從而打破腫瘤免疫耐受，解除免疫抑制因素(Treg、L-IO及TGF-β )對回輸效應細胞的免疫抑制，然后進行細胞回輸治療。優勢在于①、效應細胞DC-CIK-CTL，具備強大的殺傷功能，同時具備較高的特異性，對腫瘤的殺傷效率明顯增高，較DC-CIK有顯著的優勢；②、 同樣產生免疫記憶，并能誘導持續的腫瘤殺傷，而且由于打破了腫瘤的免疫耐受，消除了免疫抑制因素，免疫記憶功能不被抵消；③、由于打破了腫瘤免疫耐受，回輸的DC-CIK-CTL效應細胞在體內的存留時間顯著延長，能持續存在30天以上，因而對腫瘤的殺傷效率高；④、 臨床療效顯著提高，特別是對腫瘤的客觀有效率顯著提高。


附圖1. DC疫苗制備流程示意圖
附圖2. DC細胞不同培養時期的鏡下形態。培養的1-5天，屬于未成熟DC，形態特點是類圓形，細胞表面無樹突樣結構平滑，缺少樹突樣結構。隨培養時間延長，細胞表面逐漸出現樹突樣結構。加入抗原后培養2天，DC成熟，細胞表面呈典型的樹突樣突起，如電鏡圖所
7J\ ο附圖3. DC疫苗制備成功后，DC細胞表面的重要細胞因子表達顯著增高。⑶80、 ⑶83、⑶86、HLA-DR的表達，在未成熟DC (im-DC)十分低下，因而不具備抗原提呈功能；而在成熟DC (m-DC)的表達顯著增高，抗原提呈功能強大。附圖4.體外制備的DC疫苗，其標志性細胞因子IL-12的分泌量顯著升高。附圖5.攜帶腫瘤抗原的DC疫苗，能有效的激活自體T細胞和同種異體T細胞，且在DC:T為1 :20時，激活效率最高。附圖6.攜帶腫瘤抗原的DC疫苗，在第一信號和第二信號的共同參與下，能夠有效的激活T細胞，制備成腫瘤特異性CTL。第一信號即，DC表面的MHC分子提供抗原給T細胞表面的T細胞受體(TCR)；第二信號即，DC表面的B7分子(⑶80、⑶86)激活T細胞表面的⑶觀分子。附圖7. DC細胞激活T細胞的電鏡示意圖
附圖8.體外制備的CTL，其標志性細胞因子INF-γ的分泌量顯著增高。附圖9.體外制備的自體腫瘤特異性CTL，對腫瘤的特異性殺傷能力顯著增強。附圖10.應用CTX處理后，Treg的水平顯著下調至正常人水平，從而消除Treg對免疫系統的免疫抑制效應。附圖11.應用CTX處理后，IL-10水平顯著下調至正常人水平。附圖12.應用CTX處理后，TGF-β水平顯著下調至低于正常人的水平。附圖13.應用CTX處理后，熒光標記的效應細胞在腫瘤組織內存留時間長達30天以上，因而腫瘤殺傷效率明顯提高。附圖14.動物實驗表明，干擾腫瘤微環境條件下，DC誘導的腫瘤特異性CTL，對腫瘤的特異性殺傷能力顯著增強。附圖15.在干擾腫瘤微環境基礎上，肺癌病人應用本DC疫苗聯合DC-CIK-CTL過繼回輸治療，一個療程后，腫瘤縮小50%以上。
具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例1
特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備，包括以下步驟 步驟1的外周血采集單狀核細胞的方法如下應用COBE SPECTRA細胞成分分離機，按照說明書設定參數設定程序，外周血循環 6000-8000ml，采集單狀核細胞120_140ml。分裝入50ml離心管，日立細胞離心機1500轉 /分離心5分鐘。收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清(方法加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉/分離心5分鐘，收集上清)，4°C冷藏備用。收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液(FicOll，1.077)15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機離心2000rpmX15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層(單狀核細胞)。分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清。加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清。重復洗滌3次后，加入1640培養基，細胞計數(細胞總數量6-10X109)。步驟2的DC和T細胞分離的方法如下
175cm2培養瓶分別加入1640無血清培養基20ml，室溫下放置20分鐘行培養瓶活化。 將單狀核細胞平均分裝到培養瓶中，細胞濃度控制在IX IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為T細胞，剩余貼壁細胞即為DC細胞。步驟3的DC成熟和DC疫苗制備的方法如下
貼壁的DC細胞中加入無血清DC培養基20ml (含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，慶大霉素2. 0萬單位/500ml)，置于37°C，5%0)2飽和濕度培養箱中擴增培養5 天。第6天加入自體腫瘤相關全抗原50ug/ml(自體腫瘤相關全抗原制備方法新鮮腫瘤組織0. 5cm3，剪除腫瘤周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量)，次日補充10-15%的自體血清， 培養2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶83、HLA-DR表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療(附圖1-5)。步驟4的CIK制備的方法如下
取175cm2培養瓶，分別加入AIM-V無血清培養基20ml (含IFN- y 50ug/500ml ；慶大霉素2萬單位/500ml)，將懸浮的T細胞移入，置于37°C，5%C02細胞培養箱中培養。次日，補充半量的CIK培養基(AIM-V無血清培養基500ml，含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬單位)。 第5天補充IL-2培養基(AIM-V無血清培養基500ml，含IL-2 15ug，慶大霉素2萬單位)。 以后根據培養液顏色適量補充IL-2培養基，每次補充40%以上。第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養瓶中，作為CTL培養，剩余半量繼續作為CIK培養。步驟5的CTL制備的方法如下
第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制為5 :1，繼續培養3天獲取CTL (附圖6_9)。步驟6的高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備的方法如下
第10天分批取DC疫苗1-2X107復蘇、洗滌后、和數量分別為0.5X109的CIK和CTL 細胞混合，控制細胞總數量控制為1-2 X 109，加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3_6次去除細胞碎片，移入200ml回輸用生理鹽水瓶，(含1%人血白蛋白2. 0g, IL-2 20萬單位)，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑(細胞數量控制在1-2 X 109，4°C環境輸送病房備用。實施例2
干擾微環境制劑的制備方法和用法成人按照靜脈注射用替加氟lOOOmg，CTX 300-400mg/m2,計算病人用藥劑量。一般采取替加氟800mg加入0. 9%的生理鹽水500ml，用20ml注射器抽取CTX 400-600mg,然后抽取0. 9%的生理鹽水20ml稀釋，制備成干擾腫瘤微環境制劑。治療時，首先靜脈輸注替加氟， 掌握速度為30-40滴/分，然后將CTX入壺或靜脈推注。治療前1天和治療后4天，分別采取外周血anl，抗凝，FCM檢測1Treg含量，ELISA檢測IL-10和TGF-β含量。
實施例3
本發明還包括一種組合試劑，其特征在于，包括制備特異性DC-CIK-CTL細胞及其制劑的全部需要使用的試劑，試劑的名稱如下 DC-CIK-CTL組合試劑
.11.單核巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)；
.12.白細胞介素4(IL-4)；
.13.慶大霉素；
.14.自體腫瘤相關全抗原；
.15.IFN-Y ；
.16.CD3 單抗；
.17.白細胞介素-2(IL-2)；
.18.0. 9%氯化鈉；
.19.人血白蛋白；
.20.注射用白細胞介素-2(IL-2)； 試劑的劑量如下
DC-CIK-CTL組合試劑的劑量和終濃度如下
.11.GM-CSF :50ug/500ml ；
.12.IL-4 :30ug/500ml ；
.13.慶大霉素2.0萬單位/500ml ；
.14.自體腫瘤相關全抗原50ug/ml；
.15.IFN-y :50ug/500ml ；
.16.CD3 單抗:25ug/500ml ； 17.IL-2 :15ug/500ml ；
.18.0. 9% 氯化鈉200ml ；
.19.人血白蛋白2.Og ；
.20.注射用白細胞介素-2(IL-2):20萬U; 干擾腫瘤微環境組合制劑
.4.09%氯化鈉；
.5.注射用替加氟；
.6.注射用環磷酰胺；
干擾腫瘤微環境組合制劑的劑量如下
.4.0. 9% 氯化鈉500ml ；
.5.注射用替加氟800mg；
.6.注射用環磷酰胺300-400mg/m2。
權利要求
1.一種特異性腫瘤殺傷細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，外周血采集單狀核細胞；步驟2，DC和T細胞分離； 步驟3，DC成熟和DC疫苗制備； 步驟4，CIK制備； 步驟5，CTL制備；步驟6，特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備。
2.根據權利要求1的制備方法，其特征在于，其中，步驟1的外周血采集單狀核細胞的方法如下應用COBE SPECTRA細胞成分分離機，循環外周血6000-8000ml，采集單狀核細胞 120-140ml，分裝入50ml離心管，離心機1500轉/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml 離心管，加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉/分離心5分鐘， 收集上清，得到自體血清，4°C冷藏備用；收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機離心2000rpmX 15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層，分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX10分鐘，棄上清，加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復洗滌3次后，加入1640培養基，細胞計數； 其中，步驟2的DC和T細胞分離的方法如下175cm2培養瓶分別加入1640無血清培養基20ml，室溫下放置20分鐘行培養瓶活化， 將單狀核細胞平均分裝到培養瓶中，細胞濃度控制在IX IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為T細胞，剩余貼壁細胞即為DC細胞；其中，步驟3的DC成熟和DC疫苗制備的方法如下貼壁的DC細胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，慶大霉素2. 0萬單位/500ml的無血清DC培養基20ml，置于37°C，5%C02飽和濕度培養箱中擴增培養5天，第 6天加入自體腫瘤相關抗原50ug/ml，其中，自體腫瘤相關全抗原制備方法新鮮腫瘤組織 0. 5cm3，剪除腫瘤周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量；次日補充10-15%的自體血清，培養2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶83、HLA-DR表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療； 其中，步驟4的CIK制備的方法如下取175cm2培養瓶若干，分別加入含IFN-Y 1000U/ml，慶大霉素2萬單位/500ml的 AIM-V無血清培養基20ml，將懸浮的T細胞移入，置于37°C，5%C02細胞培養箱中培養，次日， 補充半量的CIK培養基(AIM-V無血清培養基500ml，含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬單位)， 第5天補充IL-2培養基(AIM-V無血清培養基500ml，含IL_2 15ug，慶大霉素2萬單位)，以后根據培養液顏色，每次補充40 %以上的IL-2培養基，第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK 細胞的一半量移至DC培養瓶中，作為CTL培養，剩余半量繼續作為CIK培養； 其中，步驟5的CTL制備的方法如下第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制為5 :1，繼續培養3天獲取CTL ；其中，步驟6的高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備方法如下 第10天分批取DC疫苗1-2X107復蘇、洗滌后、和數量分別為0.5X109的CIK和CTL 細胞混合，細胞總數量控制為1-2 X IO9,加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3_6次去除細胞碎片，移入200ml回輸用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20萬單位的生理鹽水瓶，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑，4°C環境保存。
3.根據權利要求1的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，外周血采集單狀核細胞；步驟2，DC和T細胞分離；步驟3，DC成熟和DC疫苗制備；步驟4，CIK制備；步驟5，CTL制備；步驟6，特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備； 其中，步驟1的外周血采集單狀核細胞的方法如下應用COBE SPECTRA細胞成分分離機，循環外周血6000-8000ml，采集單狀核細胞 120-140ml，分裝入50ml離心管，離心機1500轉/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml 離心管，加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉/分離心5分鐘， 收集上清，得到自體血清，4°C冷藏備用；收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機離心2000rpmX 15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層，分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX10分鐘，棄上清，加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復洗滌3次后，加入1640培養基，細胞計數； 其中，步驟2的DC和T細胞分離的方法如下175cm2培養瓶分別加入1640無血清培養基20ml，室溫下放置20分鐘行培養瓶活化， 將單狀核細胞平均分裝到培養瓶中，細胞濃度控制在IX IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為T細胞，剩余貼壁細胞即為DC細胞；其中，步驟3的DC成熟和DC疫苗制備的方法如下貼壁的DC細胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，慶大霉素2. 0萬單位/500ml的無血清DC培養基20ml，置于37°C，5%C02飽和濕度培養箱中擴增培養5天，第 6天加入自體腫瘤相關全抗原50ug/ml，其中，自體腫瘤相關抗原制備方法新鮮腫瘤組織 0. 5cm3，剪除腫瘤周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量；次日補充10-15%的自體血清，培養2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶83、HLA-DR表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療； 其中，步驟4的CIK制備的方法如下取175cm2培養瓶，分別加入含IFN- y 50ug/500ml，慶大霉素2萬單位/500ml的AIM-V 無血清培養基20ml，將懸浮的T細胞移入，置于37°C，5%C02細胞培養箱中培養，次日，補充半量的CIK培養基(500ml AIM-V無血清培養基中含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬單位)，第.5天補充IL-2培養基(AIM-V無血清培養基500ml，含IL_2 15ug，慶大霉素2萬單位)，以后根據培養液顏色，每次補充40%以上的IL-2培養基，第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養瓶中，作為CTL培養，剩余半量繼續作為CIK培養；其中，步驟5的CTL制備的方法如下第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制為5 :1，繼續培養3天獲取CTL ；其中，步驟6的高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備的方法如下第10天分批取DC疫苗1-2X107復蘇、洗滌后、和數量分別為0.5X109的CIK和CTL 細胞混合，控制細胞總數量控制為1-2 X 109，加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3_6次去除細胞碎片，移入200ml回輸用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20萬單位的生理鹽水瓶，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑，4°C環境保存。
4.含有權利要求1的方法制備的特異性DC-CIK-CTL細胞。
5.含有權利要求1的方法制備的特異性DC-CIK-CTL細胞的細胞制劑。
6.一種干擾微環境制劑，該制劑為注射用替加氟和注射用CTX，其特征在于，注射用替加氟和注射用CTX均為小劑量，以干擾腫瘤微環境為目的，而不以抗腫瘤為目的；制劑的劑量范圍分別為一次性用于病人的劑量，注射用替加氟一次用量為800mg，注射用CTX—次用量為 300-400mg/m2。
7.根據權利要求6的制劑，其特征在于，制備成的制劑可直接輸注，也可加入含有0.9% 氯化鈉或5%-10%的葡萄糖注射液中靜脈輸注。
8.根據權利要求6的制劑，其特征在于，注射用替加氟和注射用CTX是水針、粉針或輸液劑。
9.一種組合試劑，其特征在于，包括制備特異性DC-CIK-CTL細胞及其制劑的全部需要使用的試劑。
10.一種組合包裝，其特征在于，將權利要求6中的注射用替加氟和注射用CTX分別裝入到各自的容器中，再一同裝入同一包裝盒中形成組合包裝。
全文摘要
本發明涉及一種抗腫瘤的細胞免疫治療技術，特別涉及一種特異性腫瘤殺傷細胞的制備，本發明的制備方法，包括以下步驟步驟1，外周血采集單狀核細胞；步驟2，DC和T細胞分離；步驟3，DC成熟和DC疫苗制備；步驟4，CIK制備；步驟5，CTL制備；步驟6，特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備。
文檔編號C12N5/078GK102526716SQ20111040258
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者杰弗里·梅德因, 蔡建輝, 馬云龍 申請人:蔡穎