專利名稱：一種從牡蠣提取物酶解產生多肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種從牡蠣提取物酶解產生多肽的方法。
背景技術：
有“海洋牛奶”之稱的牡蠣，占我國海洋水產養殖總產量的三分之一，有著價格低廉、產量豐富，蛋白質含量高等優點。長久以來，人們就認識到牡蠣的利用價值，對其進行了大力開發，出現了一系列的牡蠣制品，如凍干牡蠣肉，牡蠣超微粉，牡蠣牛磺酸，牡蠣殼活性鈣，牡蠣肽等。隨著工業生產技術的發展，新產品的不斷出現，牡蠣的應用也越來越廣泛，但對牡蠣的應用最好莫過于利用其高蛋白質含量生產多肽。人體很多活性物質都是以肽的形式存在的，沒有肽，就沒有活性，就沒有生命。肽涉及人體的激素、神經、細胞生長和生殖各領域，其重要性在于調節體內各個系統和細胞的生理功能，激活體內有關酶系，促進中間代謝膜的通透性，或通過控制DNA轉錄或影響特異的蛋白合成，最終產生特定的生理效應。肽是涉及人體內多種細胞功能的重要物質。肽可以合成細胞，并調節細胞的功能活動。肽在人體作為神經遞質，傳遞信息。肽可在人體作為運輸工具，將人體所食的各種營養物質與各種維生素、生物素、鈣及對人體有益的微量元素輸送到人體各細胞、器官和組織。肽是人體重要的生理調節物，它可全面調節人體生理功能， 增強和發揮人體生理活性，它具有重要的生物學功能。肽對人的細胞活性、功能活動、生命存在非常重要。然而用傳統的方式生產多肽，其分子量無法控制，功能性難以體現，分子量無法控制，生產的多肽有苦味，這種多肽不但沒有保健作用，而且有副作用。在科技飛速發展的今天，用傳統的方式合成肽已經落后了，已不適應現代科技對生產多肽的要求，引領多肽生成的方法是酶法。利用酶法水解制備的蛋白水解產物富含具有多種生理活性的多肽和氨基酸。這些肽具有優良的持水性、凝膠性、乳化性、溶解性、滲透性及抗氧化性，已在世界范圍內引起關注，成為科技界、醫學界、營養學界、食品界、企業界研究、開發、生產的熱點，酶法多肽產業是跨世紀的一種新的朝陽產業，發展前景非常可觀。國內針對牡蠣的應用開發已開展了很多研究工作，如陳騫、楊瑞金、顧聆琳“牡蠣糖原的研究(I)——牡蠣糖原的分離提取和化學組成”《食品科學》，2005，26 (6) :99-101。 又如汪秋寬、何云海、徐玲等“牡蠣糖蛋白的純化分離研究”，《沈陽農業大學學報》，2007， 38(2) :211-214。再如劉亞南、張志勝、佟海菊等“響應面法優化中性蛋白酶提取牡蠣牛磺酸酶解工藝條件”，《食品科學》，2011，7 :25。但是，這些研究工作及牡蠣產品大多只關注牡蠣中牛磺酸的生理功能及營養價值或牡蠣的全營養功能方面，而且在生產過程中采用的是傳統繁雜的分離技術及工藝方法，產品中的活性成分含量相對較低。又如王一兵、柯珂、何碧娟等“廣西近江牡蠣酶解工藝研究”《食品研究與開發》，2011,32 :16，其采用胰蛋白酶制備的方法是超聲波方法，還需要特殊的設備。又如汪秋寬、宋琳琳、徐玲等“牡蠣抗氧化活性肽的酶解工藝研究”《大連水產學院學報》，2009，24( 95)中的工藝研究目的在于 “以木瓜蛋白酶和中性蛋白酶為工具酶，尋找最佳的抗氧化活性產物”，結果表明當時間為150min、酶用量為6%、溫度為45°C、pH為7. 0時，木瓜蛋白酶酶解液的抗氧化活性最強。這些文獻公開的技術，主要針對生牡蠣，且其操作步驟復雜、煩瑣；所得產物分子量范圍與本發明的產物特征均不同。

發明內容
本發明的目的在于克服傳統方式生成的多肽所產生的缺陷，進而對酶催化水解進行較為系統的研究，從而提供一種簡單、有效、安全且產率較高的從牡蠣提取物酶解產生多肽的方法。本發明的目的是通過如下技術方案實現的一種牡蠣提取物酶解產生多肽的方法，具體包括如下步驟1)溶酶稱取一定量牡蠣提取物粉末，加入一定量的適合溫度的水完全溶解。稱取木瓜蛋白酶加入牡蠣溶液中，攪拌均勻，用酸度計測定PH值，并用醋酸調節pH值至弱酸性；所述溶酶所用水加入倍數為牡蠣提取物的重量的8 12倍，優選10倍；所述木瓜蛋白酶加入量為牡蠣提取物的重量比優選7% 20%，最佳用量為 12% ；所述調節混合溶液的pH值至5. 6 6. 4，優選5. 8 6. 0。2)酶解將上述溶液放于一定溫度的水浴鍋中加熱，恒溫酶解，而后升溫，恒溫滅酶 30min。所述恒溫酶解溫度為45 V 65°C，優選55°C 65°C .最佳60 V。所述恒溫酶解時間為60min 120min，優選90min 120min。最佳為90min。所述恒溫滅酶溫度為90°C 100°C。本發明提供的牡蠣提取物酶解方法能有效地提取牡蠣中的多肽，該方法與現有技術的提取方法相比，其優點在于1)操作簡單，成本低廉；2)安全可靠，不會造成環境污染；3)不減蛋白質營養價值，可保持多肽營養純天然綠色屬性，不含任何化學物質；4)酶解出來的多肽，沒有任何苦味和異味，不會引起過敏。改善原食品蛋白質的一些過敏原，可增加原食品蛋白質沒有的重要的生物學功能。5)產率穩定，適合工業化生產，具有很高的應用價值。6)本發明制備工藝所得到的酶解產物的特征氨基酸主要為精氨酸，其次是組氨酸和谷氨酸。其多肽分子量主要集中在SOOODa以下，其中以1400Da以下的居多，在85%左右，且各種肽的分子量比較集中，主要為小分子多肽，營養價值很高。可見其分子量容易控制，有很大的潛在價值。


圖1是木瓜蛋白酶溫度-多肽產量曲線圖。圖2是木瓜蛋白酶pH-多肽產量曲線圖。圖3是木瓜蛋白酶時間_多肽產量曲線圖。
圖4是木瓜蛋白酶加酶量-多肽產量曲線圖。圖5是木瓜蛋白酶加水倍數-多肽產量曲線圖。圖6、7、8、9、10是正交實驗的直觀分析圖。圖11是牡蠣提取物酶解產生多肽的相對分子量大小分布圖。
具體實施例方式以下所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。實施例一不同溫度對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og (牡蠣提取物粉末按照中國專利941011 . 0公開的方法制備)，確定酶解時間為90min，酶解pH值為6.0，加木瓜蛋白酶為10%即0. 5g，加水 50ml。分別在溫度451、501、551、601、651下酶解901^11，取出在溫度為90°C到100°C 水浴中滅酶30min，離心QOOOr/min，15min)取上清液定容至100ml。實施例二不同PH對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og,確定酶解時間為90min，酶解溫度為55°C，加木瓜蛋白酶為10%即0. 5g，加水倍數為10倍(即50ml)，分別在pH值為5. 6、5. 8、6. 0、6. 2、6. 4 下酶解90min，取出在溫度為90°C到100°C水浴中滅酶30min，離心(轉速4000r/min，時間 15min)取上清液定容至100ml。實施例三不同時間對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og，確定酶解溫度60°C，酶解pH值為6. 0，加木瓜蛋白酶為 10% 即 0. 5g，加水倍數為 10 倍(即 501111)，分別酶解601^11、751^11、901^11、105111士11、 120min，取出在溫度為90°C到100°C水浴中滅酶30min，離心(轉速4000r/min，時間15min) 取上清液定容至100ml。實施例四不同加酶量對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og,確定酶解溫度60°C，酶解pH值為6. 0，加木瓜蛋白酶分別為牡蠣提取物粉末重量的1%>2%,4%,6%,8%,10%,12%,14%,16%,18%,20% ο 加水倍數為牡蠣提取物粉末10倍(50ml)，酶解90min，取出在溫度為90°C到100°C水浴中滅酶30min，離心(轉速4000r/min，時間15min)取上清液定容至100ml。實施例五不同加水倍數對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og,確定酶解溫度60°C，酶解pH值為6. 0，加木瓜蛋白酶為牡蠣提取物粉末重量的10%，加水倍數為牡蠣提取物粉末重量的8、9、10、11、12倍，酶解 90min，取出在溫度為90°C到100°C水浴中滅酶30min，離心(轉速4000r/min，時間15min) 取上清液定容至100ml。分別取實施例一、二、三、四、五中制備的牡蠣提取物酶解液，采用凱式定氮法測定樣品中的酸溶蛋白質，甲醛法測定游離性氨基酸態氮含量，計算粗多肽含量。實施例六粗多肽含量測定及實施例一、二、三、四、五的測定結果
1、酸溶蛋白質的測定方法(凱式定氮法):量取樣品10. 0ml，加入10. Oml 30%的三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置5min。用移液管取10. Oml于離心管中，在4000r/min下離心10分鐘，取全部上清液，加入消化管中，往消化管中滴加催化劑(硫酸鉀硒粉=99 1)適量，搖勻，再加入濃硫酸20ml，消化2小時。取出定容，取20ml消化液于蒸餾管中蒸餾，用2%硼酸溶液吸收，吸收液用0. lmol/L的鹽酸滴定。空白對照實驗不加樣品消化，其他操作與樣品相同。計算公式式=(^2)€χ0.0140χ625χ100
1Μ/100Xl-酸溶蛋白質含量g/100gVl-樣液定氮所耗鹽酸標準溶液的量，ml ；V2-空白對照定氮所耗鹽酸標準溶液的量，ml ；C-鹽酸標準溶液的濃度，mol/L ；M-酶解時所稱樣品的質量，g。2、游離性氨基酸態氮含量測定方法(甲醛法)于200ml燒杯中吸取20. Oml酶解液，加60ml蒸餾水，開啟磁力攪拌器，待攪拌穩定后把酸度計的復合電極小心放入燒杯中，用0. lmol/L的氫氧化鈉溶液滴定到酸度計指示PH值為8. 2，準確加入10. OOml的甲醛溶液，混勻，再用0. lmol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定至PH值為9. 2，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積。同樣量取80ml蒸餾水，先用0. 05mol/L的氫氧化鈉標準溶液調節pH值至8. 2，再加入100. lmol/L的甲醛溶液，用0. lmol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至pH值至9. 2，作為試劑空白對照。計算公式式JA=-X100
M15Xl-游離性氨基酸態氮g/100gVl-樣液定氮所耗氫氧化鈉標準溶液的量，ml ；V2-空白對照定氮所耗氫氧化鈉標準溶液的量，ml ；C-氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L ；M-酶解時所稱樣品的質量，g。3、粗多肽含量計算X = Xl-X2*6. 254、測定結果實施例一、二、三、四、五中制備的牡蠣提取物酶解液中多肽的測定結果見圖1、圖 2、圖3、圖4及圖5所示。從圖1 圖5可以看出，牡蠣提取物酶解最佳的適合條件是1)最佳酶解溫度優選55°C 65°C ；最佳60°C。2)最佳酶解時間優選90min 120min，最佳為90min。3)最佳酶解pH值5. 6 6. 4 ；優選5. 8 6. 04)最佳加酶量優選7% 20%，最佳用量為12%5)最佳加水倍數優選8 12倍，優選10倍。
實施例七正交試驗分析結果通過單因素分析，我們知道牡蠣提取物酶解生產多肽的酶選用木瓜蛋白酶，酶解溫度，時間，PH值，加酶量，加水倍數等，但各因素的相互作用仍然不是很明確，為了確定酶解的最適條件，設計5因素4水平的正交試驗，以多肽產量作為評價指標。選擇溫度、時間，加酶量、pH、加水倍數5個主要的工藝參數，酶解工藝的正交實驗結果如表1。表1酶解工藝正交實驗的設計及結果
權利要求
1.一種從牡蠣提取物酶解產生多肽的方法，包括如下步驟1)溶酶稱取牡蠣提取物粉末，加入8 12倍重量適合溫度的水完全溶解；稱取重量為牡蠣提取物7 % 20 %的木瓜蛋白酶加入牡蠣溶液中，攪拌均勻，用酸度計測定pH值，并用醋酸調節PH值至5. 6 6.4 ；2)酶解將上述溶液放于45°C 65°C的水浴鍋中加熱，恒溫酶解60min 120min，而后升溫，90°C 100°C恒溫滅酶30min。
2.如權利要求1所述的從牡蠣提取物酶解產生多肽的方法，其特征在于所述步驟1) 中的溶酶所用水加入倍數為牡蠣提取物的重量的10倍，木瓜蛋白酶加入量為牡蠣提取物的12%，調節混合溶液的pH值至5. 8 6. 0。
3.如權利要求1所述的從牡蠣提取物酶解產生多肽的方法，其特征在于所述步驟2) 中恒溫酶解溫度為55°C 65°C，酶解時間為90min 120min。
4.如權利要求3所述的從牡蠣提取物酶解產生多肽的方法，其特征在于所述步驟2) 中恒溫酶解溫度為60°C，酶解時間為90min。
5.一種從牡蠣提取物酶解產生的多肽，該酶解物特征是氨基酸主要為精氨酸，其次是組氨酸和谷氨酸；其多肽分子量主要集中在SOOODa以下，其中以1400Da以下的居多，在 85%左右，且各種肽的分子量比較集中，主要為小分子多肽。
全文摘要
本發明涉公開了一種牡蠣提取物的酶解提取方法，通過木瓜蛋白酶對牡蠣提取物進行酶解產生多肽，制備方法依次包括溶酶、調節pH值、酶解、滅酶等幾個步驟。該方法優點在于1)產物特征為氨基酸主要為精氨酸，其次是組氨酸和谷氨酸。其多肽分子量主要集中在8000Da以下，其中以1400Da以下的居多，在85％左右，且各種肽的分子量比較集中，主要為小分子多肽，營養價值很高。2)操作簡單，成本低廉；3)安全可靠，不會造成環境污染；4)產率穩定，合工業化生產，具有很高的應用價值。
文檔編號C12P21/06GK102443618SQ20111040360
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者嚴啟新, 馮漢林, 劉碧秀, 康暉, 王兵, 高媛 申請人:深圳海王藥業有限公司