專利名稱：一種體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cell, hAECs)具有干細(xì)胞特性， 在適宜誘導(dǎo)條件下可分化成內(nèi)皮和肝上皮樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞樣細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。此外，hAECs還具有低免疫原性、來源豐富、易于富集、擴(kuò)增能力強(qiáng)、不牽涉醫(yī)學(xué)倫理問題等優(yōu)勢，在再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景。I型糖尿病的發(fā)生與遺傳因素、環(huán)境因素及免疫機(jī)制有關(guān)，其根本的病因病機(jī)是胰腺B細(xì)胞破壞致胰島素分泌不足。I型糖尿病病人必須終生依賴胰島素治療才能維持生命。盡管胰腺或胰島移植移植可望成為治療I型糖尿病的理想方法，但因其組織供源、免疫排異、技術(shù)難度等問題而受頗多限制。鑒于hAECs具有多系分化能力和免疫豁免特性，誘導(dǎo)其分化為胰島素分泌細(xì)胞(insulin secreting cells, ISCs)為治療I型糖尿病提供新的供體細(xì)胞無疑具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種使hAECs分化為ISCs的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案一種體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟
(1)分離hAECs采用機(jī)械法剝離胎盤羊膜組織，用D-Hank’ s液反復(fù)沖洗，除盡表面血跡，剪碎羊膜后分裝于離心管內(nèi)，加入含有0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶溶液，37°C消化10 min，棄消化液；37°C、200 r/min旋轉(zhuǎn)消化30 min,250目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞懸液， 加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化；組織碎片用同樣方法重復(fù)消化2次；合并3次收集的細(xì)胞懸液經(jīng)300目不銹鋼網(wǎng)過濾，濾液1500 r/min離心10 min，棄上清，再懸浮細(xì)胞；800 r/min離心6 min,棄上清，收獲細(xì)胞即為人羊膜上皮細(xì)胞；用低糖-DMEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清和10 mg/L表皮生長因子)重新懸浮細(xì)胞，以3X IO8 L—1細(xì)胞密度接種于T25培養(yǎng)瓶，置37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%ω2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；備作CK-19檢測；
(2)鑒定hAECs取第2代hAECs行波形蛋白和CK19免疫組織化學(xué)染色，hAECs表達(dá) CK19而不表達(dá)波形蛋白；用流式細(xì)胞儀檢測⑶四、⑶73、⑶166、⑶；34和⑶45，hAECs的表型特征為高表達(dá)⑶四、⑶73和⑶166，但不表達(dá)⑶34一⑶45 ；
(3)誘導(dǎo)hAECs向ISCs分化誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含lOmmol/L尼克酰胺和隊(duì)補(bǔ)充物(含牛血清白蛋白、胰島素、亞硒酸鈉、腐胺和黃體酮)的無血清HG-DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司，貨號1觀00-017 ；葡萄糖含量為4500mg/L);取第2代hAECs用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基懸浮，以 2. 5X IO6個/ml細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，第三天用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基換液1次，hAECs經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)其誘導(dǎo)培養(yǎng)7天即分化為ISCs ；(4) ISCs的鑒定hAECs誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，①取培養(yǎng)物上清液，采用放射免疫法檢測胰島素含量；②收集部分細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)檢測胰島素基因 mRNA和調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育及胰島B細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源異型盒因子-1 (pancreatic and duodenal homeobox factor-1，PDX-1)基因 mRNA 的表達(dá)。
本發(fā)明達(dá)到的有益效果PDX-1是調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育和胰島B細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，不但參與早期階段胰腺的特化及胰芽的形成，還參與胰腺細(xì)胞的分化。hAECs經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)7天有胰島素基因和PDX-I基因表達(dá)，培養(yǎng)物上清中的胰島素含量達(dá)320 μ IU/ml 以上，說明hAECs分化為ISCs。但未經(jīng)誘導(dǎo)的hAECs既無胰島素基因mRNA的表達(dá)，也檢測不到胰島素。本發(fā)明方法可在體外誘導(dǎo)hAMSCs分化為ISCs。經(jīng)本發(fā)明方法產(chǎn)生的ISCs及含有ISCs組合物可用于I型糖尿病I型糖尿病。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
—種體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟(1)分離hAECs采用機(jī)械法剝離胎盤羊膜組織，用D-Hank’ s液反復(fù)沖洗，除盡表面血跡，剪碎羊膜后分裝于離心管內(nèi)，加入含有0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶溶液，37°C消化10 min，棄消化液；37°C、200 r/min旋轉(zhuǎn)消化30 min,250目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞懸液， 加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化；組織碎片用同樣方法重復(fù)消化2次；合并3次收集的細(xì)胞懸液經(jīng)300目不銹鋼網(wǎng)過濾，濾液1500 r/min離心10 min，棄上清，再懸浮細(xì)胞；800 r/min離心6 min，棄上清，收獲細(xì)胞即為人羊膜上皮細(xì)胞；用低糖-DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco 公司，貨號31600-0 ；含1000mg/L葡萄糖、10%的胎牛血清、10 mg/L表皮生長因子)重新懸浮細(xì)胞，以3 X IO8 L—1細(xì)胞密度接種于T25培養(yǎng)瓶，置37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%ω2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；備作CK-19檢測；(2)鑒定hAECs取第2代hAECs進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，hAECs表達(dá)CK19而不表達(dá)波形蛋白；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，hAECs的表型特征為高表達(dá)⑶四、⑶73和⑶166，但不表達(dá) CD34 和 CD45 ；(3)誘導(dǎo)hAECs向ISCs分化誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含lOmmol/L尼克酰胺和隊(duì)補(bǔ)充物 ((購自Gibco公司，貨號17502048)的無血清高糖-DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司，貨號 12800-017 ；葡萄糖含量為4500mg/L);取第2代hAECs用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基懸浮，以2. 5 X IO6 個/ml細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%ω2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7天，第三天用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基換液1次。
(4) ISCs的鑒定hAECs誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，①取培養(yǎng)物上清液，采用放射免疫法檢測胰島素含量為328. 5 μ IU/ml ；②收集部分細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)檢測出胰島素基因mRNA和調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育及胰島B細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源異型盒因子-1 (pancreatic and duodenal homeobox factor-1, PDX-1)基因 mRNA 的表達(dá)，說明hAECs經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)7天即分化為ISCs。
權(quán)利要求
1. 一種體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟(1)分離hAECs采用機(jī)械法剝離胎盤羊膜組織，用D-Hank’ s液反復(fù)沖洗，除盡表面血跡，剪碎羊膜后分裝于離心管內(nèi)，加入含有0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶溶液，消化后棄消化液，再旋轉(zhuǎn)消化，250目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞懸液，加含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，組織碎片用同樣方法重復(fù)消化2次，合并3次收集的細(xì)胞懸液經(jīng)300目不銹鋼網(wǎng)過濾， 濾液離心棄上清，再懸浮細(xì)胞，離心棄上清，收獲細(xì)胞即為人羊膜上皮細(xì)胞，用低糖-DMEM 培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，以3X IO8 L—1細(xì)胞密度接種于Tm培養(yǎng)瓶，置37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%ω2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)鑒定hAECs取第2代hAECs波形蛋白和CK19免疫組織化學(xué)染色，用流式細(xì)胞儀檢測 CD29、CD73、CD166、CD34 和 CD45 ；(3)誘導(dǎo)hAECs向ISCs分化誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含lOmmol/L尼克酰胺和隊(duì)補(bǔ)充物無血清高糖-DMEM培養(yǎng)基；取第2代hAECs用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基懸浮，以2. 5 X IO6個/ml細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%ω2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，第三天用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基換液1次；hAECs經(jīng)上述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)其誘導(dǎo)培養(yǎng)7天即分化為ISCs ；(4)ISCs的鑒定hAECs誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，①取培養(yǎng)物上清液，采用放射免疫法檢測胰島素含量；②收集部分細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)檢測胰島素基因mRNA 和調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育及胰島B細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源異型盒因子-1基因 mRNA的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本發(fā)明的方法是將提取的hAECs經(jīng)含10mmol/L尼克酰胺和N2補(bǔ)充物的無血清HG-DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，經(jīng)本發(fā)明方法誘導(dǎo)的hAECs表達(dá)胰島素基因mRNA和PDX-1基因mRNA，培養(yǎng)物上清中的胰島素含量達(dá)330μIU/ml以上。本發(fā)明方法可在體外誘導(dǎo)hAECs分化為ISCs。
文檔編號C12N5/073GK102492651SQ20111040458
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者方寧, 趙玉潔, 陳代雄 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院