專利名稱：一種人羊膜的脫細胞方法
技術領域：
本發明涉及組織工程技術領域，尤其涉及一種人羊膜的脫細胞方法。
背景技術：
脫細胞技術是指通過一系列方法處理人和動物的組織和/或器官，使該組織和/或器官的細胞完全去除，而保留相應的細胞外基質的方法。它在組織工程支架的構建中起著重要的作用。羊膜，即人胎盤粘膜，是一光滑的、無血管、神經及淋巴的、具有彈性的半透明膜，厚約0.02、.5mm,由單層上皮細胞層、致密的基底膜以及無血管的基質等成份組成。羊膜基質中含有大量的膠原、纖粘連蛋白和層粘連蛋白等成份，是一種廉價易得、性能優良的組織工程支架材料。但將其作為一種切實可用的支架材料應用于組織構建的主要問題在于要克服其內在細胞所帶來的免疫原性。目前對羊膜組織的脫細胞處理的方法，主要在于采用表面活性劑或表面活性劑結合機械力刮除等，這些方法無法完整地保留羊膜細胞外基質，對羊膜基質的力學和化學等性能均有不同程度的損傷，而且脫細胞效率比較低，適用范圍比較窄。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種高效脫細胞的同時可完整地保留細胞外基質的人羊膜的脫細胞方法。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種人羊膜的脫細胞方法，包括以下具體過程:
(1)、將新鮮的人胎盤羊膜除去血塊和絨毛膜，留下包含上皮細胞層、基底膜和無血管基質的完整羊膜組織，并以PH值為7.4的磷酸緩沖液(簡稱PBS)清洗，得到一干凈半透明的羊膜；
(2)、取體積濃度為75%的酒精將上述得到的半透明羊膜漂洗I 2次，再用PBS漂洗2 4次,然后將青霉素和鏈霉素混合到PBS中形成雙抗/PBS溶液，所述的青霉素和鏈霉素又叫雙抗，其中青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100 300U/L，再將半透明羊膜按體積比為1:1 3的比例置于雙抗/PBS溶液中浸泡震蕩，每12小時換液一次，共兩次；
(3)、將雙抗、表面活性劑混合到PBS中形成綜合PBS溶液，其中:青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100 300U/L，表面活性劑占PBS的重量比為1%，并將半透明羊膜按體積比為1:1 3的比例置于綜合PBS溶液中浸泡震蕩，每6 8小時換液一次，共兩次，然后將半透明羊膜取出，用PBS漂洗I 2次；
(4)、將半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量為500 5000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜與胰脂酶/PBS溶液的體積比為1:1 3，并在溶液溫度為30 40°C下處理10 20小時，然后將半透明羊膜取出用PBS漂洗I 2次，再將半透明羊膜浸泡在DNA酶(又叫脫氧核糖核酸酶)含量為1000 3000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜與DNA酶/PBS溶液的體積比為1:1 3，在溶液溫度為30 40°C下處理3 5小時；(5)、將半透明羊膜從DNA酶/PBS溶液中取出，并將半透明羊膜置于青霉素與鏈霉素含量均為100 300U/L的雙抗/PBS溶液中震蕩漂洗，每12小時換液一次，共兩次，最后將脫細胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的溫度下保存待用。所述的表面活性劑采用Triton X-100 (曲拉通100)。與現有技術相比，本發明的優點在于該方法采用表面活性劑結合胰脂酶和DNA酶共同來脫除羊膜中的細胞，脂類是細胞膜的主要成份，DNA存在于細胞核中，是遺傳信息的攜帶者，胰脂酶和DNA酶能針對性地分別降解細胞膜和細胞核中的DNA，將二者結合起來使用可以促使羊膜中的細胞被高效徹底地脫去，同時最大程度地保留細胞外基質，使其不受損傷。另一方面，本發明針對真核細胞共同具有的結構成份進行處理，因此本發明適用于任何真核細胞的脫除，其使用具有普適性。
具體實施例方式以下對本發明作進一步詳細描述。實施例一:一種人羊膜的脫細胞方法，包括以下具體過程:
(1)、將新鮮的人胎盤羊膜除去血塊和絨毛膜，留下包含上皮細胞層、基底膜和無血管基質的完整羊膜組織，并以PH值為7.4的磷酸緩沖液(簡稱PBS)清洗，得到一干凈半透明的羊膜；
(2)、取體積濃度為75%的酒精將上述得到的半透明羊膜漂洗2次，再用PBS漂洗2次，然后將青霉素和鏈霉素混合到PBS中形成雙抗/PBS溶液，其中青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100U/L，再將半透明羊膜按體積比為1:1的比例置于雙抗/PBS溶液中浸泡震蕩，每12小時換液一次，共兩次；
(3)、將雙抗、表面活性劑混合到PBS中形成綜合PBS溶液，其中:青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100U/L，表面活性劑占PBS的重量比為1%，并將半透明羊膜按體積比為1:1的比例置于綜合PBS溶液中浸泡震蕩，每6小時換液一次，共兩次，然后將半透明羊膜取出，用PBS漂洗2次；
(4)、將半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量為1000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜與胰脂酶/PBS溶液的體積比為1:2，并在溶液溫度為30°C下處理20小時，然后將半透明羊膜取出用PBS漂洗I次，再將半透明羊膜浸泡在DNA酶含量為1000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜與DNA酶/PBS溶液的體積比為1: 2，在溶液溫度為40°C下處理3小時；
(5)、將半透明羊膜從DNA酶/PBS溶液中取出，并將半透明羊膜置于青霉素與鏈霉素含量均為100U/L的雙抗/PBS溶液中震蕩漂洗，每12小時換液一次，共兩次，最后將脫細胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的溫度下保存待用。實施例二:一種人羊膜的脫細胞方法，包括以下具體過程:
(1)、將新鮮的人胎盤羊膜除去血塊和絨毛膜，留下包含上皮細胞層、基底膜和無血管基質的完整羊膜組織，并以PH值為7.4的磷酸緩沖液(簡稱PBS)清洗，得到一干凈半透明的羊膜；
(2)、取體積濃度為75%的酒精將上述得到的半透明羊膜漂洗I次，再用PBS漂洗4次，然后將青霉素和鏈霉素混合到PBS中形成雙抗/PBS溶液，其中青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為200U/L，再將半透明羊膜按體積比為1:3的比例置于雙抗/PBS溶液中浸泡震蕩，每12小時換液一次，共兩次；
(3)、將雙抗、表面活性劑混合到PBS中形成綜合PBS溶液，其中:青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為300U/L，表面活性劑占PBS的重量比為1%，并將半透明羊膜按體積比為1:2的比例置于綜合PBS溶液中浸泡震蕩，每7小時換液一次，共兩次，然后將半透明羊膜取出，用PBS漂洗I次；
(4)、將半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量為3000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜與胰脂酶/PBS溶液的體積比為1:1，并在溶液溫度為35°C下處理15小時，然后將半透明羊膜取出用PBS漂洗2次，再將半透明羊膜浸泡在DNA酶含量為2000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜與DNA酶/PBS溶液的體積比為1:3，在溶液溫度為30°C下處理5小時；
(5)、將半透明羊膜從DNA酶/PBS溶液中取出，并將半透明羊膜置于青霉素與鏈霉素含量均為200U/L的雙抗/PBS溶液中震蕩漂洗，每12小時換液一次，共兩次，最后將脫細胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的溫度下保存待用。實施例三:一種人羊膜的脫細胞方法，包括以下具體過程:
(1)、將新鮮的人胎盤羊膜除去血塊和絨毛膜，留下包含上皮細胞層、基底膜和無血管基質的完整羊膜組織，并以PH值為7.4的磷酸緩沖液(簡稱PBS)清洗，得到一干凈半透明的羊膜；
(2)、取體積濃度為75%的酒精將上述得到的半透明羊膜漂洗2次，再用PBS漂洗3次，然后將青霉素和鏈霉素混合到PBS中形成雙抗/PBS溶液，其中青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為300U/L，再將半透明羊膜按體積比為1:2的比例置于雙抗/PBS溶液中浸泡震蕩，每12小時換液一次，共兩次；
(3)、將雙抗、表面活性劑混合到PBS中形成綜合PBS溶液，其中:青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為200U/L，表面活性劑占PBS的重量比為1%，并將半透明羊膜按體積比為1:3的比例置于綜合PBS溶液中浸泡震蕩，每8小時換液一次，共兩次，然后將半透明羊膜取出，用PBS漂洗2次；
(4)、將半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量為5000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜與胰脂酶/PBS溶液的體積比為1:3，并在溶液溫度為40°C下處理10小時，然后將半透明羊膜取出用PBS漂洗2次，再將半透明羊膜浸泡在DNA酶含量為3000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜與DNA酶/PBS溶液的體積比為1:1，在溶液溫度為35°C下處理4小時；
(5)、將半透明羊膜從DNA酶/PBS溶液中取出，并將半透明羊膜置于青霉素與鏈霉素含量均為300U/L的雙抗/PBS溶液中震蕩漂洗，每12小時換液一次，共兩次，最后將脫細胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的溫度下保存待用。上述實施例中，所用到的PBS (又叫磷酸緩沖液)的pH值均為7.4，表面活性劑采用北京中杉金橋生物技術有限公司提供 的Triton X-100。
權利要求
1.一種人羊膜的脫細胞方法，其特征在于包括以下具體過程: (1)、將新鮮的人胎盤羊膜除去血塊和絨毛膜，留下包含上皮細胞層、基底膜和無血管基質的完整羊膜組織，并以PH值為7.4的磷酸緩沖液(簡稱PBS)清洗，得到一干凈半透明的羊膜； (2)、取體積濃度為75%的酒精將上述得到的半透明羊膜漂洗1 2次，再用PBS漂洗2 4次,然后將青霉素和鏈霉素混合到PBS中形成雙抗/PBS溶液，所述的青霉素和鏈霉素又叫雙抗，其中青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100 300U/L，再將半透明羊膜按體積比為1:1 3的比例置于雙抗/PBS溶液中浸泡震蕩，每12小時換液一次，共兩次； (3)、將雙抗、表面活性劑混合到PBS中形成綜合PBS溶液，其中:青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100 300U/L，表面活性劑占PBS的重量比為1%，并將半透明羊膜按體積比為1:1 3的比例置于綜合PBS溶液中浸泡震蕩，每6 8小時換液一次，共兩次，然后將半透明羊膜取出，用PBS漂洗1 2次； (4)、將半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量為500 5000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜與胰脂酶/PBS溶液的體積比為1:1 3，并在溶液溫度為30 40°C下處理10 20小時，然后將半透明羊膜取出用PBS漂洗1 2次，再將半透明羊膜浸泡在DNA酶含量為1000 3000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜與DNA酶/PBS溶液的體積比為1:1 3，在溶液溫度為30 40°C下處理3 5小時； (5)、將半透明羊膜從DNA酶/PBS溶液中取出，并將半透明羊膜置于青霉素與鏈霉素含量均為100 300U/L的雙抗/PBS溶液中震蕩漂洗，每12小時換液一次，共兩次，最后將脫細胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的溫度下保存待用。
2.如權利要求1所述的一種人羊膜的脫細胞方法，其特征在于所述的表面活性劑采用Triton X-1OO。
全文摘要
本發明公開了一種人羊膜的脫細胞方法，特點是先得到干凈的半透明羊膜，然后用PBS漂洗半透明羊膜，再將半透明羊膜置于綜合PBS溶液中浸泡震蕩，取出羊膜后用PBS漂洗，再將羊膜先后浸泡在胰脂酶/PBS溶液和DNA酶/PBS溶液中處理，最后用雙抗/PBS溶液漂洗羊膜，最后將脫細胞后的羊膜取出放到PBS中保存待用；優點在于該方法采用表面活性劑結合胰脂酶和DNA酶共同來脫除羊膜中的細胞，將二者結合起來使用可以促使羊膜中的細胞被高效徹底地脫去，同時最大程度地保留細胞外基質，使其不受損傷。
文檔編號C12N5/071GK103114073SQ201310023898
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者竺亞斌, 史佩娜, 沈秋霞, 高夢娜, 盧珍珍 申請人:寧波大學