專利名稱：一種葡萄糖異構酶的固定化方法
技術領域：
本發明涉及一種葡萄糖異構酶的固定化方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
葡萄糖異構酶(Glase)，又稱木糖異構酶，可以將D-葡萄糖異構化為D-果糖，是食品工業生產上以淀粉為原料制備果葡糖漿的關鍵酶之一。相對于液態酶制劑的不能重復利用、使用效率低的缺點，通過物理、化學的方法將GIase固定成顆粒狀的成品具有高活力、可實現生產的連續化、自動化、可控化，產品易于分離和精制的特點，從而提高產品質量，降低生產成本，有力的推動果葡糖漿生產的發展。丹麥Novo公司是世界上最大的一家酶制劑生產廠商，該公司生產的固定化葡萄糖異構酶占全世界用量的70%。曹龍奎等(曹龍奎等，申 請號200910073264. 9)利用磁性殼聚糖符合微球制備固定化葡萄糖異構酶；葛玉斌等(葛玉斌等，《吉林大學自然科學學報》，1998,2:66 — 68)制備多孔球狀堿性氨基苯磺酰乙基接枝淀粉載體，采用SESA ( β -硫酸酯己砜基苯胺)對載體進行活化，經DEAE (2’ -氧乙基二乙胺鹽酸鹽)修飾作用，采用重氮化方法對葡萄糖異構酶進行了固定化；孔維等(孔維等，《生物化學雜志》，1992，8 (2) 212-215)用多孔強堿性三乙醇胺基聚苯乙烯樹脂作為載體，用CNBr與載體上多輕基作用共價偶聯葡萄糖異構酶(GI)。但這些固定化方法的成品較高，難于放大在工業化生產上。由于長期以來，我國的葡萄糖異構酶制劑市場一直被國外品牌的公司所壟斷，造成我國果葡糖漿的生產成本過高，使其在普通消費市場的占有率難以大幅度提高。因此，研究一種成本低、性能優異且可實現工業化生產的固定化方法具有非常重要的現實意義。

發明內容
本發明提供了一種葡萄糖異構酶的固定化方法，技術方案如下1)在初始培養基中添加適量的Co2+發酵生產葡萄糖異構酶；2)將步驟I)中所述發酵液與殼聚糖溶液混合使菌體絮凝；3)向絮凝物中加入戊二醛進行交聯，擠壓成型后烘干過夜。本發明以產葡萄糖異構酶的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)為例，所述重組大腸桿菌是將本研究室前期構建的xylA/pMD18-T(吳敬，陳晟，鄧輝，陳堅一種葡萄糖異構酶突變體及其應用，201110406411. 7)和質粒pET24a ( + )進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，得到含有葡萄糖異構酶基因的重組質粒xylA/pET24a(+)，將重組質粒xylA/pET24a(+)導入宿主E. coli BL21(DE3)中，所得的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)作為生產菌種。本發明具體技術方案如下(I)向重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)發酵初始培養基中添加O. 5_6mM的Co2+，37°C、200rpm/min的條件下培養至菌體濃度OD6tltl約為9-10，向發酵液中添加O. 1-0. 8%(m/v)的娃藻土,用20%醋酸溶液調節pH至6. 5-7. O。(2)將處理過的發酵液與O. 01-0. 1% (m/v)的殼聚糖溶液(O. 25%醋酸溶液溶解)在磁力攪拌器充分攪拌下混合lmin，靜置，使菌體絮凝下來。棄去上清液。(3)向絮凝物中加入O. 2-3% (v/v)戊二醛進行交聯，交聯一定時間后棄去上清液，擠壓成型后30°C烘干過夜即得固定化顆粒。所述的向培養基中添加金屬離子為Co2+,其濃度為O. 5_6mM。發酵培養基為甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，KH2PO4 2. 31g/L，K2HPO4 · 3H2016. 43g/L, Co2+O. 5_6mM。
具體實施例方式實施例1以本實驗室構建的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21(DE3)為生產菌種，發酵培養基中不添加Co2+，固定化方法為 (l)將本研究室前期構建的xylA/pMD18-T和質粒pET24a ( + )進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，得到含有葡萄糖異構酶基因的重組質粒 xylA/pET24a(+)，將重組質粒 xylA/pET24a(+)導入宿主 Ε· coli BL21(DE3)中，所得的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)作為生產菌種。(2)用20%醋酸溶液將培養至菌體濃度0D_約為10的發酵菌懸液調節pH至6. 5~7. O0(3)將處理過的發酵液與O. 1%的殼聚糖溶液(O. 25%醋酸溶液溶解)在磁力攪拌器充分攪拌下混合lmin，靜置，使菌體絮凝下來，棄去上清液。(4)向絮凝物中加入1%戊二醛進行交聯，交聯一定時間后棄去上清液，擠壓成型后30°C烘干過夜即得固定化顆粒。所得固定化顆粒性能如下葡萄糖異構酶酶活為1000U/g，固定化酶活回收率為50%，75°C半衰期為4h，顆粒強度為756g。實施例2具體過程如下以本實驗室構建的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)為生產菌種，發酵培養基中添加適量Co2+，固定化過程為(l)將本研究室前期構建的xylA/pMD18-T和質粒pET24a ( + )進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，得到含有葡萄糖異構酶基因的重組質粒 xylA/pET24a(+)，將重組質粒 xylA/pET24a(+)導入宿主 Ε· coli BL21(DE3)中，所得的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)作為生產菌種。(2)將大腸桿菌發酵初始培養基中添加5mM的Co2+，37°C、200rpm/min的條件下培養至菌體濃度OD6tltl約為10，用20%醋酸溶液調節pH至6. 5-7. O。(3)將處理過的發酵液與O. 1%的殼聚糖溶液(O. 25%醋酸溶液溶解)在磁力攪拌器充分攪拌下混合lmin，靜置，使菌體絮凝下來，棄去上清液。(4)向絮凝物中加入1%戊二醛進行交聯，交聯一定時間后棄去上清液，擠壓成型后30°C烘干過夜即得固定化顆粒。所得固定化顆粒性能如下葡萄糖異構酶酶活為2536U/g，固定化酶活回收率為67. 5%，75°C半衰期為29h，顆粒強度為744g。實施例3
具體過程如下以本實驗室構建的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)為生產菌種，發酵培養基中添加適量Co2+，固定化前向發酵液中添加適量硅藻土，固定化過程為(l)將本研究室前期構建的xylA/pMD18-T和質粒pET24a ( + )進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，得到含有葡萄糖異構酶基因的重組質粒 xylA/pET24a(+)，將重組質粒 xylA/pET24a(+)導入宿主 Ε· coli BL21(DE3)中，所得的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)作為生產菌種。(2)將大腸桿菌發酵初始培養基中添加O. 5mM的Co2+，37°C、200rpm/min的條件下培養至菌體濃度0D_約為10，向發酵液中添加O. 5% (m/v)的硅藻土，用20%醋酸溶液調節pH 至 6. 5-7. O。
(3)將處理過的發酵液與O. 01%的殼聚糖溶液(O. 25%醋酸溶液溶解)在磁力攪拌器充分攪拌下混合lmin，靜置，使菌體絮凝下來，棄去上清液。(4)向絮凝物中加入3%戊二醛進行交聯，交聯一定時間后棄去上清液，擠壓成型后30°C烘干過夜即得固定化顆粒。所得固定化顆粒性能如下葡萄糖異構酶酶活為2579U/g，固定化酶活回收率為70. 5%，75°C半衰期為29h，顆粒強度為1978g，在相同的轉化時間內，以50%葡萄糖為底物連續操作10次，其相對轉化率為70. 5%。實施例4具體過程如下以本實驗室構建的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21(DE3)為生產菌種，發酵培養基中添加適量的Co2+，固定化前向發酵液中添加適量硅藻土，固定化過程為(l)將本研究室前期構建的xylA/pMD18-T和質粒pET24a ( + )進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，得到含有葡萄糖異構酶基因的重組質粒 xylA/pET24a(+)，將重組質粒 xylA/pET24a(+)導入宿主 Ε· coli BL21(DE3)中，所得的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)作為生產菌種。(2)將大腸桿菌發酵初始培養基中添加6mM的Co2+，37°C、200rpm/min的條件下培養至菌體濃度OD6tltl約為10，向發酵液中添加O. 8%(m/v)的硅藻土，用20%醋酸溶液調節pH至 6. 5-7. O。(3)將處理過的發酵液與O. 05%的殼聚糖溶液(O. 25%醋酸溶液溶解)在磁力攪拌器充分攪拌下混合lmin，靜置，使菌體絮凝下來，棄去上清液。(4)向絮凝物中加入O. 2%戊二醛進行交聯，交聯一定時間后棄去上清液，擠壓成型后30°C烘干過夜即得固定化顆粒。所得固定化顆粒性能如下葡萄糖異構酶酶活為2375U/g，固定化酶活回收率為62. 5%，75°C半衰期為22h，顆粒強度為1826g，在相同的轉化時間內，以50%葡萄糖為底物連續操作10次，其相對轉化率為60. 8%。
權利要求
1.一種葡萄糖異構酶的固定化方法，其特征在于，步驟如下1)在初始培養基中添加適量的Co2+發酵生產葡萄糖異構酶；2)將步驟I)中所述發酵液與殼聚糖溶液混合使菌體絮凝；3)向絮凝物中加入戊二醛進行交聯，擠壓成型后烘干過夜。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌是將xylA/pMD18-T和質粒 pET24a ( + )進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，得到含有葡萄糖異構酶基因的重組質粒xylA/pET24a(+)，將重組質粒xylA/pET24a(+)導入宿主E.coliBL21(DE3)中，所得的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)作為生產菌種。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟如下O向重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21 (DE3)發酵初始培養基中添加O. 5_6mM的Co2+， 培養至菌體濃度0D_約為9-10 ；2)向發酵液中添加O.1-0. 8%的硅藻土 ；3)將步驟2)得到的發酵液與O.01-0. 1%的殼聚糖溶液混合，靜置使菌體絮凝；4)向絮凝物中加入O.2-3%戊二醛進行交聯，交聯一定時間后棄去上清液，擠壓成型后烘干。
4.權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，發酵初始培養基為甘油5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母粉 24g/L, KH2PO4 2. 31g/L, K2HPO4 · 3H20 16. 43g/L。
全文摘要
本發明公開了一種葡萄糖異構酶的固定化方法，屬于生物工程技術領域。本發明構建了產葡萄糖異構酶的重組大腸桿菌xylA/pET24a/BL21(DE3)，以該重組菌作為生產菌株，固定化后葡萄糖異構酶的酶活為2579U/g，酶活回收率達到70.5%，添加金屬離子后，75℃下半衰期為29h，較不添加金屬離子(半衰期為4h)提高了6.3倍；在相同的轉化時間內，以50%葡萄糖為底物連續操作10次，其相對轉化率為71%。該固定化方法簡單易行，固定化成品顆粒的性能優異，為工業化應用提供參考。
文檔編號C12N11/10GK102994490SQ20121058180
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者吳敬, 張帆, 鄧輝, 陳晟, 陳堅 申請人:江南大學