轉基因植物產品中磷酸甘露糖異構酶基因檢測用的引物和探針的制作方法
【專利摘要】本發明屬于轉基因植物產品的引物和探針，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測轉基因植物產品的磷酸甘露糖異構酶基因的引物和探針。方法包括PCR擴增反應液和上游引物PMI-taqF5’-CCGGGTGAATCAGCGTTTA-3’；下游引物PMI-taqR：5’-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3’；探針PM1-taqP：FAM-TGCCGCCAACGAATCACCGG-TAMARA。轉基因植物產品磷酸甘露糖異構酶基因的檢測方法包括轉基因植物產品DNA的提取、轉基因植物磷酸甘露糖異構酶基因的實時熒光PCR擴增和使用熒光定量PCR儀隨機軟件分析擴增結果并進行結果判定。其優點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便。
【專利說明】轉基因植物產品中磷酸甘露糖異構酶基因檢測用的引物和探針
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物源成分的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測轉基因植物產品的磷酸甘露糖異構酶基因的檢測用的引物和探針。
【背景技術】
[0002]甘露糖陽性選擇系統屬于非抗生素篩選系統之一，它是利用大腸桿菌的磷酸甘露糖異構酶基因(PMI)作為選擇基因，甘露糖作為選擇劑進行轉基因植物的篩選。甘露糖經由植物內源己糖激酶催化磷酸化為6-磷酸甘露糖，反應消耗ATP和磷酸鹽，會導致細胞分裂、生長缺少能量，并且6-磷酸甘露糖的過量積累對植物細胞有毒害作用。整合有外源PMI基因的轉化細胞能將6-磷酸甘露糖異構酶為6-磷酸果糖，使得代謝可繼續進行，避免了因6-磷酸甘露糖的大量積累，并產生ATP，為細胞的正常代謝提供了能量。非轉化細胞因缺乏磷酸甘露糖異構酶，不能利用6-磷酸甘露糖正常生長。因此，在含有甘露糖的培養基上，只有轉化細胞能正常生長，而非轉化細胞則被淘汰。該選擇系統在玉米轉基因過程中運用廣泛。
[0003]在享有轉基因技術帶來的巨大實惠的同時，轉基因產品潛在的生態安全、食品安全問題也日益引起人們的關注，各國紛紛制定相應的法律法規對轉基因產品進行監管。除美國、加拿大、阿根廷和中國香港特區實行自愿標識制度外，國際上大多數國家如歐盟各國、匈牙利、瑞士、波蘭、日本、韓國等均制定了強制性標識制度。我國于2001年、2002年頒布實施《農業轉基因生物安全管理條例》及《農業轉基因生物標識管理辦法》，啟動了農業轉基因生物的監督監管機制。我國政府規定，凡是列入標識管理目錄并用于銷售的農業轉基因作物，應當加以標識，未標識和不按規定標識的，不得進口和銷售，因此，必須對轉基因產品進行有效的檢測。
[0004]目前，國內還沒有轉基因植物中磷酸甘露糖異構酶基因PCR檢測試劑盒，本發明可彌補上述缺陷，采用實時熒光PCR的檢測方法完成轉基因植物中磷酸甘露糖異構酶基因的檢測。

【發明內容】

[0005]本發明屬于轉基因植物產品的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測轉基因植物產品的磷酸甘露糖異構酶基因的檢測用檢測方法，以克服基于蛋白的檢測方法在某些產品檢測中的局限性，為轉基因產品檢測提供有效工具，從而加強轉基因產品的監督監管，確保產品標簽的一致性，保護消費者的知情權和選擇權。
[0006]本發明的主要原理為:針對保守序列設計一組引物(上游引物:PMI_taqF5，-ccgggtgaatcagcgttta-3，和下游引物:PMI_TAQR 5，-gccgtggcctttgacagt-3，)和一條 TAQMAN 探針(PM1-TAQP:FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA)。進行核酸檢測時，模板DNA經加熱至94_95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模板特異性集合。Taqman探針的5端標記有報告集團，3端有非熒光淬滅集團。當探針完整的時候，報告集團所發射的熒光能被淬滅集團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結合的探針時，其3’ 一 5’外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告集團原理淬滅集團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。隨著PCR循環的增加，目的片段成指數增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反映模板數量。
[0007]本發明涉及的轉基因植物產品中磷酸甘露糖異構酶基因的檢測方法，其中的試劑包括如下:
[0008](I) PCR擴增反應液A
[0009]包括10?反應緩沖液、0.1-0.411111101/1dNTP、2_4mmol/L硫酸鎂、1-2U Taq 酶、
0.2-0.6 μ mol/L 上游引物、0.2-0.6 μ mol/L 下游引物、0.2-0.6 μ mol/L Taqman 探針；
[0010]其中10XPCR反應緩沖液含有100mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和I %曲拉通X100 ;
[0011]上游引物PM1-taqF:5’ -ccgggtgaatcagcgttta-3’ ；下游引物 PM1-taqR:5’ -gccgtggcctttgacagt-3J ；
[0012]Taqman 探針 PM1-taqP:FAM_tgccgccaacgaatcaccgg_TAMARA
[0013]其中上游引物、下游引物、Taqman探針的體積比為:1: I: 0.6 ；
[0014]其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
[0015]⑵陽性對照DNA
[0016]上面所述PCR擴增反應液A，每管24yL的最佳組成為:2.5 μ L10XPCR反應緩沖液、2 μ L2.5mmol/LdNTP (四種脫氧核糖核酸的混合物)、2 μ L25mmol/L硫酸鎂、I μ LlO μ mol/L 上游引物、I μ LlO μ mol/L 下游引物、0.6 μ LlO μ mol/L Taqman 探針、
0.3 μ LTaq 酶、14.6 μ LddH20。
[0017]使用上述試劑盒檢測轉基因植物產品中磷酸甘露糖異構酶基因的方法，依次包括下列步驟(1)-(3):
[0018](I)待檢樣品DNA的提取
[0019]DNA提取可使用DNA提取試劑盒或CTAB法。
[0020](2)轉基因植物產品中磷酸甘露糖異構酶基因的實時熒光PCR擴增
[0021]A.在裝有24 μ L PCR擴增反應液A的反應管中加入I μ L待檢樣品DNA，混勻。
[0022]B.將PCR反應管放入熒光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0023]95°C 3min, I 個循環；
[0024]950C 30s, 600C 30s，共 40 個循環。
[0025](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。
【具體實施方式】
[0026]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0027]實施例1
[0028]按下述方法檢測轉基因玉米3272，使用59122、BTll、M0N88017、M0N810轉基因玉米品系做陰性對照:[0029]包括10XPCR 反應緩沖液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸鎂、L 5U Taq 酶、0.4 μ mol/L 上游引物 PM1-taqF:5，-ccgggtgaatcagcgttta-3?；下游引物 PM1-taqR:5，-gccgtggcctttgacagt-3J ；Taqman 探針 PM1-taqP:FAM_tgccgccaacgaatcaccgg_TAMARA。其中10XPCR反應緩沖液含有100mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X-100 ；
[0030]按照以下程序進行檢測:
[0031](I)待測轉基因玉米樣品DNA的提取
[0032]采用安比奧試劑盒(GenoDNAPlant Mini Kit)
[0033]A.充分研磨
[0034]B.最多每 75mg 鮮料或 15mg 干材料樣品中加 400 μ gBufferAPl, 0.5 μ I RNaseA,充分混勻；
[0035]C.在65°C培養lOmin，期間上下顛倒離心管2-3次；
[0036]D.加 130 μ I BufferAP2,混勻，冰上放置 5min, 14000rpm 離心 5min ；
[0037]E.將上清轉入新的1.5ml離心管內，加1.5倍體積的BufferAP3/E，顛倒3_4次，混勻；
[0038]F.把溶液小心轉入2ml收集管的吸附柱內，1000Orpm離心lmin，如果一次離不完，
可多次加樣直至過柱完成，倒掉收集管中的液體；
[0039]G.加 500 μ IBufferAWl`, 1000Orpm 離心 lmin,倒掉收集管中的液體；
[0040]H.加 500 μ I BufferAW2, 1000Orpm 離心 lmin,倒掉收集管中的液體；
[0041]1.重復8步一次；
[0042]G.14000rpm離心3min，將離心柱轉移至一干凈1.5ml離心管內；
[0043]K.小心加50-100 μ I BufferAE至吸附柱濾膜上，室溫靜置l_5min, 1000Orpm離心lmin ;4°C保存。也可等同采用CTAB法。
[0044](2)待測轉基因植物樣品DNA的實時熒光PCR擴增
[0045]A.在PCR反應管中加入24 μ L PCR反應液A和I μ L樣品DNA，混勻。
[0046]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0047]95°C 3min, I 個循環；
[0048]950C 30s, 600C 30s，共 40 個循環。
[0049](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。
[0050]實施例2
[0051]按下述方法檢測轉基因玉米MIR604，使用GTS 40_3_2、M0N89788、A2704-12轉基因大豆品系做陰性對照:
[0052]包括10XPCR 反應緩沖液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸鎂、1.5UTaq 酶、0.4μ mol/L 上游引物 PM1-taqF:5’ -ccgggtgaatcagcgttta-3’ ；下游引物 PM1-taqR:5，-gccgtggcctttgacagt-3J ；Taqman-MGB 探針 PM1-taqP:FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA。其中 10XPCR 反應緩沖液含有 10Ommol/I, ρΗ8.8 的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X-100 ；
[0053]按照以下程序進行檢測:
[0054](I)待測轉基因玉米樣品DNA的提取[0055]采用安比奧試劑盒(GenoDNAPlant Mini Kit)
[0056]A.充分研磨
[0057]B.最多每 75mg 鮮料或 15mg 干材料樣品中加 400 μ gBufferAPl, 0.5 μ I RNaseA,充分混勻；
[0058]C.在65°C培養lOmin，期間上下顛倒離心管2-3次；
[0059]D.加 130 μ I BufferAP2,混勻，冰上放置 5min, 14000rpm 離心 5min ；
[0060]E.將上清轉入新的1.5ml離心管內，加1.5倍體積的BufferAP3/E,顛倒3_4次，混勻；
[0061]F.把溶液小心轉入2ml收集管的吸附柱內，1000Orpm離心lmin，如果一次離不完，
可多次加樣直至過柱完成，倒掉收集管中的液體；
[0062]G.加 500 μ I BufferAWl, 1000Orpm 離心 lmin,倒掉收集管中的液體；
[0063]H.加 500 μ I BufferAW2, 1000Orpm 離心 lmin,倒掉收集管中的液體；
[0064]1.重復8步一次；
[0065]G.14000rpm離心3min,將離心柱轉移至一干凈1.5ml離心管內；
[0066]K.小心加50_100μ1 BufferAE至吸附柱濾膜上，室溫靜置l_5min, 1000Orpm離心lmin ;4°C保存。也可等同采用CTAB法。
[0067](2)待測轉基因植物樣品DNA的實時熒光PCR擴增
[0068]A.在PCR反應管中加入24 μ L PCR反應液A和I μ L樣品DNA，混勻。
[0069]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0070]95°C 3min, I 個循環；
[0071]95°C 30s，60°C 30s，共 40 個循環。
[0072](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0073]圖1玉米3272熒光PCR產物的曲線圖。圖中坐標軸以外實橫線以上為陽性樣品，以下為陰性樣品或空白對照。
[0074]圖2玉米MIR604熒光PCR產物的曲線圖。圖中坐標軸以外實橫線以上為陽性樣品，以下為陰性樣品或空白對照。
【權利要求】
1.一種轉基因植物產品中磷酸甘露糖異構酶基因的引物和探針，其特征在于其中的引物和探針:
上游引物 PM1-taqF 5’ -CCGGGTGAATCAGCGTTTA-3’ ；
下游引物 PM1-taqR:5’ -GCCGTGGCCTTTGACAGT-3’。
探針 PM1-taqP:FAM-TGCCGCCAACGAATCACCGG-TAMARA
2.使用權利要求一使用所述的引物和探針快速檢測轉基因植物磷酸甘露糖異構酶基因(PMI)的方法，其特征是依次包括下列步驟: (1)待檢樣品的DNA提取； (2)轉基因植物磷酸甘露糖異構酶基因(PMI)的實時熒光PCR擴增: 在裝有24 μ L的PCR擴增反應液的反應管中加入I μ L的待檢樣品DNA，混勻。按照下述步驟完成PCR擴增。 950C 3min，l 個循環；
950C 30s, 600C 30s，共 40 個循環。 (3)使用擴增曲線分析PC`R產物。
【文檔編號】C12N15/11GK103484529SQ201210202238
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月13日 優先權日:2012年6月13日
【發明者】高宏偉, 王述柏, 孫敏, 周茜 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 青島農業大學