專利名稱：一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法
技術領域：
本發明涉及一種油脂含量測定方法，尤其是涉及一種利用RGB三原色原理的微藻胞內油脂含量的快速測定方法。
背景技術：
生物柴油(脂肪酸甲酯)是一種已經得到證明的燃料，以其為可再生性的環保燃料能源而得到世界的廣泛關注。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯(FAME)，是以可再生資源(如油菜籽油、大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、葵花子油、棕櫚油、椰子油、回收烹飪油、 動物油以及微生物油脂等)為原料而制成，具備與石油柴油相近的性能。生產和使用生物柴油的技術已經存在了 50余年。與石油柴油相比，生物柴油的性能更加優良。
面對植物原料生產生物柴油的諸多問題，利用微藻產油具有不與農業爭地的明顯優勢，而且可用海水作為天然培養基進行大量繁殖。跟植物一樣，微藻也是利用光照產油， 但卻比植物作物的效率高很多。大多數微藻的產油量遠遠超過了最好的油料作物。不像其他油料作物，微藻生長極為迅速，而且含有極其豐富的油脂。藻類光合作用轉化效率可達 10%以上，含油量達30%。微藻的生物柴油產量是最好的油料作物的8 M倍。
小球藻是屬于綠藻門綠藻目卵囊藻科小球藻屬普生性單細胞綠藻，它是一種球形單細胞淡水藻類，直徑3 8μ m，是地球上最早的生命之一，出現在20多億年前，基因始終沒有變化，是一種高效的光合植物，以光合自養生長繁殖，分布極廣。小球藻的光合作用色素是葉綠素，幾種葉黃素，類胡蘿卜素有胡蘿卜素，可能不含同屬綠藻門的團藻目-紅球藻科-紅球藻屬中的蝦青素。其貯藏的食物主要是淀粉。它是單細胞藻類，常單生，也常有多數細胞聚于一起；細胞多為球形、橢圓形；每個細胞內有1個周生、杯狀或片狀的葉綠體，具有1個蛋白核或缺如，1個細胞核；細胞壁通常很薄；每個細胞可以產生2、4、8或16 個似親孢子，進行無性繁殖。
1978年，美國能源部可再生能源國家實驗室開始養殖微藻生產生物燃料項目 (AquaticSpices Program,簡稱ASP項目)的研究，研究內容從微藻篩選、微藻生化機理分析、工程微藻制備到中試。該項目持續到1996年，在實驗室研究的基礎上，研究人員在美國加利福尼亞州、夏威夷州、新墨西哥州等地進行了中試放大。中試裝置運行了一年，可獲得高達0.05kg/(m2 · d)的工程微藻，微藻含油量達到40% 60%。1978-1996年累計投入科研經費2505萬美元。該研究室是迄今對微藻研究最全面和權威的機構。由于油價上漲，2007年底美國能源部又將這個中斷了 11年之久的項目重新啟動。美國SappHire公司 2008年9月宣布投資1億美元開展養殖海藻生產生物燃料的研究，SappHire公司有兩個引人注目的投資商比爾蓋茨私人名下的一家投資公司(Cascade in-vestments)和為洛克菲勒家族服務的投資合作商(VenrockPartner)。SappHire公司宣稱通過一種用太陽光、 二氧化碳和光合海藻的工藝研制出了辛烷值達91的“綠色”汽油，而且生產的“綠色”燃料與現有的從煉油廠到加油站的銷售網絡設施完全兼容，顯示了微藻汽油與第一代生物乙醇相比的優勢所在。美國生物技術公司Solazyme于2008年7月9日生產出第一批海藻基可再生生物柴油，并已通過美國材料試驗協會(ASTM)D-975規格的認證。美國國際能源公司(International Energy)于2007年11月初宣布啟動“海藻變油”研發計劃，將從基于海藻的光合成來生產可再生柴油和噴氣燃料。美國GreenFuel技術公司開發的海藻技術于 2005年在Arizona的APS電廠完成了中試。選用高生長率的海藻，置于裝有水的大型試管內，并曝置于直接的陽光照射下。這項技術計劃2008年開始商業化生產。美國Algenol公司2008年7月宣布在美國Maryland投運了世界上最大的海藻庫場，目標是在美國沿海地區建設海藻制乙醇工廠。該公司估算可從lacre (約為4046. 9m2) 土地生產6000gal (1 gal =3. 785L)乙醇。按照估計，如果美國所需乙醇全部從海藻制取，則僅需使用谷物制取乙醇需用土地的3%。美國可再生能源集團(REG)于2008年8月21日宣布，該公司已擁有規模化的商業化技術，可煉制和生產大量高質量的海藻生物柴油，柴油質量超過ASTM D6751和 EN 14214M標準。REG公司計劃采用專有預處理技術對粗海藻油進行凈化和精制。然后采用與目前商業規模生物柴油生產過程相似的系統，使之轉化為生物柴油。美國Valencent 產品公司和全球綠色解決方案公司合作開發的Vertigro工藝正處于工業應用準備階段， 包括海藻生長、海藻收集和萃取海藻油用于生物柴油3個步驟。工藝的核心是連續閉環生物反應器。在25-30d之后就可收集海藻，海藻的含油量約為50%。Vertigro工藝的生物柴油產量要比用常規農作物生產的生物柴油增加20倍，用水量只有5%。
石油公司也加入了養殖海藻生產生物柴油的研究開發。Shell公司與美國從事海藻生物燃料業務的HR生物石油公司(HR Biopetroleum)于2007年12月組建合資企業 Cellena公司，在夏威夷用面積2. 5hm2的實驗基地作為海藻養殖場，建設利用海藻生產植物油再轉化為生物燃料的中試裝置，進行為期2年的生物柴油生產實驗。Chevron公司也與美國可再生能源國家實驗室、Solazyme公司簽署了協議，共同開展研究工作。
任何顏色都可以用紅、綠、藍這3種顏色按不同的比例混合而成，這就是三原色原理。三原色的原理可解釋如下(1)自然界的任何顏色都可以由3種顏色按不同的比例混合而成；而每種顏色都可以分解成3種基本顏色；(2)三原色之間是相互獨立的，任何一種顏色都不能由其余的兩種顏色來組成；C3)混合色的飽和度由3種顏色的比例來決定。混合色的亮度為3種顏色的亮度之和。用以上的相加混色三基色所表示的顏色模式稱為RGB 模式，而用相減混色三基色原理所表示的顏色模式稱為CMYK模式，它們廣泛運用于繪畫和印刷領域。RGB是一種依賴于設備的顏色空間不同設備對特定RGB值的檢測和重現都不一樣，因為顏色物質(熒光劑或者染料)和它們對紅、綠和藍的單獨響應水平隨著制造商的不同而不同，甚至是同樣的設備不同的時間也不同。RGB顏色模型的主要目的是在電子系統中檢測，表示和顯示圖像，比如電視和電腦，但是在傳統攝影中也有應用。在電子時代之前， 基于人類對顏色的感知，RGB顏色模型已經有了堅實的理論支撐。
近年來，雖然有很多關于微藻胞內油脂含量的測定方法報道，繆曉玲(太陽能學報，2007，Vol.28, No. 2)報道了先將藻粉于缽體中研磨，然后用正己烷抽提，最后稱重測量油脂含量；胡小文(中國油脂，2011，Vol.36，No. 2)報道了利用尼羅紅染色法熒光光譜檢測微藻中油脂的方法?？偟脕碚f，目前研究中檢測油脂的方法主要分兩種，一種是利用各種手段把油脂分離提取出來稱重；另一種是利用油脂熒光染色的特性，用熒光檢測手段定量檢測油脂含量。但是這兩種手段要么操作起來很麻煩，需要的樣品量很大，要么實驗誤差大， 重復性不高。發明內容
本發明的目的在于提供一種利用RGB三原色原理的微藻胞內油脂含量的快速測定方法。
本發明的技術方案是以小球藻Chlorella vulgaris為出發藻種，以SE培養基培養小球藻，生長期內用自制光箱拍照，并用MATLAB編程分析照片中R、G、B的值，從而建立實測油脂含量與R、G、B平均值的關系模型，最后可以直接通過拍照讀取R、G、B的值來計算胞內油脂的含量。
本發明采用的藻種為小球藻Chlorella vulgaris，所述小球藻Chlorella vulgaris購自中國科學院典型培養物種保藏委員會淡水藻種庫，藻種編號FACHB_32。
本發明包括以下步驟
1)制作拍照用光箱；
2)將不同培養時期的藻液，倒在培養皿中，再放置在不透光板中央，然后放入光箱內，打開光源，用數碼相機從箱體的頂面通孔拍照；
3)從小球藻照片上中央位置截取圖像；
4)用MATLAB編寫程序，分析圖像上的R、G、B三種顏色的平均像素值，并繪制像素分布5)建立實測油脂含量與R、G、B三種顏色平均像素值關系的模型成=aR+bG+cB, 求模型參數a、b、c;
6)建立模型后，通過拍照截圖，用MATLAB編程讀取RGB值，帶入模型得到小球藻細胞中油脂的含量，單位為mg/g。
在步驟1)中，所述光箱設有箱體，箱體的底面為敞口，頂面中央設有通孔，在箱體內設有燈管，所述箱體的棱長可為50cm，所述通孔的直徑可為5cm，箱體內壁可為黑色；所述燈管可設4根白色LED燈管，4根白色LED燈管設在燈箱內的四角。
在步驟2、中，所述培養皿可采用一次性培養皿；所述不透光板可采用白色不透光亞克力板。
在步驟3)中，所述圖像可為IOOX 100像素大小的圖像。
在步驟4)中，所述分析圖像上的R、G、B三種顏色的平均像素值，可分析圖像上 10000個點的R、G、B三種顏色的平均像素值。
本發明建立的小球藻胞內油脂測定方法操作簡單，測定結果精確，模型計算油脂含量與實際油脂含量線性相關系數R2達到0. 9978，而且重復性好，需要樣品量少?？傊?，與傳統的分析油脂含量的方法相比，具有更簡捷，精確的優勢。


圖1為本發明實施例的光箱結構示意圖。
圖2為本發明實施例的小球藻圖片R、G、B值分布圖。在圖2中，橫坐標為象素值， 縱坐標為出現次數；圖中a為藍色，b為紅色，c為綠色。
圖3為RGB模型預測油脂含量與實際油脂含量線性關系圖。在圖3中，橫坐標為預測油脂含量(mg/g)，縱坐標為實際油脂含量(mg/g)；線性相關系數R2 = 0.9978。
具體實施方式
以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。
1)制作拍照用光箱，參見圖1，所述光箱設有箱體1，箱體1可采用鋁合金制作，呈棱長50cm的正方體框架，箱體1的底面11為敞口，頂面12中央設有通孔13，在箱體1內設有4根白色LED燈管2，4根白色LED燈管2設在箱體1內的四角，所述通孔13的直徑可為 5cm，箱體1內壁可為黑色；箱體1上可設開關3。
2)判斷光箱內光源分布是否均勻光箱內光源分布均與否對建立模型的準確性和重復性影響極大，判斷光箱內光源分布是否均勻可以采用分析光箱所拍照片的RGB均勻度來判斷。從小球藻照片上截取100X 100的像素圖后，用MATLAB編輯的統計RGB值的程序來分析像素圖，然后繪制R、G、B的分布圖，看分布圖中R、G、B的分布是否為單峰狀。如果是單峰狀的，說明所拍小球藻的照片光線分布很均勻，重復性很好，從而也說明了自制光箱內光源分布很均勻，適合用來拍照。如圖2所示即為R、G、B分布很均勻的圖，都是單峰狀的。
3)建模過程對正常生長的小球藻，每次取樣60 70ml，然后搖勻，倒入一次性平板中沒過底部，放在亞克力板的中央位置，蓋上光箱用數碼相機拍照。
用截圖工具，例如pho to shop、QQ截圖等從所拍小球藻照片上中央位置截取 100X100大小的像素圖。把這個像素圖移動到用MATLAB所編統計像素值的程序所在文件夾，運行程序，輸入截圖名稱，即可得到截圖的10000個點的R、G、B的平均值以及R、G、B值的分布圖。
然后再取50ml樣品，測0D684，然后對照DCW-0D684的標準線性關系式，計算樣品中小球藻的生物量。然后離心、洗滌、烘干樣品，用索氏萃取法以正己烷為溶劑萃取小球藻中的油脂，通過稱量接受瓶萃取前后的重量差來測定油脂的重量，這樣就可以得到實測油脂占細胞干重的含量mg/g。
間隔時間取8個樣，得到8組數據，包括樣品R、G、B的平均值以及實測油脂含量如表1所示。
表1 R、G、B的平均值以及實測油脂含量與模型預估含量
ρ際油脂含量(mg/g) 預估油脂含量(mg/g)1190.284202.052202.066313312.62181.039193.991195.308310310.33159.163182.841134.031222222.24158.07187.12126.773320320.55126.568176.38555.366281280.46170.832185.87146.394290289.97151.883184.153106.018297296.78155.69189.081109.826292292.3
然后對8組數據用MATLAB進行線性擬合，模型為Y^ = aR+bG+cB，其中R、G、B為表中紅色、綠色、藍色的值，\為表中實測油脂含量。擬合完得到模型參數值為a = -1. 5379， b = 1.8504，c = 1.6343。所以建立的胞內油脂含量與R、G、B平均值的模型為^ =-1. 5379R+1. 8504G+1. 6343B (YL :mg/g DCff)。
模型建立后，就可以簡單快速的只通過取少量藻液，拍照后用MATLAB編的程序讀取R、G、B值，帶入模型方程計算得出小球藻胞內油脂含量\。表1中預估油脂含量為用模型方程計算出來的預估油脂含量，可見與實際油脂含量差距不大，模型的重復性很高。
4)驗證模型方程的精確性在小球藻培養的不同時期，取樣用RGB模型分析預估油脂含量，同時用傳統的稱重法測量實際油脂含量，建立模型預估含量與實際含量的線性關系，分析線性度。
如圖3所示為小球藻胞內油脂預測含量與實際含量的線性關系圖。由圖3中可見， 線性相關系數R2值有0. 9978，相關度非常高，模型方程的重復性很高，經驗證可以用來作為快速測定小球藻胞內油脂含量的簡易方法。
權利要求
1.一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法，其特征在于包括以下步驟1)制作拍照用光箱；2)將不同培養時期的藻液，倒在培養皿中，再放置在不透光板中央，然后放入光箱內， 打開光源，用數碼相機從箱體的頂面通孔拍照；3)從小球藻照片上中央位置截取圖像；4)用MATLAB編寫程序，分析圖像上的R、G、B三種顏色的平均像素值，并繪制像素分布圖；5)建立實測油脂含量與R、G、B三種顏色平均像素值關系的模型=aR+bG+cB,求模型參數a、b、c ；6)建立模型后，通過拍照截圖，用MATLAB編程讀取RGB值，帶入模型得到小球藻細胞中油脂的含量，單位為mg/g。
2.如權利要求1所述的一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟1) 中，所述光箱設有箱體，箱體的底面為敞口，頂面中央設有通孔，在箱體內設有燈管，所述箱體的棱長為50cm，所述通孔的直徑為5cm，箱體內壁為黑色。
3.如權利要求2所述的一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法，其特征在于所述燈管設4根白色LED燈管，4根白色LED燈管設在燈箱內的四角。
4.如權利要求1所述的一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟2) 中，所述培養皿采用一次性培養皿。
5.如權利要求1所述的一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟2) 中，所述不透光板采用白色不透光亞克力板。
6.如權利要求1所述的一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟3) 中，所述圖像為100X 100像素大小的圖像。
7.如權利要求1所述的一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟4) 中，所述分析圖像上的R、G、B三種顏色的平均像素值，是分析圖像上10000個點的R、G、B 三種顏色的平均像素值。
全文摘要
一種微藻胞內油脂含量的快速測定方法，涉及一種油脂含量測定方法。以小球藻Chlorellavulgaris為出發藻種，以SE培養基培養小球藻，生長期內用自制光箱拍照，并用MATLAB編程分析照片中R、G、B的值，從而建立實測油脂含量與R、G、B平均值的關系模型，最后可以直接通過拍照讀取R、G、B的值來計算胞內油脂的含量。操作簡單，測定結果精確，模型計算油脂含量與實際油脂含量線性相關系數R2達到0.9978，而且重復性好，需要樣品量少?？傊?，與傳統的分析油脂含量的方法相比，具有更簡捷，精確的優勢。
文檔編號C12Q1/02GK102517372SQ20111040951
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者凌雪萍, 盧英華, 吳意珣, 敬科舉, 文昌 申請人:廈門大學