專利名稱：一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉黑色素產(chǎn)量的方法
一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉黑色素產(chǎn)量的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于由微生物液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)黑色素技術(shù)領(lǐng)域，具體利用環(huán)境脅迫提高出芽短梗霉黑色素產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
黑色素是一種廣泛存在于生物體中的一類天然色素，它是通過多羥基酚(極易結(jié)合蛋白)氧化而形成結(jié)構(gòu)不規(guī)則的非均質(zhì)的類多酚聚合體。黑色素在工農(nóng)業(yè)上，可以作為吸收紫外線的化妝品成分、天然染發(fā)劑的成分、陽離子螯和劑、作為無定形的半導(dǎo)體以及生物殺蟲劑的光保護(hù)劑；此外黑色素在醫(yī)學(xué)上也具有很廣的應(yīng)用范圍，具有清除自由基、阻止心磷脂脂質(zhì)體的氧化、抗輻射及抗氧化、對病理學(xué)和分類學(xué)的研究具有重要意義、作為新型的天然藥物載體、用來治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)性疾病、一些可溶性黑色素在體外具有抑制愛滋病病毒感染宿主細(xì)胞的作用，因此有可能成為一種有效的藥物.目前黑色素的生產(chǎn)多是通過化學(xué)合成或從動、植物體進(jìn)行提取。化學(xué)合成黑色素反應(yīng)過程多，且具有一定的毒害性；從動、植物體提取黑色素存在樣品來源的問題。利用微生物生產(chǎn)黑色素具有反應(yīng)條件溫和、成本低、操作簡單、無需大量的樣品等優(yōu)點(diǎn)。而國內(nèi)利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的研究還很少，而本發(fā)明是利用環(huán)境脅迫提高出芽短梗霉黑色素的產(chǎn)量。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)黑色素的出芽短梗霉菌(AurecAasidium Pullulans)，并采用改良培養(yǎng)基對其深層液態(tài)發(fā)酵提供黑色素產(chǎn)量的方法。
一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉黑色素產(chǎn)量的方法，其特征在于先將保藏編號為CGMCC3337的出芽短梗霉(AurecAasidium Pullulans)菌株活化后搖瓶培養(yǎng)，按照1 10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心5min， 所得上清液先以6mol/L鹽酸酸解，后用50%的甲醇進(jìn)行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用 lmol/L堿性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L鹽酸對所得黑色溶液進(jìn)行沉淀，即得到
本發(fā)明采用的的實(shí)施步驟如下
(1)菌種活化將保藏在PDA培養(yǎng)基斜面上的菌種，在22 下恒溫培養(yǎng)4 8小時，得到活化菌株；
(2)制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L)葡萄糖20 40，土豆汁100 700， 牛肉膏1 5，蒸餾水，pH 4 7，121 °C滅菌20min;從斜面上挑取一環(huán)出芽短梗霉菌接入上面的種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)1 ! 36h，培養(yǎng)溫度27士2°C，轉(zhuǎn)速為150 230rpm。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基現(xiàn)有的發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):葡萄糖40，土豆汁 400，牛肉膏l(xiāng)，F(xiàn)eS04 0 . 02，蒸餾水，121°C滅菌20min ；或本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L)葡萄糖 40，土豆汁 400，牛肉膏 1，F(xiàn)eSO4O. 02，H2025mmoL/L 25mmoL/L，蒸餾水，pH 4，121°C滅菌 20min。
(4)將種子液接種于IOL自動控制發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基分別為現(xiàn)有發(fā)酵培養(yǎng)基和本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為7L，接種量為1 % 10 % (V/V)，發(fā)酵攪拌速度為 200 500r/min，發(fā)酵溫度為25°C，通氣量為0. 5 1(V/V)，罐壓為0. 01 0. 02Mpa, pH 4. 0 7. 0，分別發(fā)酵3 5天。發(fā)酵得到的發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心5min，所得上清液先以6mol/L鹽酸酸解，后用50%的甲醇進(jìn)行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/ L堿性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L鹽酸對所得黑色溶液進(jìn)行沉淀，即得到黑色ο
所述堿性溶液選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水溶液。
所述培養(yǎng)基中添加了 H2O2，H2O2會分解生成氧氣，氧氣是高度活性物質(zhì)，當(dāng)氧化不完全時則會生成活性氧類。活性氧類是機(jī)體內(nèi)自由基的主要形式，可在細(xì)胞的正常代謝中產(chǎn)生，外界環(huán)境如輻射、氧化還原活性藥物、金屬離子也會刺激ROS的生成。正常情況下， ROS的產(chǎn)生和抗ROS水平是平衡的，當(dāng)ROS產(chǎn)生大于抗ROS水平時，即會攻擊機(jī)體，造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA的損傷，甚至是細(xì)胞的死亡，這就是所謂的氧化應(yīng)激。生物體為了應(yīng)付這種氧化應(yīng)激反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)化出若干的保護(hù)機(jī)制，發(fā)生基因調(diào)節(jié)水平上的變化，從而誘導(dǎo)合成黑色素，保護(hù)自身不受ROS的傷害。當(dāng)出芽短梗霉處于亞致死劑量的H2O2中時，它將適應(yīng)這種應(yīng)激條件從而對致死劑量的刺激產(chǎn)生黑色素。因此在出芽短梗霉的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加亞致死劑量的H2A時，將會大大地提高短梗霉黑色素的產(chǎn)量。
本發(fā)明菌種使用天津科技大學(xué)申請中菌種，申請?zhí)枮镃N200910071018，發(fā)明名稱為一種大量產(chǎn)生β -聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養(yǎng)方法，
公開日期是 2011. 02. 23。該專利中公開了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ΤΚΡΜ00006，菌種保藏號為CGMCC3337，2009年10. 14日保藏。
有益效果
本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，與現(xiàn)有發(fā)酵培養(yǎng)基相比，黑色素產(chǎn)量由2.47g/L 提高到12. 86g/L，發(fā)酵周期有7天縮短為3天，使培養(yǎng)基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
(1)菌種活化將保藏在PDA培養(yǎng)基斜面上菌，在22恒溫培養(yǎng)4小時，得到活化菌株；
(2)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入裝有50毫升培養(yǎng)基的500毫升擋板瓶中。種子培養(yǎng)基的水溶液組成為(g/L):葡萄糖20，土豆汁100，牛肉膏1，蒸餾水，pH 4，121°C滅菌 20min ；搖瓶于25°C，轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上培養(yǎng)Mh，作為種子液。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基現(xiàn)有的發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):葡萄糖40，土豆汁 400，牛肉膏1，F(xiàn)eSO4O. 02，pH 4，121°C滅菌20min。121°C高壓蒸汽滅菌20min ；或本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏1，F(xiàn)eSO4O. 02, H2025mmoL/L，蒸餾水，pH 4，121°C 滅菌 20min。
(4)將種子液接種于IOL自動控制發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基分別為現(xiàn)有發(fā)酵培養(yǎng)基和本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為7L，接種量為(V/V)，發(fā)酵攪拌速度為200r/min，發(fā)酵溫度為25°C，通氣量為0.5(V/V)，罐壓為O.OlMpa，pH 4.0，分別發(fā)酵3天。發(fā)酵得到的發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心5min，所得上清液先以6mol/L鹽酸酸解，后用50%的甲醇進(jìn)行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/L堿性溶液溶解得到黑色溶液。最后用 3mol/L鹽酸對所得黑色溶液進(jìn)行沉淀，即得到黑色素。
(5)發(fā)酵液經(jīng)上述處理后，分別獲得7. 49g/L和11. Mg/L的黑色素，采用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基，黑色素的產(chǎn)量提高了 50. 1%。
實(shí)施例2:
(1)菌種活化將保藏在PDA培養(yǎng)基斜面上的菌種，在下恒溫培養(yǎng)6小時，得到活化菌株。
(2)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入裝有50毫升培養(yǎng)基的500毫升擋板瓶中。種子培養(yǎng)基的水溶液組成為(g/L):葡萄糖40，土豆汁700，牛肉膏5，蒸餾水，pH 4，121°C滅菌 20min ；搖瓶于^°C，轉(zhuǎn)速為230r/min的搖床上培養(yǎng)36h，作為種子液。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基現(xiàn)有的發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):葡萄糖40，土豆汁 400，牛肉膏UeSO4 0.02，蒸餾水，pH 4，121°C滅菌20min ；或本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L)葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏1，F(xiàn)eSO4O. 02，H20225mmoL/L，蒸餾水， pH 4，121°C 滅菌 20min。
(4)將種子液接種于IOL自動控制發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基分別為現(xiàn)有發(fā)酵培養(yǎng)基和本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為7L，接種量為10% (V/V)，發(fā)酵攪拌速度為500r/ min，發(fā)酵溫度為^°C，通氣量為1(V/V)，罐壓為O.OlMpa，pH 4.0，分別發(fā)酵4天。發(fā)酵得到的發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心5min，所得上清液先以6mol/L鹽酸酸解，后用50% 的甲醇進(jìn)行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/L堿性溶液溶解得到黑色溶液。最后用 3mol/L鹽酸對所得黑色溶液進(jìn)行沉淀，即得到黑色素。
(5)發(fā)酵液經(jīng)上述處理后，分別獲得6. 95g/L和11. 74g/L的黑色素，采用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基，黑色素的產(chǎn)量提高了 68. 9%。
實(shí)施例3
(1)菌種活化將保藏在PDA培養(yǎng)基斜面上的菌種，在25°C下恒溫培養(yǎng)6小時，得到活化菌株；
(2)種子培養(yǎng)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入裝有50毫升培養(yǎng)基的500毫升擋板瓶中。種子培養(yǎng)基的水溶液組成為(g/L):葡萄糖20，土豆汁100，牛肉膏1，蒸餾水，pH 4， 121°C滅菌20min ；搖瓶于溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床上培養(yǎng)Mh，作為種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基現(xiàn)有的發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):葡萄糖40，土豆汁 400，牛肉膏1，F(xiàn)eSO4O. 02，蒸餾水，pH 4，121°C滅菌20min ；或本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L)葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏1, FeSO4O. 02，H20215mmoL/L，蒸餾水， pH 4，121°C 滅菌 20min。
(4)將種子液接種于10L自動控制發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基分別為現(xiàn)有發(fā)酵培養(yǎng)基和本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為7L，接種量為6% (V/V)，發(fā)酵攪拌速度為300r/min， 發(fā)酵溫度為25°C，通氣量為0.8作八)，罐壓為0.0說 ？!1 4，分別發(fā)酵7天和5天。發(fā)酵得到的發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心5min，所得上清液先以6mol/L鹽酸酸解，后用50% 的甲醇進(jìn)行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/L堿性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L鹽酸對所得黑色溶液進(jìn)行沉淀，即得到黑色素。
(5)發(fā)酵液經(jīng)上述處理后，分別獲得8. 46g/L和12. 86g/L的黑色素，采用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基，黑色素的產(chǎn)量提高了 52%。
權(quán)利要求
1 一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉菌黑色素產(chǎn)量的方法，其特征在于先將出芽短梗霉(AurecAasidium Pullulans)菌株活化后搖瓶培養(yǎng)，將搖瓶種子液體按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1 10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心5min，所得上清液鹽酸酸解后用甲醇沉淀，得黑色素粗品，上述粗品用堿性溶液溶解得到黑色溶液后用鹽酸對所得黑色溶液進(jìn)行沉淀，即得到黑色素。
2.如權(quán)1所述一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉菌黑色素產(chǎn)量的方法，步驟如下(1)菌株活化將保藏在PDA培養(yǎng)基斜面上菌，在22 恒溫培養(yǎng)4 8小時，得到活化菌株；(2)搖瓶培養(yǎng)從斜面上挑取一環(huán)出芽短梗霉菌接入種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)；(3)液態(tài)發(fā)酵將種子液接種于IOL自動控制發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量7L，接種量為1 % 10 %，發(fā)酵攪拌速度為200 500r/min，發(fā)酵溫度為25°C，通氣量為0. 5 1 (V/ V)，罐壓為0. 01 0. 02Mpa，pH 4. 0 7. 0，發(fā)酵3 5天;(4)黑色素提取發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心5min，所得上清液鹽酸酸解后用甲醇沉淀，得黑色素粗品，上述粗品用堿性溶液溶解得到黑色溶液，后用鹽酸對所得黑色溶液進(jìn)行沉淀，即得到黑色素。
3.如權(quán)1所述一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉菌黑色素產(chǎn)量的方法，特征在于所述堿性溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水溶液。
4.如權(quán)1所述一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉菌黑色素產(chǎn)量的方法，特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏IfeSO4 0.02， H2O2 5mmoL/L 25mmoL/L，蒸餾水，pH 4。
5.如權(quán)1所述一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉菌黑色素產(chǎn)量的方法，特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏l(xiāng)，F(xiàn)eS04 0 . 02， H2O2 15mmoL/L，蒸餾水，pH 4。6. 一種出芽短梗霉菌株(Aureobasidium Pullulans) CGMCC3337在黑色素發(fā)酵中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用氧化脅迫提高出芽短梗霉黑色素產(chǎn)量的方法，特征是將出芽短梗霉菌活化4～8小時，然后搖瓶培養(yǎng)12～36小時，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1～10％接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵得到的發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心5min，所得上清液先以鹽酸酸解，后用甲醇進(jìn)行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用堿性溶液溶解得到黑色溶液。最后用鹽酸對所得黑色溶液進(jìn)行沉淀，即得到黑色素。與采用其他發(fā)酵培養(yǎng)基相比，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基，黑色素產(chǎn)量由2.47g/L提高到12.86g/L，發(fā)酵周期由7天縮短為3天，使培養(yǎng)基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P1/02GK102517336SQ20111042652
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者喬長晟, 敖愛華, 汪建明, 郝華璇, 馬正旺 申請人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司