專利名稱：一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過出芽短梗霉細胞生產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，屬于生物發酵工程技術領域。
背景技術：
聚蘋果酸和普魯蘭多糖都是出芽短梗霉的產物，都可由出芽短梗霉發酵產生。為了提高聚蘋果酸或是普魯蘭多糖的產量，人們通過誘變選育或基因工程構建合成能力強的菌種，篩選和優化培養基配方，建立和優化發酵過程控制，改進和提高下游工程技術等方面來提高產品的產量產率和質量。聚蘋果酸是以蘋果酸為唯一單體聚合而成的高分子聚合物。目前國外有關微生物發酵聚蘋果酸的專利非常少，已有的發酵生產或人工合成聚蘋果酸(蘋果酸聚合物)的專利有1995年公開的日本專利“生產蘋果酸聚合微生物的培養方法(P 7308188A2)"[22], 1991年公開的日本專利“酶法生產L-蘋果酸聚合物(JP4341189A2)”和1992年公開的日本專利“微生物合成L-蘋果酸聚合物(JP4211385A2)[23]”。美國專利US4320753主要是合成聚蘋果酸和相應內酯的衍生物@]。目前關于聚蘋果酸應用的專利較多，如 US05811032、US05324519, US5702716等共30多項；國內有關聚蘋果酸的專利僅有6項， 其中與聚蘋果酸生物合成有關的專利3項(宋存江等[25] “同時獲得副產物普魯蘭糖的聚蘋果酸的制備方法”申請號200710058398 ；萬印華等[26] “ β _聚蘋果酸及其鹽的制備方法”，申請號=200910078227. 7 ；喬長晟等[27] “一種酶法去除普魯蘭多糖提取獲得 β-聚蘋果酸的方法”，申請號200910068951. 1)，其余三項均為以聚蘋果酸為原料的應用型專利。有關聚蘋果酸合成的研究論文有中科院微生物研所劉雙江研究員利用出芽短梗霉Aureobasidium pullulans發酵得到PMLA產物、喬長晟等發表的“Optimization of Poly(β -L-malic acid)production using Aureobasidium pullulans by response surface methodology”、南京工業大學王發表的“聚蘋果酸的發酵培養條件優化”以及“響應面發優化β-聚蘋果酸發酵培養基的研究”。普魯蘭多糖是由出芽短梗霉利用糖質化合物為基質進行好氣發酵產生的一種粘性胞外多糖，早在1936年就人們被發現。一直到六十年代，人們才開始對其發酵、提取和應用等方面發明內容進行研究，在1978年日本林原公司實現工業化生產普魯蘭多糖。綜上所述，現有的技術所做的只是針對聚蘋果酸或是普魯蘭多糖一種產品進行的發酵，存在原料利用率低，能耗高，成本高等問題。

發明內容
本發明提出了利用出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法。本發明以出芽短梗霉為培養菌株，采用優化的聯產培養基配方，包括接入菌種、向發酵液中流加營養物和調節劑，控制發酵液中出芽短梗霉細胞代謝產物生成條件。其中出芽短梗霉培養基中按每升發酵液的質量含量配制碳源6g/Lj8g/L，氮源0. 5g/L-5. 5g/L，無機鹽0.01g/L-2g/L，所述碳源有葡萄糖、蔗糖、琥珀酸、檸檬酸，氮源有蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、硝酸鈉、氯化銨、碳酸銨、丁二酸銨，無機鹽有氯化鉀、硫酸鹽和磷酸鹽；發酵過程流加的營養物有葡萄糖，蔗糖，蛋白胨，蘋果酸，添加的調節劑為碳酸鈣， 調節發酵液PH3-8之間，發酵溫度在20-30°C，發酵周期4_7天，得到聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的發酵液。發酵罐培養基溫度降至后接入菌種，按3%的接種量接入發酵罐，攪拌轉速在200rpm，通風比為0. 5VVM，控制溫度左右開始發酵，從發酵開始到72小時溫度控制在-31°C，從M小時開始流加蔗糖，控制發酵液中葡萄糖量在35g/L，72小時以后控制溫度在25°C左右，并且繼續流加蔗糖控制發酵液中葡萄糖含量15g/L，直至發酵136小時停止加蔗糖，發酵直至發酵液中葡萄糖含量降至0后繼續發酵8小時，發酵過程中pH控制 5-7. 2之間，發酵166小時，普魯蘭多糖總量為52g/L以上，聚蘋果酸總量為37g/L以上。金屬離子Mn2+、Fe2\ Zn2+ 各在 0. OOlg/L-O. 4g/L ；金屬離子以硫酸鹽或氯化鹽的形式加入，包括Μη2+、 ^2+、&ι2+。上述磷酸鹽包括磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀。上述菌種包括出芽短梗霉或通過誘變和基因工程改造過的工程菌。本發明中使用菌種見出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006, CGMCC3337，見天津科技大學申請專利，申請號為CN200910071018，發明名稱為一種大量產生β -聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養方法，
公開日期是2011. 02. 23。 該專利中公開了本發明用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006，CGMCC3337， 2009年10. 14日保藏。有益效果通過流加及發酵過程控制使聚蘋果酸和普魯蘭多糖的產量達到單獨發酵聚蘋果酸或普魯蘭多糖的較高水平，從而提高原料利用率，節約能源，降低了成本
具體實施例方式本發明較好的實施方式是發酵培養基配方是蔗糖80g/L_200g/L，蛋白胨5g/ L-50g/L,碳酸鈣 5g/L-40g/L,氯化鉀 0. lg/L_2g/L，硝酸鈉 lg/L_3g/L，硫酸鎂 0. Ig/ L-0. 6g/L，磷酸二氫鉀 0. 05g/L-4g/L, Mn2+、Fe2\ Zn2+ 各在 0. 001g/L-0. 4g/L，按常規滅菌方式在121°C下實罐滅菌20min，待培養基溫度降至后接入菌種，按3% -10% (種子液與發酵液的體積比)的接種量接入發酵罐，攪拌轉速在200-600rpm，通風比為0. 5-1. 5VVM, 控制溫度左右開始發酵，發酵液溫度控制在20°C _35°C，從發酵開始到72小時溫度控制在-31°C，從M小時開始流加蔗糖，控制發酵液中葡萄糖量在35g/L-50g/L，72小時以后控制溫度在25°C左右，并且繼續流加蔗糖控制發酵液中葡萄糖含量15g/L-30g/L，直至發酵136小時停止加蔗糖，發酵直至發酵液中葡萄糖含量降至0后繼續發酵8小時，發酵過程中PH控制5-6之間，直至發酵結束大概166小時左右，生物量達到74g/L-113g/L (干重)，普魯蘭多糖總量為40g/L-90g/L，聚蘋果酸總量為36g/L-65g/L。上述菌種包括出芽短梗霉或通過誘變和基因工程改造過的工程菌。實施例1 使用30L通用式發酵罐配置18L發酵培養基，培養基配方蔗糖80g/L，蛋白胨5g/L,碳酸鈣5g/L，氯化鉀0. lg/L，硝酸鈉lg/L，硫酸鎂0. lg/L，磷酸二氫鉀0. 05g/L, Mn2+、 Fe2\Zn2+各在0. 001g/L-0. 4g/L，在121 °C實罐滅菌20min。待培養基溫度降至后接入菌種，按3% (種子液與發酵液的體積比)的接種量接入發酵罐，攪拌轉速在200rpm，通風比為0. 5VVM，控制溫度左右開始發酵，從發酵開始到72小時溫度控制在-31°C， 從M小時開始流加蔗糖，控制發酵液中葡萄糖量在35g/LL，72小時以后控制溫度在25°C左右，并且繼續流加蔗糖控制發酵液中葡萄糖含量15g/L，直至發酵136小時停止加蔗糖，發酵直至發酵液中葡萄糖含量降至0后繼續發酵8小時，發酵過程中pH控制5. 8-7. 2之間， 直至發酵結束大概166小時左右，生物量達到74g/L (干重)，普魯蘭多糖總量為52g/L，聚蘋果酸總量為37g/L。菌種為CGMCC3337。實施例2:使用30L通用式發酵罐配置18L發酵培養基，培養基配方蔗糖135g/L，蛋白胨 30g/L，碳酸鈣30g/L，氯化鉀lg/L，硝酸鈉2g/L，硫酸鎂0. 4g/L，磷酸二氫鉀2. 8g/L，Mn2+、 Fe2\ Zn2+各在0. 25g/L，按常規滅菌方式在121 °C下實罐滅菌20min，待培養基溫度降至
后接入菌種，按6% (種子液與發酵液的體積比)的接種量接入發酵罐，攪拌轉速在 400rpm，通風比為1VVM，控制溫度左右開始發酵，從發酵開始到72小時溫度控制在 280C -31°C，從M小時開始流加蔗糖，控制發酵液中葡萄糖量在40g/L，72小時以后控制溫度在25°C左右，并且繼續流加蔗糖控制發酵液中葡萄糖含量20g/L，直至發酵136小時停止加蔗糖，發酵直至發酵液中葡萄糖含量降至0后繼續發酵8小時，發酵過程中pH控制5-6 之間，直至發酵結束大概166小時左右，生物量達到94g/L (干重)，普魯蘭多糖總量為73g/ L，聚蘋果酸總量為51/L。實施例3 使用30L通用式發酵罐配置18L發酵培養基，培養基配方蔗糖200g/L，蛋白胨 50g/L,碳酸鈣40g/L,氯化鉀2g/L，硝酸鈉3g/L，硫酸鎂0. 6g/L，磷酸二氫鉀4g/L，Mn2+、 Fe2\ Zn2+各在0. 4g/L，按常規滅菌方式在121 °C下實罐滅菌20min，待培養基溫度降至
后接入菌種，按10% (種子液與發酵液的體積比)的接種量接入發酵罐，攪拌轉速在 600rpm，通風比為1. 5VVM，控制溫度左右開始發酵，從發酵開始到72小時溫度控制在 280C -31°C，從M小時開始流加蔗糖，控制發酵液中葡萄糖量在50g/L，72小時以后控制溫度在25°C左右，并且繼續流加蔗糖控制發酵液中葡萄糖含量30g/L，直至發酵136小時停止加蔗糖，發酵直至發酵液中葡萄糖含量降至O后繼續發酵8小時，發酵過程中pH控制6-7之間，直至發酵結束大概166小時左右，生物量達到113g/L(干重)，普魯蘭多糖總量為90g/ L，聚蘋果酸總量為65g/L。
權利要求
1.一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，包括如下步驟，發酵罐培養基溫度降至后接入菌種，按3%的接種量接入發酵罐，攪拌轉速在200rpm，通風比為 0. 5VVM，控制溫度-31°C左右開始發酵，從M小時開始流加蔗糖，控制發酵液中葡萄糖量在35g/L，72小時以后控制溫度在25°C左右，繼續流加蔗糖控制發酵液中葡萄糖含量 15g/L，發酵136小時停止加蔗糖，發酵液中葡萄糖含量降至0后繼續發酵8小時，發酵過程中pH控制5-72之間，發酵166小時。
2.如權1所述一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，其特征在于所用菌種為出芽短梗霉或通過誘變和基因工程改造的工程菌。
3.如權1所述一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，其特征在于在發酵液中通過添加蘋果酸、富馬酸、琥珀酸、碳酸鈣來促進產物合成。
4.如權1所述一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，所述發酵培養基組成為蔗糖 80g/L-200g/L，蛋白胨 5g/L-50g/L，碳酸鈣 5g/L_40g/L，氯化鉀 0. lg/L_2g/L， 硝酸鈉 lg/L_3g/L，硫酸鎂 0. lg/L-0. 6g/L，磷酸二氫鉀 0. 05g/L_4g/L，Mn2+、Fe2\ Zn2+ 各在 0.00lg/L-0. 4g/L。
5.如權4所述一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，其特征在于所述發酵培養基組成為蔗糖80g/L，蛋白胨5g/L，碳酸鈣5g/L，氯化鉀0. lg/L，硝酸鈉lg/L，硫酸鎂 0. lg/L,磷酸二氫鉀 0. 05g/L, Mn2+、Fe2+、Zn2+ 各在 0. 00lg/L-0. 4g/L。
全文摘要
本發明公開了一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法。本發明涉及一種通過出芽短梗霉細胞生產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，屬于生物發酵工程技術領域。一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，包括如下步驟，發酵罐培養基溫度降至28℃后接入菌種，按3％的接種量接入發酵罐，攪拌轉速在200rpm，通風比為0.5VVM，控制溫度28℃-31℃左右開始發酵，從24小時開始流加蔗糖，控制發酵液中葡萄糖量在35g/L，72小時以后控制溫度在25℃左右，繼續流加蔗糖控制發酵液中葡萄糖含量15g/L，發酵136小時停止加蔗糖，發酵液中葡萄糖含量降至0后繼續發酵8小時，發酵過程中pH控制5-7.2之間，發酵166小時。提高原料利用率，節約能源，降低了成本。
文檔編號C12P7/62GK102492740SQ20111043005
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者喬長晟, 姜少麗, 敖愛華, 蓋麗豐, 郝華璇 申請人:天津北洋百川生物技術有限公司