專利名稱：具有抑制胃癌細(xì)胞bgc-823增殖功能的基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因及其制備方法。
背景技術(shù)：
胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居我國(guó)惡性腫瘤的前二位。胃癌因缺乏特異性的初篩指標(biāo)以及早期患者癥狀不明顯，因此早期胃癌很難發(fā)現(xiàn)，大部分胃癌患者就診時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期。目前，盡管采用手術(shù)、化療和放療等綜合措施治療胃癌，但總體療效仍欠理想。隨著胃癌分子生物學(xué)研究的不斷深入，針對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲浸潤(rùn)以及血管生成等分子生物靶點(diǎn)提出的分子靶向治療成為胃癌綜合治療的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(signaltransducers and activators of transcription, Stats)家族是一種存在于胞楽并在激活后能夠轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合的蛋白家族，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙重功能。Stat5作為該家族的成員之一，它涉及到由細(xì)胞因子，激素和生長(zhǎng)因子所介導(dǎo)的各類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生理功能的調(diào)控，并與造血功能、免疫反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double stranded RNA,dsRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing ,PTGS)的過(guò)程，通過(guò)反義鏈與正義鏈形成雙鏈RNA，特異性地抑制靶基因的表達(dá)，即通過(guò)人為地弓丨入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA (正義RNA和反義RNA)，從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因。本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該基因在制備抑制胃癌細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因，其特征在于該基因?yàn)镾EQ NO. I所示的堿基序列。一種制備上述的具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為根據(jù)SilenCircle RNAi轉(zhuǎn)錄試劑盒中載體設(shè)計(jì)的具體要求,設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于Stat5基因中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC核心序列的shRNA的兩條部分互補(bǔ)的寡核苷酸序列進(jìn)行合成，即得到具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因；所述的兩條互補(bǔ)寡核苷酸序列為
Sense 5’-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CATATA ACG CCT-3，
Anti-sense: 5’-AM MG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC MG AAT GCT GGCCAT ATA ACG CCG -3
其中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC為與Stat5b基因進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)的序列。上述的具有抑制胃癌細(xì)胞增殖功能的基因在制備抑制胃癌細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)對(duì)與胃癌細(xì)胞BGC-823增殖有關(guān)聯(lián)的基因的RNAi，并應(yīng)用胃癌細(xì)胞BGC-823模型研究其對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的抑制作用。為RNAi在胃癌治療應(yīng)用提供了一種新方法。


圖I為shRNA的寡核苷酸序列引物和pSil—質(zhì)粒的連接圖。圖2為實(shí)驗(yàn)分組與檢測(cè)指標(biāo)未轉(zhuǎn)染對(duì)照組數(shù)據(jù)對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式I.胃癌細(xì)胞BGC-823的培養(yǎng)將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基吸出，加2ml無(wú)菌I XD-Hanks洗滌兩次，棄去洗滌液，加0. 25%胰蛋白酶1-1. 5 ml,消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面，消化時(shí)間約1-3分鐘。消化后在倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞皺縮變圓，邊緣折光性增強(qiáng)，在細(xì)胞尚未脫落時(shí)倒掉消化液，立即加入血清或含血清的培養(yǎng)基，終止消化。將培養(yǎng)瓶壁上的細(xì)胞吹打下來(lái)，1000 rpm/分鐘，離心5分鐘，棄去培養(yǎng)基，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液6ml，吹打混勻，視細(xì)胞密度以1:2或1:3分皿培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶且形成致密單層時(shí)即可再傳代。2. Stat5b-RNAi 質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染根據(jù) SilenCircle TM RNAi TranscriptionKit中載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于Stat5b基因的干擾堿基，各為57bp，并進(jìn)行合成。Stat5b-RNAi對(duì)應(yīng)的序列為
SEQ NO. I:
Sense 5’-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CATATA ACG CCT-3，
Anti-sense: 5’-AM MG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC MG AAT GCT GGCCAT ATA ACG CCG -3，
根據(jù)SilenCircle RNAi Transcription Kit中載體設(shè)計(jì)的具體要求,將設(shè)計(jì)的shRNA和SilenCircle質(zhì)粒連接，參見(jiàn)圖1，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC-823。圖I為SilenCircle 質(zhì)粒原理的圖解，它使用基于RNA的U6聚合酶III啟動(dòng)子和優(yōu)化的終止子，從而在靶細(xì)胞內(nèi)可以精確地形成小分子干擾RNA(shRNA)。shRNA的表達(dá)質(zhì)粒是一個(gè)預(yù)切好的備用載體。通過(guò)質(zhì)粒上攜帶的篩選標(biāo)記，進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染，可建立shRNA表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。通過(guò)兩個(gè)Silencircle 的質(zhì)粒各自與正義的DNA插入片段及反義的DNA插入片段相連接，便可介導(dǎo)shRNA的產(chǎn)生。或者單個(gè)質(zhì)粒與一個(gè)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA插入片段相連接，也可介導(dǎo)shRNA的產(chǎn)生。無(wú)論哪種方法，首先必須合成兩段互補(bǔ)的DNA片段。而U6啟動(dòng)子則控制著shRNA的生成(參附圖)。對(duì)于需要進(jìn)行干擾的目的基因，選擇一段靶序列為A2GN17C的DNA片段(祀序列的正義序列)，其GC含量接近50%。3. Stat5b-RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，在含有5ml無(wú)抗生素的RPMI 1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基的60-mm培養(yǎng)皿里種上2 X IO7個(gè)胃癌細(xì)胞BGC-823。然后用500 U I無(wú)血清的培養(yǎng)基(RPMI1640)溶解 8. 0 ii g 的 Stat5b-RNAi 表達(dá)載體，用 500 yl 培養(yǎng)基(RPMI1640)溶解Lipofectamine 2000 (20 U I)，輕輕地混勻，再室溫孵育5分鐘。孵育5分鐘后，這個(gè)shRNA表達(dá)載體與LipofectamineTM2000充分結(jié)合，然后將它們輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，這樣做是為了形成Lipofectamine 2000的復(fù)合物。DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物被加入到60mm培養(yǎng)皿里，之后細(xì)胞在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6小時(shí)，換上正常細(xì)胞培養(yǎng)液。4.實(shí)驗(yàn)分組與檢測(cè)指標(biāo)未轉(zhuǎn)染對(duì)照組組未經(jīng)轉(zhuǎn)染Stat5b_RNAi的人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞；空載體對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞；RNAi組轉(zhuǎn)染Stat5b-RNAi的人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞。胃癌細(xì)胞BGC-823增殖在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將CCK-8加入細(xì)胞培養(yǎng)液后l h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖情況。結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖2，圖2結(jié)果RNAi組胃癌細(xì)胞BGC-823在48h以后胃癌細(xì)胞增殖明顯少于對(duì)照組胃癌細(xì)胞BGC-823 0°〈O. 05)。說(shuō)明在胃癌細(xì)胞BGC-823中Stat5b_RNAi在48h后可明顯胃癌細(xì)胞增殖。
權(quán)利要求
1.一種具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因，其特征在于該基因?yàn)镾EQ NO. I所不的喊基序列。
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為根據(jù)SilenCircle RNAi轉(zhuǎn)錄試劑盒中載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于Stat5基因中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC核心序列的shRNA的兩條部分互補(bǔ)的寡核苷酸序列進(jìn)行合成，即得到具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因；所述的兩條互補(bǔ)寡核苷酸序列為Sense 5’-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CATATA ACG CCT-3，Anti-sense: 5’ -MA AAG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC MG MT GCT GGCCAT ATA ACG CCG -3， 其中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC為與Stat5b基因進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)的序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有抑制胃癌細(xì)胞增殖功能的基因在制備抑制胃癌細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因及其制備方法。該基因是根據(jù)胃癌細(xì)胞BGC-823設(shè)計(jì)出的Stat5b-shRNA的兩條部分互補(bǔ)核苷酸序列，再將該兩條互補(bǔ)核苷酸序列和市售SilenCircleTMRNAi轉(zhuǎn)錄試劑盒中的SilenCircle質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到具有抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖功能的基因。本發(fā)明設(shè)計(jì)對(duì)與胃癌細(xì)胞BGC-823增殖有關(guān)聯(lián)的基因的RNAi，并應(yīng)用胃癌細(xì)胞BGC-823模型研究其對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的抑制作用。為RNAi在胃癌治療應(yīng)用提供了一種新方法。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102653762SQ201110431938
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者余抗抗, 宋一超, 朱靜嬿, 李哲, 武岳, 陳付學(xué), 陳媛媛 申請(qǐng)人:上海大學(xué)